专利名称：靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法
技术领域：
本发明属于基因重组及生物分子材料制备技术领域，涉及靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法。
背景技术：
亲合体是通过定向分子进化技术筛选获得的一类新型的独特的蛋白结合配体，其作用类似于抗体，但却拥有比抗体更加优越的性质:亲合体的结合位点与抗体相似且亲和力强；分子量小，不易在体内诱发免疫应答，组织穿透性好；性质十分稳定，可人工合成。亲合体的这些独特优势引起了科研工作者的关注，目前已发现的亲合体主要有Zhee2和Zkfk两类。研究人员利用Zhek2作为HER2高表达肿瘤疾病(宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等)的特定靶向配体，利用Z_亲和体作为EGFR高表达肿瘤疾病(皮肤癌等)的特定靶向配体，已展开了较多的研究，探索其各种潜在应用，包括肿瘤靶向成像和靶向治疗。有研究报道将ZHEK2:342亲合体与量子点或磁性氧化铁纳米颗粒连接，二者均在卵巢癌中实现了高的特定靶向能力。利用2_:19(17与64&1相偶联制成PET造影剂在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株中可实现很强的对比增强效果。以上研究结果表明这两种亲合体ZHEK2:342、Z_■可作为高亲和力的靶向分子与目标分子或探针连接，实现靶向功能化。随着现代纳米生物医学技术的发展，基于纳米技术的靶向性输送体系有望实现传统肿瘤诊断和治疗方法所无法企及的高效、低毒的效果，成为肿瘤诊断和治疗的有效手段之一。靶向分子是构建靶向性输送体系的重要因素，亲合体的独特优势决定了其可作为高亲和力祀向分子连接到纳米载体上，实现主动祀向。目前，将亲合体Z 臓:342、Zegfe:1907作为靶向分子进行靶向肿瘤能力的研究中，亲合体主要是通过化学合成获得的(1.0rlova A, et al.Synthetic affibodymolecules:A novel class of affinity ligands for molecular imaging ofHER2-expressing malignant tumors.Cancer Research.2007;67:2178-2186 ；2.GaoJHjet al.Affibody-based nanoprobes for HER2_expressing cell and tumorimaging.Biomaterials.2011;32:2141-2148 ；3.Tolmachev V，et al.Tumor TargetingUsing Affibody Molecules:1nterplay of Affinity, Target Expression Level,andBinding Site Composition.Journal of Nuclear Medicine.2012;53:953-960 ;4.Miao Z，et al.Smal 1-Animal PET Imaging of Human Epidermal GrowthFactor Receptor Positive Tumor with a64Cu Labeled Affibody Protein.Bioconjugate Chemistry.2010 ; 21: 947-954 ；5.Hoppmann S，et al.177Lu - D03A -HSA - Zegfe.1907 !characterization as a potential radiopharmaceutical forradionuclide therapy of EGFR-expressing head and neck carcinomas.Journal ofBiological Inorganic Chemistry.2012; 17: 709-718.)。但化学合成亲合体的方法成本较高，且杂质多，不易纯化。也有研究者通过构建表达载体在大肠杆菌中实现亲合体 Zhee2:342 矛口 ZEGFR:1907 的表达(6.0rlova A, et al.Tumor Imaging using a pi comolaraffinity HER2 binding affibody molecule.Cancer Research.2006;66:4339-4348 ;7.Gopal V，et al.Structure prediction and validation of an affibodyengineered for cell-specific nucleic acid targeting.Systems and syntheticbiology.2010;4:293-297 ；8.Govindarajan S，et al.Targeting human epidermalgrowth factor receptor 2 by a cell-penetrating peptide-affibody bioconjugate.Biomaterials.2012;33:2570-2582 ；9.Tolmachev V，et al.Affibody Molecules forEpidermal Growth Factor Receptor Targeting In Vivo:Aspects of Dimerization andLabeling Chemistry.Journal of Nuclear Medicine.2009; 50:274-283.)。但由于其中亲合体的编码序列未经优化，产物表达量较低，且产物与目标分子或探针的连接位点较少，不易实现祀向功能化。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法。用于表达和纯化重组靶向亲合体Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列为:GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.1)其中，中间下划线部分为亲合体ZHEK2:342的编码序列。用于表达和纯化重组靶向亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的核苷酸序列为: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.2)其中，中间下划线部分为亲合体Ζ_.的编码序列。用于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的核苷酸序列顺序依次为=BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列、半胱氨酸密码子、亲合体编码序列、6Hi s-Tag序列、终止密码子和XhoI酶切位点。该重组序列经密码子优化后可在对应宿主中实现高效表达和纯化，同时，加入的半胱氨酸和 组氨酸可提高重组亲合体与输送载体的连接性能。所述用于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的构建方法如下:I)在亲合体编码序列的基础上设计重组蛋白的核苷酸编码序列:序列前端依次加ABamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列和半胱氨酸密码子，序列中间为亲合体编码序列，序列后端依次加入6His-Tag纯化标签序列、终止密码子和Xho I酶切位点；2)对重组编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行碱基优化；3)碱基优化后的重组基因片段由人工合成获得，再将重组片段进行BamH 1、Xho I双酶切，酶切产物纯化后通过连接酶连接到表达质粒上，构建重组表达质粒，酶切等方法验证质粒构建的正确性，以备用于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白。所述用于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的核苷酸序列，是对编码序列进行了重组设计的；并对编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行了碱基优化。如此，可使重组未合体在宿主中闻效表达，同时实现闻纯化效率和闻性能的目的。在重组序列中加入BamH I酶切位点和Xho I酶切位点，有利于重组亲合体核苷酸序列与表达型质粒的连接，构建重组表达质粒。在重组序列中加入肠激酶酶切位点序列和终止密码子，有利于实现重组亲合体的分离纯化并保证表达产物的准确性。在重组序列中加入半胱氨酸密码子，有利于亲合体通过半胱氨酸残基中的巯基与目标分子或探针进行连接，实现输送载体的靶向功能化。在重组序列中加入6His_Tag纯化标签序列，便于重组亲合体的分离纯化，提高纯化效率；并可利用6His_Tag通过镍离子的配位作用实现重组亲合体与目标分子或探针的连接功能化。所述靶向亲合体重组蛋白的表达和纯化方法，包括以下步骤:I)将已构建的重组质粒转化到密码子偏好对应的宿主中，加入诱导剂诱导重组亲合体的表达，验证重组蛋白是否表达；在步骤I)中，所述转化的方法可采用电转化等方法；所述验证的方法可通过蛋白质电泳等方法；所述诱导剂可采用异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等诱导剂。2)收集全部表达产物，经镍柱亲和层析初步纯化得到融合蛋白，用肠激酶酶切融合蛋白，再用凝胶柱层析进一步分离纯化，最后得到高纯度的重组亲合体。本发明提供靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法，降低亲合体的生产成本并提高其性能。本发明提供的重组核苷酸序列是依据表达宿主的密码子偏好性进行了喊基优化的，可实现未合体的 闻效表达。本发明提供的重组亲合体的核苷酸序列，是在亲合体编码序列的基础上设计的。亲合体编码序列前端依次添加BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列和半胱氨酸密码子；亲合体编码序列后端依次添加6His-Tag纯化标签序列、终止密码子和Xho I酶切位点。重组序列中添加BamH I酶切位点和Xho I酶切位点，有利于重组片段与表达型质粒的连接，构建重组表达质粒。重组序列中添加肠激酶酶切位点序列和终止密码子，有利于实现重组亲合体的分离纯化并保证表达产物的准确性。重组序列中加入半胱氨酸密码子，有利于亲合体通过半胱氨酸残基中的巯基与目标分子或探针进行连接，实现输送载体的靶向功能化。重组序列中加入6His-Tag纯化标签序列，便于重组亲合体的分离纯化，提高纯化效率；同时可利用6His-Tag通过镍离子的配位作用实现重组亲合体与目标分子或探针的连接功能化。因此，在亲合体编码序列的基础上添加以上序列可实现重组亲合体的高效表达及分离纯化，有效保证其生物活性同时增加其与目标分子或探针的连接位点，易于实现靶向性纳米输送体系的构建，提高了重组亲合体的性能。本发明提出的靶向亲合体重组蛋白的构建和表达纯化方法，是在亲合体编码序列基础上加入了 BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点序列、半胱氨酸密码子、6His_Tag纯化标签序列、终止密码子和Xho I酶切位点，并对该重组序列依据表达宿主的密码子偏好性进行碱基优化，可实现重组亲合体的高效表达和快速纯化，极大降低了生产成本；同时序列中添加的半胱氨酸和组氨酸可增加重组亲合体与运输载体的连接位点，提高其性能。本发明可实现靶向亲合体的高效表达纯化，降低生产成本，同时提高其性能，有利于对亲合体深入开展靶向功能的研究和应用，为构建靶向性纳米输送载体开辟新的途径。本发明对重组亲合体的编码序列进行了优化设计，在序列中添加肠激酶酶切位点编码序列、半胱氨酸密码子、6His_Tag纯化标签序列和终止密码子，增加重组亲合体与纳米载体的连接位点，并保证表达产物的准确性，提高纯化效率；同时对编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行了碱基优化，可使重组亲合体在宿主中实现高效表达。
图1为本发明实施例1中的Z臓:342重组亲合体DNA片段及重组质粒pET32a(+) -Cys-ZHEE2:342 -6His 酶切验证图。在图1 中，I 为 Zhe懸2，2 为 2000bp DNA Marker,3 为 pET32a (+)质粒 BamH I 单酶切产物，4 为 pET32a (+) -Cys-ZHEK2:342 -6His 重组质粒 BamHI单酶切产物，5为Ikb DNA Marker。图2为本发明实施例1的pET32a(+)-CyS-Zhek2:342_6His重组表达质粒的结构示意图。图3为本发明实施例1中CyS-ZHEK2:342 -6HiS重组亲合体在大肠杆菌中高效表达的Tricine SDS-PAGE分析及分步纯化过程。在图3中，I代表重组菌BL21 (DE3)-pET32a-Cys-ZHEE2:342 -6His的超声破碎上清液，2代表镍柱亲和层析初步纯化后的融合蛋白Trx-Cys-ZHEE2:342 -6His, 3代表Trx-Cys_ZHEK2:342 -6His的肠激酶酶切产物,4代表凝胶柱层析纯化后的重组亲合体CyS-ZHEK2:342 -6HiS，5代表蛋白质分子量标准。图4为实施例1获得的重组亲合体CyS-ZHEK2:342-6HiS的质谱结果图。图5为本发明实施例2中的Z_:19(l7重组亲合体DNA片段及重组质粒pET32a (+) -Cys-Z腿:19(l7-6His 酶切验证图。在图 5 中，I 为 Zegfe:1907，2 为 2000bp DNA Marker,3 为 pET32a (+)质粒 BamH I 单酶切产物，4 为 pET32a (+) -Cys-ZEGFE:1907-6Hi s 重组质粒 BamHI单酶切产物，5为Ikb D NA Marker。图6为本发明实施例2的pET32a (+) -Cys-ZEGFE:1907-6His重组表达质粒的结构示意图。图7为本发明实施例2中CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS重组亲合体在大肠杆菌中高效表达的Tricine SDS-PAGE分析及分步纯化过程。在图7中，I代表蛋白质分子量标准，2代表对照菌BL21 (DE3)的超声破碎上清液，3代表重组菌BL21 (DE3) -pET32a-Cys-ZEGFR:1907-6His的超声破碎上清液，4代表镍柱亲和层析初步纯化后的融合蛋白Trx-CyS-Zkfk:19(l7-6HiS，5代表Trx-CyS-Zkfk:19(l7-6His的肠激酶酶切产物，6代表凝胶柱层析纯化后的重组亲合体Cy S-Zegfe.1907_6Hi s。图8为本发明实施例2获得的重组亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的质谱结果图。图9为重组亲合体核苷酸序列示意图。
具体实施例方式下面通过实施例和附图对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明的保护范围。
实施例1:CyS-ZHEK2:342 -6HiS重组亲合体的构建及其表达和纯化方法(I) CyS-Zhee2.342_6His重组亲合体表达质粒的构建首先,设计重组亲合体Cys-ZHEK2:342 -6His的核苷酸序列。在亲合体Zhek2:342的碱基序列前端加入 24 个碱基:GGATCCGACGATGACGACAAATGC(SEQ:1D:N0.3)。在亲合体 Zhek2:342 的碱基序列后端加入 30 个碱基:CATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.4)。说明:在SEQ:1D: N0.3 中，GGATCC 为 BamH I 酶切位点，GACGATGACGACAAA 编码肠激酶酶切位点DDDDK，TGC编码半胱氨酸Cys。在SEQ:1D: N0.4中，CATCACCATCACCATCAT编码6His-Tag纯化标签，TAATAG为两个终止密码子，CTCGAG为Xho I酶切位点。其次，依据大肠杆菌的密码子偏好性对重组亲合体CyS-ZHEK2:342-6HiS的核苷酸序列进行碱基优化，优化后重组核苷 酸序列如下:GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.1)说明:中间下划线部分为亲合体Z順:342的编码序列。重组亲合体CyS-ZHEK2:342 -6HiS碱基优化后的基因片段由人工合成获得，将此基因片段与pET32a(+)或pET22b(+)等表达型质粒分别进行BamH I, Xho I双酶切反应。反应条件为:37°C水浴，酶切过夜。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后割胶回收得到，用T4连接酶将双酶切后的重组基因片段与质粒片段连接，构建重组亲合体表达质粒，重组质粒通过酶切结果验证。重组质粒pET32a-Cys-ZHEK2:342-6His的酶切结果见图1,证明重组质粒构建正确。重组质粒pET32a-Cys-ZHEK2:342 -6His的结构示意图见图2。(2)利用大肠杆菌高效表达重组亲合体CyS-ZHEK2:342 -6HiS制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用氯化钙或电穿孔等转化方法将已构建的重组表达质粒转化到BL21(DE3)中，诱导表达重组亲合体。表达具体步骤如下:活化菌体，分离单菌落，接种至含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，200rpm前培养12h。以1%接种量将前培养菌液接种于500mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基扩大培养，37 V，200rpm振荡培养3 6h后，加入IPTG (0.5mM) 37°C诱导4 6h。由于pET32a-CyS-ZHEK2:342 -6HiS的表达产物为胞内可溶性蛋白，因此可通过超声破碎细胞获得表达产物。4°C，10000rpm，5min收集菌体。100W超声下破碎细胞，破碎时间为IOmin (工作10s，停10s)。4°C，12000rpm，IOmin收集超声破碎上清液，获得胞内可溶性表达产物，用Tricine SDS-PAGE电泳验证表达产物。(3)重组亲合体Cys-ZHEK2:342 -6His的纯化方法重组大肠杆菌BL21 (DE3) -pET32a-Cys-ZHEK2:342 -6His 的表达产物含有 6His_tag 纯化标签，因此用快速蛋白质液相层析系统(FPLC)结合镍柱亲和层析可初步纯化融合蛋白Trx-Cys-ZHEE2:342 -6His,简要步骤如下:超声破碎上清液用0.22 μ m滤膜过滤后即为上样样品；先依次用5个柱体积的蒸馏水和结合液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH7.4)分别冲洗并平衡柱子(GE，HisTrap HP预装柱)，流速为5mL/min ;再将样品打入上样环；用5个柱体积的结合液漂洗柱子至UV280nm基线水平，使目标蛋白与柱子结合，杂蛋白随结合液流出；随后用洗脱液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，200mM咪唑，pH7.4)进行洗脱，收集洗脱峰，得到含有重组亲合体的融合蛋白Trx-Cys-ZHEK2:342-6His。将融合蛋白Trx-CyS-ZHEK2:342 -6HiS置于透析袋中，于4°C下，用肠激酶酶切缓冲液透析；透析完成后，再用肠激酶rEK酶切12 24h，使融合蛋白前端Trx被完全切除；最后用Superdex75 10/300GL凝胶柱层析(流动相为0.0lM PBS缓冲液,流速为1.5mL/min)分离得到目标产物:重组亲合体CyS-ZHEK2:342 -6HiS。蛋白含量采用BCA方法测定，最后产物纯度约为97.8%，回收效率1.0mg/mL。将最终纯化产物用低温真空冷冻干燥获得重组亲合体Cys-ZHEE2:342 -6His的冻干粉，_20°C储存备用。重组亲合体Cys-ZHEK2:342 -6His的纯化过程及最终纯化产物的Tricine SDS-PAGE电泳验证见图3。(4)表达产物重组亲合体Cys-ZHEK2:342 -6His的鉴定取少量Cys-ZHEK2:342 -6His纯化产物置于透析袋中，用蒸馏水透析；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOF)测定产物的精确分子量。取2 μ L透析后样品与I μ L基质混匀后上样，测得纯化产物的分子量为7.648kDa (图4)，与Cys-ZHEK2:342 -6His的理论值
7.631kDa，误差0.2%，表明构建的Cys-ZHEK2:342 -6His重组亲合体正确。实施例2:Cys-ZEGFE:1907-6His重组亲合体的构建及其表达和纯化方法(I) Cys-ZEGFE:1907-6His重组亲合体表达质粒的构建首先，设计重组亲合体Cys-ZEeFK:1907-6His的核苷酸序列。在亲合体Zkfk:1907的碱基序列前端加入 24 个碱基:GGATCCGATGACGATGACAAGTGC(SEQ:1D:N0.5)。在亲合体 Z_:19(l7的碱基序列后端加入 30 个碱基:CATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.4)。说明:在SEQ:1D: N0.5 中，GGATCC 为 BamH I 酶切位点，GATGACGATGACAAG 编码肠激酶酶切位点DDDDK，TGC编码半胱氨酸Cys。在SEQ:1D: N0.4中，CATCACCATCACCATCAT编码6His-Tag纯化标签，TAATAG为两个终止密码子，CTCGAG为Xho I酶切位点。其次，依据大肠杆菌的密码子偏好性对重组亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的核苷酸序列进行碱基优化。优化后重组核苷酸序列如下:GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.2)说明:中间下划线部分为亲合体Zkfot的编码序列。重组亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS碱基优化后的基因片段由人工合成获得，将此基因片段与pET32a(+)或pET22b(+)等表达型质粒分别进行BamH I, Xho I双酶切反应。反应条件为:37°C水浴，酶切过夜。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后割胶回收得到，用T4连接酶将双酶切后的重组基因片段与质粒片段连接，构建重组亲合体表达质粒，重组质粒通过酶切结果验证。重组质粒pET32a-Cys-ZEeFK:19Q7-6His的酶切结果见图5，证明重组质粒构建正确。重组质粒pET32a-Cys-Z EeFK:19(l7-6His的结构示意图见图6。(2)利用大肠杆菌表达重组亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用氯化钙或电穿孔等转化方法将已构建的重组表达质粒转化到BL21(DE3)中，诱导表达重组亲合体。表达具体步骤如下:活化菌体，分离单菌落，接种至含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，200rpm前培养12h。以I %接种量将前培养菌液接种于500mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基扩大培养，37°C，200rpm振荡培养:T6h后，加入IPTG(0.5mM) 37°C诱导4 6h。由于pET32a-Cys-ZEGFE:1907-6His的表达产物为胞内可溶性蛋白，因此可通过超声破碎细胞获得表达产物。4°C，10000rpm，5min收集菌体。IOOW超声下破碎细胞，破碎时间为IOmin (工作10s，停10s)。4°C，12000rpm，IOmin收集超声破碎上清液，获得胞内可溶性表达产物，用Tricine SDS-PAGE电泳验证表达产物。(3)重组亲合体CyS-Zegfk:19Q7-6His的纯化方法重组大肠杆菌BL21 (DE3)-pET32a_CyS-Zkfk:19Q7_6His 的表达产物含有 6His_tag纯化标签，因此用快速蛋白质液相层析系统(FPLC)结合镍柱亲和层析可初步纯化融合蛋白Trx-CyS-ZE(；FK:19(l7-6HiS，简要步骤如下:超声破碎上清液用0.22 μ m滤膜过滤后即为上样样品；先依次用5个柱体积的蒸馏水和结合液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH7.4)分别冲洗并平衡柱子(GE，HisTrap HP预装柱)，流速为5mL/min ;再将样品打入上样环；用5个柱体积的结合液漂洗柱子至UV280nm基线水平，使目标蛋白与柱子结合，杂蛋白随结合液流出；随后用洗脱液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，200mM咪唑，pH7.4)进行洗脱，收集洗脱峰，得到含有重组亲合体的融合蛋白Trx-Cys-ZEeFK:19(l7-6His。将融合蛋白TrX-CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS置于透析袋中，于4°C下，用肠激酶酶切缓冲液透析；透析完成后，再用肠激酶rEK酶切12 24h，使融合蛋白前端Trx被完全切除；最后用Superdex7510/300GL凝胶柱层析(流动相为0.0lM PBS缓冲液,流速为1.5mL/min)分离得到目标产物:重组亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS。蛋白含量采用BCA方法测定，最后产物纯度约为98.3%，回收效率1.3mg/mL。将最终纯化产物用低温真空冷冻干燥获得重组亲合体Cys-Zegfe:1907-6His的冻干粉，_20°C储存备用。重组亲合体Cys-Z腿:19(l7-6His的纯化过程及最终纯化产物的Tricine SDS-PAGE电泳验证见图7。
(4)表达产物重组亲合体CyS-ZEGFK:19Q7-6HiS的鉴定取少量Cys-Z_:19(l7-6His纯化产物置于透析袋中，用蒸馏水透析；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)测定产物的精确分子量。取2 μ L透析后样品与I μ L基质混匀后上样，测得纯化产物的分子量为7.493kDa (图8)，与CyS-ZEeFK:19(l7-6His的理论值7.470kDa，误差0.3%，表明构建的Cys-ZEeFK:19(l7-6His重组亲合体正确。重组亲合体核苷酸序列示意图如图9所示。本发明提供的重组亲合体编码序列中包含BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列、半胱氨酸密码子、亲合体编码序列、6His-Tag序列、终止密码子和Xho I酶切位点，并依据表达宿主的密码子偏好性对序列进行了碱基优化，有利于重组亲合体的高效表达、分离纯化及后续与目标分子或探针的连接功能化，实现靶向的目的。本发明还提供了重组亲合体的分离纯化方法，此方法简单易操作，成本较低，且产物纯度高、活性强，易于放大生产。
权利要求
1.关于表达和纯化重组靶向亲合体Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列为: GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 记为 SEQ:1D: N0.1 ； 其中，中间下划线部分为亲合体ZHER2:342的编码序列。
2.关于表达和纯化重组靶向亲合体CyS-ZE(；FK:19(l7-6HiS的核苷酸序列为: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 记为 SEQ:1D: N0 .2 ； 其中，中间下划线部分为亲合体ZEeFK:19(l7的编码序列。
3.关于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于其顺序依次为:BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列、半胱氨酸密码子、亲合体编码序列、6His-Tag序列、终止密码子和Xho I酶切位点。
4.关于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的构建方法，其特征在于包括以下步骤: O在亲合体编码序列的基础上设计重组蛋白的核苷酸编码序列:序列前端依次加入BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列和半胱氨酸密码子，序列中间为亲合体编码序列，序列后端依次加入6His-Tag纯化标签序列、终止密码子和Xho I酶切位点； 2)对重组编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行碱基优化； 3)碱基优化后的重组基因片段由人工合成获得，再将重组片段进行BamH1、Xho I双酶切，酶切产物纯化后通过连接酶连接到表达质粒上，构建重组表达质粒。
5.向亲合体重组蛋白的表达和纯化方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将已构建的重组质粒转化到密码子偏好对应的宿主中，加入诱导剂诱导重组亲合体的表达，验证重组蛋白是否表达； 2)收集全部表达产物，经镍柱亲和层析初步纯化得到融合蛋白，用肠激酶酶切融合蛋白，再用凝胶柱层析进一步分离纯化，最后得到高纯度的重组亲合体。
6.按权利要求5所述靶向亲合体重组蛋白的表达和纯化方法，其特征在于在步骤I)中，所述转化的方法采用电转化方法。
7.按权利要求5所述靶向亲合体重组蛋白的表达和纯化方法，其特征在于在步骤I)中，所述验证的方法是通过蛋白质电泳方法。
8.按权利要求5所述靶向亲合体重组蛋白的表达和纯化方法，其特征在于在步骤I)中，所述诱导剂采用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
全文摘要
靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法，属于基因重组及生物分子材料制备技术领域。构建方法在亲合体编码序列的基础上设计重组蛋白的核苷酸编码序列；对重组编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行碱基优化；碱基优化后的重组基因片段由人工合成获得，再将重组片段双酶切，酶切产物纯化后连接到表达质粒上，构建重组表达质粒。表达和纯化方法将已构建的重组质粒转化到密码子偏好对应的宿主中，加入诱导剂诱导重组亲合体的表达，验证重组蛋白是否表达；收集全部表达产物，经镍柱亲和层析初步纯化得到融合蛋白，用肠激酶酶切融合蛋白，再用凝胶柱层析进一步分离纯化，最后得到高纯度的重组亲合体。
文档编号C12N15/63GK103088019SQ201310027350
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者池小琴, 王效民, 尹震宇, 高锦豪, 朱祥龙, 胡娟 申请人:厦门大学附属中山医院