专利名称：一种产s-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种产基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
3-羟基丁酮又名甲基乙酰甲醇、乙偶姻，可作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等众多领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。3-羟基丁酮存在2个旋光异构体，分别为R型和S型3-羟基丁酮，S-3-羟基丁酮可用于合成4-氯-4，5- 二甲基-1，3 二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是合成青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物重要的医药中间体；S-3-羟基丁酮还可以用于合成抗菌药伦氨苄西林盐酸盐的中间体一4-溴甲基5-甲基-1，3-二氧戊环-2-酮。近年来，随着人们对S-3-羟基丁酮需求的不断增长，有关S-3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。目前S-3-羟基丁酮的合成方法主要有两种一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在反应步骤多，还需手性拆分，工艺繁琐，导致成本高、收率底，环境污染比较严重，且原料大都是不可再生的化石资源一石油，原料来源受到限制。生物合成法包括酶法和微生物发酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇为原料，在酶的催化特异性作用下生产S-3-羟基丁酮，该方法转化率和光学纯度均能达到100%，但是和化学法一样原料来源受到限制，且产量偏低，难以大批量制备S-3-羟基丁酮。目前用于3-羟基丁酮生产及研究的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebisella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及沙雷氏菌属(Serratia)等，但是尚未发现用于生产光学纯S_3_羟基丁酮的野生菌株。目前文献报道的利用基因工程手段构建质粒转化大肠杆菌得到重组菌生产S-3-羟基丁酮，研究者将Bacillus subtilis 168中的2，3-丁二醇脱氧酶基因(Bud A)导入大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)中，构建重组菌E. coli BL21-Bud A，并以meso-2，3-丁二醇为底物利用该重组菌转化制备S-3-羟基丁酮，虽然获得成功，产量在36. 7g/L左右，但是该方法依然存在底物meso-2，3-丁二醇价格昂贵且难以获得，并存在重组质粒不稳定的问题，产量低，成本高等缺陷。(Xiao Zijun, Plos 0ne5 (2010,1) 1-6)
发明内容
发明目的为了克服现有技术中存在的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法。本发明还最后要解决的技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的应用。技术方案为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一种产S-3-轻基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus polymyxaCGMCC 3044-Bud A_，该工程菌是通过下列方法构建得到的利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中扩增出 2，3_ 丁二醇脱氧酶基因 Bud A,5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重组粘粒转化 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介导下与paenibacillus polymyxa CGMCC 3044发生同源双交换,得到重组的多粘类芽抱杆菌，即产S-3-轻基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'其中，SuperCos_l/pIJ790中 SuperCos-1 为粘粒；质粒 pIJ790 携带 λ Red 同源重组序列、oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK等序列。该基因工程菌通过下列方法构建得到(I)基因Bud A的克隆根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定`,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044 的 2，3- 丁二醇脱氢酶基因(Bud A)；(2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II”的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂
II;根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II ；(3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790-Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'其中该方法包括下列步骤利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044中扩增出2，3_ 丁二醇脱氢酶基因Bud A，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带λ Red同源重组序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II ”序列的重组粘粒SuperCos_l/pIJ790,重组粘粒转化paenibacillus polymyxaCGMCC 3044，并在λ Red介导下与宿主菌发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，SP产 S-3-轻基丁酮基因工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'其中，上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法包括下列步骤(I)基因BudA的克隆根据Genebank公布的多粘类芽抱杆菌paenibacillus polymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044 的 2，3- 丁二醇脱氢酶基因(Bud A)；(2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II”的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂
II;根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II ；(3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790-Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'上述的产S_3_ 轻基丁酮基因工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA_在生产S-3-羟基丁酮中的应用。上述应用，将构建的基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-接种于含碳源、氮源和无机盐的无菌培养基中进行培养，发酵生产光学纯S-3-羟基丁酮，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉粗提液。上述的应用，该基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液为底物生产S-3-羟基丁酮，具体生产工艺为(1)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)种子培养基(NH4)2HPO4O. 5-2. 0g/L,KCl 0. 10-0. 3g/L,MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L,酵母膏0. 1-0. 3g/L，葡萄糖2. 0-8. 0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉3. 0-1. 0g/L,阿泊拉霉素 20-50 μ g/mL ；种子培养1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30_37oC，摇床转速120-200rpm，培养 12_36h ；(3)发酵培养培养基组成菊芋菊粉粗提液含菊粉20. 0-120. 0g/L, (NH4)2HPO40. 5-2. 0g/L, KCl 0. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母膏 3· 0-8. 0g/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ；培养条件接种量10v/v%，发酵温度30_37oC，pH6. 0-8. 0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h,控制转速240rpm,发酵24h后,控制转速120rpm,维持微氧环境发酵。其中，本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株为能产菊粉酶的多粘芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa) CGMCC No. 3044,目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，登记入册的编号是CGMCC No. 3044，保藏日期是2009年4月29日。以此菌作为出发菌株。该菌株相应的专利的申请日为2009年6月I日，专利号为ZL200910026807.1。有益效果本发明在于提供一种新型基因工程菌，用于发酵产S-3-羟基丁酮，该菌在微氧条件下直接利用未经处理 的菊芋菊粉粗提液高效发酵产S-3-羟基丁酮，突破了传统发酵难以获得光学纯S-3-羟基丁酮和低效率生产S-3-羟基丁酮的局限。与原始多粘类芽孢杆菌相比，重组菌株生产3-羟基丁酮的能力得到显著提高，提高了对底物菊粉的利用能力和转化率，且获得的是附加值更高的光学纯S-3-羟基丁酮。与目前文献所报道利用基因工程手段构建重组微生物生产S-3-羟基丁酮方法相比，不仅重组菌产S-3-羟基丁酮稳定性高，而且产物浓度也较高，且底物是价格低、容易获得的能源植物菊芋菊粉粗提液，另外还可在发酵过程中添加微量的阿泊拉霉素，达到抑制部分细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象，提高产物质量，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产S-3-羟基丁酮奠定了良好的基础。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 :菊芋菊粉粗提液的制备方法新鲜的菊芋洗净去皮，热烫灭酶(100°C，15min)后切成薄片，70°C下鼓风干燥，然后粉碎过80目筛制得菊芋粗粉，冰箱保存备用。按照1:6的比例称取菊芋粗粉放入水中搅拌均匀后，70°C水浴加热浸提4h，用石灰乳调节pH为9，然后80°C水浴保温lh，用纱布过滤后即可得菊芋菊粉粗提液。实施例2 :基因Bud A的克隆根据Genebank 公布的多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa ATCC 12321 中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应；PCR 反应条件94° C 变性 5min，94° C30s ；56° C30s ；72° Clmin 共 32 次循环，72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脱氢酶基因Bud A。实施例3 :重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II”的构建在Bud A的5’端约39bp碱基序列的两端分别弓I入EcoR I7Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端约20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂II。根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II ”序列和λ Red序列的重组粘粒SuperCos_l/pIJ790。实施例4 :重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044。将重组粘粒SuperCos_l/pIJ790- “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'实施例5 :工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-中 2，3_丁二醇脱氢酶酶活测定 (I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-(2)所用培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，阿泊拉霉素40 μ g/mL,ρΗ6· O(3)酶活测定方法酶活力测定的基本反应体系(200 μ L)组成50mmol/LTris-HClpH8. 0,177 μ L,酶液 10 μ L，1. lmol/L2, 3-丁二醇(乙偶姻)10yL，25mMNAD+(NADH) 3 μ L，37°C反应5min后，测定Imin内340nm处吸光度的变化率。一个酶活力单位(U)定义为Imin NADH增加(减少)的ymoL数量。酶粗提液的制备如下将发酵液离心所得的菌体用生理盐水(0. 85%NaCl)洗涤两次后重悬于pH8. 0,50mmol/L Tris-HCl中，在300W,30min,超声2s,停4s条件下进行超声破碎,冰浴保护,8500rpm低温离心30min,上清液即为酶粗提液。蛋白浓度用Bradford法检测，以牛血清蛋白作为标准品。考察结果重组菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-中 2，3_ 丁二醇脱氢酶酶活为O。对比例1:原始菌株 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中 2，3_ 丁二醇脱氢酶酶活测定(I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044(2)所用培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，ρΗ6· O(3)酶活测定方法酶活力测定的基本反应体系(200 μ L)组成50mmol/LTris-HClpH8. 0,177 μ L,酶液 10 μ L，1. lmol/L2, 3-丁二醇(乙偶姻)10yL，25mMNAD+(NADH) 3 μ L，37°C反应5min后，测定Imin内340nm处吸光度的变化率。一个酶活力单位(U)定义为Imin NADH增加(减少)的ymoL数量。酶粗提液的制备如下将发酵液离心所得的菌体用生理盐水(0. 85%NaCl)洗涤两次后重悬于pH8. 050mmol/LTris-HCl中，在300W，30min,超声2s,停4s进行超声破碎,冰浴保护,8500rpm低温离心30min,上清液即为酶粗提液。蛋白浓度用Bradford法检测，以牛血清蛋白作为标准品。
考察结果原始菌株paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044 中 2，3_丁二醇脱氢酶酶活为 O. 133U/mg。实施例6 :工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-直接利用菊芋菊粉粗提液在摇瓶中发酵产S-3-羟基丁酮(I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)种子培养基(g/L) : (NH4)2HPO4LO, KCl 0. 2,MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 0. 2，葡萄糖5. O,菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；种子培养1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30oC，摇床转速120rpm，培养22h ；(3)发酵培养培养基组成(g/L):菊芋菊粉粗提液含菊粉60. O, (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 10，MgSO4. 7H20 O. 1，酵母膏 6. 0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；培养条件接种量10v/v%，发酵温度30oC，pH6. 0，控制氧气的通入量，摇床转速120rpm,维持微氧环境发酵即可，发酵时间42h。发酵结果菊芋菊粉粗提液中含60. Og/L的菊粉，经发酵得到25. 2g/L的S-3-羟基丁酮，光学纯度100%。对比例2 :原始菌paenibacillus polymyxa CGMCC直接利用菊芋菊粉粗提液在摇瓶中发酵产S-3-羟基丁酮 (I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 ；(2)种子培养基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 2，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 O. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；种子培养1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30oC，摇床转速120rpm，培养22h ；(3)发酵培养培养基组成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60. O, (NH4)2HPO4 1.0, KCl0. 10，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 6. 0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；培养条件接种量10v/v%，发酵温度30oC，pH6. 0，控制氧气的通入量，摇床转速120rpm,维持微氧环境发酵即可，发酵时间42h。发酵结果菊芋菊粉粗提液中含60. 0g/L的菊粉，经发酵得到10. 5g/L的S-3-羟基丁酮，光学纯度40. 4%。实施例7 :工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产S-3-羟基丁酮(I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)种子培养基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl 0. 2，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 0. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；种子培养1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30oC，摇床转速120rpm，培养22h ；(3)发酵培养培养基组成(g/L):酵母膏 6. 0，(NH4)2HPO4L O, KCl 0. 10，MgSO4. 7H20 0. 1，菊粉粗提液含菊粉80. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；培养条件5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度30oC，pH6. O,控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速240rpm，发酵24h后，控制转速120rpm，维持微氧环境发酵。发酵时间42± lh，分批补料流加菊粉维持菊粉浓度在30. 0±1· Og/L。发酵结果底物约为120. Og/L的菊粉，经发酵得到48. 7g/L的S-3-羟基丁酮，光学纯度100%。对比例3 :原始菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产S-3-羟基丁酮(I)出发菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 ；(2)种子培养基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 2，MgSO4. 7H20 O. 1，酵母膏 O. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；种子培养1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30oC，摇床转速120rpm，培养22h ；(3)发酵培养培养基组成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4 1.0, KCl O. 10,MgSO4. 7H20 O. 1，菊粉粗提液含菊粉80. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；培养条件5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度30oC，pH6. O,控制 氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速240rpm，发酵24h后，控制转速120rpm，维持微氧环境发酵。发酵时间54± lh，分批补料流加菊粉维持菊粉浓度在30. 0±1· Og/L。发酵结果底物约为110. 0g/L的菊粉，经发酵得到16. 4g/L的S_3_羟基丁酮，光学纯度40. 3%。
SEQl ENCE LISTiNG
<πο>盐城工学院
<120〉一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用 <130〉 20130122 <160> 2
<170〉PatentIn version 3. 3 〈210〉 I <211> 1053 <212〉 DNA
<213〉 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 <220〉
<221> CDS <222〉 (I).. (1053)
<400> I atg caa gca ttg aga tgg cat gga ata aaa gat tta cgt ttg gaa aac48
Met Gln Ala Leu Arg Trp His Gly He Lys Asp Leu Arg Leu Glu Asn I51015
att gag caa ccc get get ctt cca gga aaa gta aaa ate aaa gta gaayb
He Glu Gln Pro Ala Ala Leu Pro Gly Lys Val Lys He Lys Val Glu 202530
tgg tgt ggc att tgc gga agt gat ctt cac gaa tat gta gca gga ccg144
Trp Cys Gly He Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Val Ala Gly Pro 354045
ate ttc att cct gaa aac get cag cat cca ctg act ggg gaa aaa tct192
He Phe He Pro Glu Asn Ala Gln His Pro Leu Thr Gly Glu Lys Ser
权利要求
1.一种产S-3-轻基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus poIymyxaCGMCC 3044-Bud A_，该工程菌是通过下列方法构建得到利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中扩增出 2，3_ 丁二醇脱氧酶基因 Bud A,5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重组粘粒转化 paenibacillus po lymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介导下与paenibacillus polymyxa CGMCC 3044发生同源双交换,得到重组的多粘类芽抱杆菌，即产S-3-轻基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'
2.根据权利要求1所述的产S-3-羟基丁酮基因工程菌，其特征在于该工程菌通过下列方法构建得到 (1)基因BudA的克隆根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5’ -ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5’ -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’ 以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脱氢酶基因，即Bud A基因； (2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_BudA 同源臂1-oriT_ApraK-Bud A 同源臂II” 的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得至Ij Bud A同源臂II ；根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II； (3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCOS-l/pIJ790-BudA同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'
3.权利要求1所述的产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括下列步骤利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044中扩增出2，3-丁二醇脱氢酶基因Bud A，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带XRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-Bud A同源臂II”序列的重组粘粒SuperCos_l/pIJ790,重组粘粒转化paenibacillus polymyxa CGMCC 3044,并在 λ Red介导下与宿主菌发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产S-3-羟基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud PC。
4.根据权利要求3所述的产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法，其特征在于包括下列步骤(1)基因Bud A的克隆根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列设计合成PCR所需的引物Pl :5’ -ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5’ -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’ 以多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应PCR 反应条件94° C 变性 5min，经 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 个循环，再经过72° C延伸lOmin，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接,进行序列测定,获得来源于多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脱氢酶基因，即Bud A基因； (2)重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_BudA 同源臂1-oriT_ApraK-Bud A 同源臂II” 的构建在Bud A的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I;在Bud A的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I，BamH I，得至Ij Bud A同源臂II ；根据所述酶切位点连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重组粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II； (3)重组基因工程菌的获得将重组粘粒“SuperCOS-l/pIJ790-BudA同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 转化多粘类芽抱杆菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽抱杆菌，命名为 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'
5.权利要求1所述的产S_3_轻基丁酮基因工程菌paenibacilluspolymyxa CGMCC3044-Bud k_在生产S-3-羟基丁酮中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将构建的基因工程菌paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044-Bud A_接种于含碳源、氮源和无机盐的无菌培养基中进行培养,发酵生产光学纯S-3-羟基丁酮，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉粗提液。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于该基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液为底物生产S-3-羟基丁酮，具体生产工艺为 (1)出发菌株paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044-Bud A-；(2)种子培养基(NH4)2HPO4O. 5-2. Og/L, KCl O. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L,酵母膏0. 1-0. 3g/L，葡萄糖2. 0-8. Og/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉3. 0-1. 0g/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ； 种子培养=IOOOmL三角瓶，装液量200mL，培养温度30_37oC，摇床转速120-200rpm，培养 12-36h ； (3)发酵培养培养基组成菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-120. 0g/L，(NH4)2HPO4.0. 5-2. 0g/L, KCl 0. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母膏 3· 0-8. Og/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ； 培养条件接种量10v/v%，发酵温度30-37oC，pH6. 0-8. 0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h,控制转速240rpm,发酵24h后,控制转速120rpm,维持微氧环境发酵。
全文摘要
本发明公开了一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用，该菌株分类命名为paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-。Bud A为2,3-丁二醇脱氢酶基因，通过同源双交换，敲除P.polymyxa CGMCC 3044中的Bud A基因获得菌株p.polymyxa CGMCC 3044-Bud A-。通过上述方法构建的重组菌能发酵合成光学纯S-3-羟基丁酮，光学纯度可达100%，无3-羟基丁酮还原态副产物2,3-丁二醇，该菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、丁二酮等底物，培养条件粗放，操作方便简单，光学纯度高，生产成本低，有利于大规模产业化生产。
文档编号C12R1/01GK103060255SQ20131002809
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者高健, 徐虹, 李莎, 冯小海, 薛锋, 李凤伟, 邵荣 申请人:盐城工学院