专利名称：一种杂合抗菌肽lpcb及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽LPCB及其制备方法。
背景技术：
抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)是生物体内经诱导产生的小分子多肽，广泛存在于多种生物体，是机体防御病原体入侵的第一道屏障。大多数抗菌肽都具有广谱抗菌性，不仅可以抑制多种细菌或真菌，甚至对病毒及肿瘤细胞都有高效的杀伤活性。并且抗菌肽不易产生耐药性，可作为传统抗生素的替代品，近年来对抗菌肽的研究已成为一大热点。但是由于抗菌肽分子小，直接从动植物体内提取分离效率较低，而化学合成的费用昂贵，因此利用基因工程手段对天然抗菌肽进行设计和改造，以获得抗菌谱更广、活性更强、减弱或消除其毒副作用的新型抗菌肽是一个理想的选择。专利200910036902.X报道了一种杂合抗菌肽CA-MA的基因工程制备方法，该方法记载了利用家蝇泛素为融合伴侣，构建了高效表达杂合抗菌肽CA-MA的融合表达载体，所获得的抗菌肽具有高效的抗菌活性和光谱性。但是该方法制备的杂合抗菌肽的溶血性没有相关报道，CA-MA的安全性也备受质疑。另一方面大肠杆菌系统表达抗菌肽比较困难，主要表现在抗菌肽容易被降解，抗菌肽本身带有大量的正电荷，对蛋白酶非常敏感，在大肠埃希菌中容易降解，难以实现量产。发明专 利200610085397.4报道了采用酵母表达系统进行基因工程抗菌肽类天蚕素A-马盖宁的制备,该方法记载了根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA, CA) N端第1_7个氨基酸残基，马盖宁(magainin, M)N端第2_12个氨基酸残基，以毕氏酵母偏爱的密码子设计合成杂合肽CA(1-7)-M(2-12)基因，转化毕氏酵母SMD1168，在醇氧化酶启动子调控下，分子量1.9KD的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达。然而由于天蚕素A的细胞溶血性较强，存在安全性问题，不适合后续的生产应用。而该专利也没有报道所制备的杂合抗菌肽的溶血性效果O
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种杂合抗菌肽LPCB，该杂合抗菌肽LPCB具有较高的抑菌活性及热稳定性，并且溶血性低，安全性得到大大提高。本发明的另一目的在于提供一种上述杂合抗菌肽LPCB的制备方法。为了达到上述发明目的，本发明采用的一个技术方案是:提供一种杂合抗菌肽LPCB，其特征在于:它为以下氨基酸序列:RRffQffR(P)nKffKIFKKIEK ；其中，η表示脯氨酸的个数，η = I 10。所述杂合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列设计而成，它所对应的核苷酸序列为: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGMGATGGCAATGGAGA (CCA) nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3 ;其中，n表示脯氨酸密码子的个数，η = 3 30。上述杂合抗菌肽LPCB的制备方法，包括:杂合抗菌肽LPCB的基因改造及克隆:参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，将正确的基因序列与PPICZ a -A相连接获得表达载体pPICZ a -A-LPCB,并通过酶切验证后送出测序，获得测序正确的表达载体；杂合抗菌肽LPCB真核表达载体的构建:将测序正确的表达载体pPICZ a -A-LPCB通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X_33,经甲醇诱导表达,获得杂合抗菌肽LPCB ;采用甲醇进行诱导表达的条件为:在25°C下，每24 36h向培养基中添加
0.2 0.5%的甲醇，诱导表达72 96h。其中，在利用SOE法克隆基因过程中，所采用的引物为:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) ^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 3 30, η表示脯氨酸密码子的个数。综上所述:本发明提供的杂合抗菌肽LPCB具有良好的抑菌活性及热稳定性，并且溶血性低，即使是高浓度的杂合抗菌肽对红细胞也几乎没有破坏作用，安全性得到大大提高；且该杂合抗菌肽LPCB制备方法简单，易纯化，利于大规模生产。
图1为杂合抗菌肽LPCB的热稳定性的示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。实施例1本发明的杂合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列设计而成；该杂合抗菌肽LPCB的核心序列为:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的个数，η = I ；杂合抗菌肽LPCB所对应的核苷酸序列为:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 3，η表示脯氨酸密码子的个数；该杂合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的个数为I及核苷酸序列中脯氨酸密码子的个数为3，以增强该杂合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述杂合抗菌肽LPCB的制备方法为:参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，将正确的基因序列与pPICZ a -A相连接获得表达载体pPICZ a -A-LPCB,并通过酶切验证后送出测序，获得测序正确的表达载体；在利用SOE法克隆基因过程中，所采用的引物为:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3
其中，Ii1 = n2 = 3, η表示脯氨酸密码子的个数。再将测序正确的表达载体pPICZ a -A-LPCB通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每24h向培养基中添加0.2%的甲醇，诱导表达72h，获得杂合抗菌肽LPCB，该杂合抗菌肽LPCB的表达量可达78 μ g/mL。经活性初测表明，该杂合抗菌肽LPCB具有较好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析结果显示:杂合抗菌肽LPCB蛋白分子量约为2.4kDa，与预期结果相符。实施例2本发明的杂合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列设计而成；该杂合抗菌肽LPCB的核心序列为:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的个数，η = 10 ；杂合抗菌肽LPCB所对应的核苷酸序列为:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 30，η表示脯氨酸密码子的个数；该杂合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的个数为10及核苷酸序列中脯氨酸密码子的个数为30，以增强该杂合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述杂合抗菌肽LPCB的制备方法为:参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，将正确的基因序列与pPICZ a -A相连接获得表达载体pPICZ a -A-LPCB,并通过酶切验证后送出测序，获得测序正确的表达载体；在利用SOE法克隆基因过程中，所采用的引物为: F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 30, η表示脯氨酸密码子的个数。再将测序正确的表达载体pPICZ a -A-LPCB通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每36h向培养基中添加0.5%的甲醇，诱导表达96h，获得杂合抗菌肽LPCB，该杂合抗菌肽LPCB的表达量可达96 μ g/mL。经活性初测表明，该杂合抗菌肽LPCB具有较好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析结果显示=LPCB蛋白分子量约为3.5kDa，与预期结果相符。实施例3本发明的杂合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列设计而成；该杂合抗菌肽LPCB的核心序列为:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的个数，η = 5 ；杂合抗菌肽LPCB所对应的核苷酸序列为:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 15，η表示脯氨酸密码子的个数；该杂合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的个数为5及核苷酸序列中脯氨酸密码子的个数为15，以增强该杂合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述杂合抗菌肽LPCB的制备方法为:参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因， 并利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，将正确的基因序列与pPICZ a -A相连接获得表达载体pPICZ a -A-LPCB,并通过酶切验证后送出测序，获得测序正确的表达载体；在利用SOE法克隆基因过程中，所采用的引物为:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 15, η表示脯氨酸密码子的个数。再将测序正确的表达载体pPICZ a -A-LPCB通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每30h向培养基中添加0.3%的甲醇，诱导表达84h，获得杂合抗菌肽LPCB，该杂合抗菌肽LPCB的表达量可达73 μ g/mL。经活性初测表明，该杂合抗菌肽LPCB具有较好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析结果显示=LPCB蛋白分子量约为2.9kDa，与预期结果相符。试验例将上述实施例3的杂合抗菌肽LPCB分别进行抑菌活性、热稳定性及溶血性检测:1、抗菌谱测定实验表明(表I):杂合抗菌肽LPCB对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均显示出良好的抑菌性，尤其是对Salmonella derby的抑菌效果更为明显；表I杂合抗菌肽LPCB的抗菌谱
权利要求
1.一种杂合抗菌肽LPCB，其特征在于:它为以下氨基酸序列: RRffQffR(P)nKWKIFKKIEK ;其中，η表示脯氨酸的个数，η = I 10。
2.根据权利要求1所述的杂合抗菌肽LPCB，其特征在于:所述杂合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列设计而成,它所对应的核苷酸序列为:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3 ;其中，η表示脯氨酸密码子的个数，η = 3 30。
3.一种杂合抗菌肽LPCB的制备方法,其特征在于,包括: 杂合抗菌肽LPCB的基因改造及克隆:参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，将正确的基因序列与pPICZ a -A相连接获得表达载体pPICZ a -A-LPCB,并通过酶切验证后送出测序，获得测序正确的表达载体； 杂合抗菌肽LPCB真核表达载体的构建:将测序正确的表达载体pPICZ a -A-LPCB通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris X_33,经甲醇诱导表达,获得杂合抗菌肽LPCB ； 其中，在利用SOE法克隆基因过程中，所采用的引物为:F3:5-CCCTCGAGAAAAGAA GAAGATGGCAATGGAGA(CCA)riiAAGTGGAAGA-3F4:5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3 其中，Ii1 = n2 = 3 30, n表示脯氨酸密码子的个数。
4.根据权利要求3所述的杂合抗菌肽LPCB的制备方法，其特征在于，采用甲醇进行诱导表达的条件为:在25°C下，每24 36h向培养基中添加0.2 0.5%的甲醇，诱导表达72 96h，获得杂合抗菌肽LPCB。
全文摘要
本发明公开了一种杂合抗菌肽LPCB及其制备方法，该杂合抗菌肽的氨基酸序列为RRWQWR(P)nKWKIFKKIEK，并且脯氨酸的个数为1～10；该杂合抗菌肽在制备过程中采用引物F3和F4，且该引物中n为3～30；本发明的杂合抗菌肽LPCB具有良好的抑菌活性及热稳定性，并且溶血性低，即使是高浓度的杂合抗菌肽对红细胞也几乎没有破坏作用，安全性得到大大提高；且该杂合抗菌肽LPCB制备方法简单，易纯化，利于大规模生产。
文档编号C12N15/81GK103145805SQ20131003215
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者曹毅, 乔代蓉, 徐辉 申请人:曹毅, 乔代蓉, 徐辉