专利名称：早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学和医学检验领域，涉及一种肿瘤生物标志物，具体涉及一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途。
背景技术：
由于肺腺癌发病隐匿，缺乏特异的临床表现，目前又没有行之有效的早期诊断方法，尽管I期肺腺癌术后5年生存率可达70%，但是仅10%的患者能在早期阶段(ΤΙΝ0Μ0/T2N0M0)被发现，40%的肺腺癌患者在确诊时已进入中晚期而失去手术机会，5年生存率〈15%。因此，肺腺癌的早期诊断对提高肺腺癌患者的生存质量、延长生命具有非常重要的意义。现阶段公认的肺腺癌早期诊断的方法有:痰脱落细胞学检查，但检出率仅有209Γ30% ;低剂量螺旋CT，仅能检出周围型肺腺癌，且费用昂贵；纤维支气管镜，属有创性检查，患者不宜接受；ΡΕΤ及PET/CT虽能鉴别出肺内0.5mm以上的代谢增高病灶，但炎症病灶易出现假阳性，而一些代谢率低的肺腺癌如肺泡癌可出现假阴性。随着分子生物学领域研究的不断深化，筛查与肺腺癌发生相关的早期分子事件有望成为肺腺癌早期诊断的一条 新途径。目前已有多种肿瘤标志物用于肺腺癌的检测，如癌胚抗原(CEA)用于肺腺癌的检测；细胞角蛋白21-1片断(CYFRA21-1)用于肺鳞癌的诊断；神经元特异性烯醇化酶(NSE)用于小细胞肺腺癌的诊断等，但因敏感性和特异性的问题，很难将它们作为肺腺癌诊断的硬性指标。微小核糖酸(miRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，通过对多种癌组织中miRNA表达谱与正常组织对比分析，发现miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达谱，miRNA表达谱具有显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。因此确定早期肺腺癌miRNA特异表达谱将有助于早期肺腺癌的诊断。近年来，肺腺癌的发病率在我国更是保持着持续增长的趋势，特别是在女性和非吸烟者史群体中。因此，针对肺腺癌这一特定类型的NSCLC，进行无创伤性早期诊断的研究尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是早期肺腺癌诊断的敏感性、特异性低，为了克服现有技术的不足，提供了一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是:所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的 miR-103、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222 和 miR-223 中的一种以上。进一步，所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的miR-146a、miR_222和miR-223中的一种以上。进一步，所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的miR-146a、miR_222和miR-223ο进一步,所述miRNA来自外周静脉血的血清。本发明还提供了上述早期肺腺癌miRNA特异表达谱中特异表达miRNA的反转录引物，具体为对应 miR-103 的 probe-miR-103、对应 miR_146a 的 probe_miR-146a、对应 miR-151 的 probe-miR-151、对应 miR-221 的 probe-miR-221、对应 miR-222 的probe-miR-222 和对应 miR-223 的 probe-miR-223。本发明还提供了上述特异表达miRNA的反转录引物的用途，用于早期肺腺癌诊断用试剂盒或生物芯片。进一步，所述试剂盒或生物芯片包括probe-miR-103、probe_miR-146a、probe-miR-151、probe-miR-221、probe-miR-222 和 probe-miR-223 的一种以上。进一步，所述试剂盒或生物芯片包括probe-miR_146a、probe-miR-222和probe-miR-223 的一种以上。进一步，所述试剂盒或生物芯片包括probe-miR_146a、probe-miR-222和probe-miR-223ο本发明提供的技术方案通过对少量miRNA的检测即可实现对早期肺腺癌的准确诊断，为生产出准确、高效和经济的检测产品提供了可能。建立的肺腺癌预测模型能较好的区分肺腺癌和健康个体的能力，具有较强的临床实际意义。
图1是本发明所述表达谱中肺腺癌差异表达循环miRNA的统计学数据。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作详细描述:一、血清标本的采集:肺腺癌患者(AD)术前外周静脉血内的血清和年龄、性别与实验组相匹配的健康体检者(control)的外周静脉血的血清。二、血清总RNA的抽提与纯化:1.将350ul血清标本与等体积2xDenaturing Solution室温混合,冰上孵育5min。2.加入酸苯酹:氯仿,体积=样本体积+2xDenaturing Solution体积,振荡混勻30 60s, 12000rpm离心5min,收集水相于干净的EP管中。3.加入1.25倍体积的室温100%乙醇于收集的水相中，立即混匀。4.将混合物加入过滤器中，一次最多700ul,若体积大于700ul,可重复使用同一过滤器。离心30s后弃滤液，重复直到所有混合物都通过过滤器。5.用 700ul miRNA Wash Solution I 洗漆，离心 30s,弃滤液。6.用 500ul Wash Solution2/3 洗漆两次，弃滤液。7.空离lmin，去除残留液。8.预热 Elution Solution 至 95°C,将预热的 Elution Solution50ul 加入滤膜中心，静置2 3min，离心30s，将滤液重新加入过滤器中再重复洗脱一次，收集洗脱液，储存在-80°C中。三、反转录反应:
6个上调表达的miRNA的反转录引物序列如表一所示，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。miRNA标准品购买于广州市锐博生物科技有限公司。表一`
权利要求
1.一种早期腺肺腺癌m i RNA特异表达谱，其特征在于，包括上调表达的m i R-10 3、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222 和 miR-223 中的一种以上。
2.根据权利要求1所述一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱，其特征在于，所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的miR-146a、miR-222和miR-223中的一种以上。
3.根据权利要求2所述一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱，其特征在于，所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的miR-146a、miR-222和miR-223。
4.根据权利要求1所述一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱，其特征在于，所述miRNA来自外周静脉血的血清。
5.权利要求1所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱中特异表达miRNA的反转录引物，其特征在于，分别为对应 miR-103 的 probe-miR-103、对应 miR_146a 的 probe_miR-146a、对应 miR-151 的 probe-miR-151、对应 miR-221 的 probe-miR-221、对应 miR-222 的probe-miR-222 和对应 miR-223 的 probe-miR-223。
6.一种用于早期肺腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于，所述试剂盒或生物芯片包括 probe-miR-103、probe_miR-146a、probe-miR-151 > probe-miR-221 > probe-miR-222和probe-miR-223的一种以上。
7.根据权利要求6所述一种用于早期肺腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于，所述试剂盒或生物芯片包括probe_miR-146a、probe-miR-222和probe-miR-223的一种以上。
8.根据权利要求7所述一种用于早期肺腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于，所述试剂盒或生物芯片包括 probe_miR-146a、probe-miR-222 和 probe-miR-223。
全文摘要
本发明属于生物学和医学检验领域，涉及一种肿瘤生物标志物，具体涉及一种早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途。所述早期肺腺癌miRNA特异表达谱包括上调表达的miR-103、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222和miR-223中的一种以上。基于以上特异表达谱提供了早期肺腺癌诊断模型、特异表达miRNA的反转录引物和用于早期肺腺癌诊断用试剂盒或生物芯片。本发明提供的技术方案通过对少量miRNA的检测即可实现对早期肺腺癌的准确诊断，为生产出准确、高效和经济的检测产品提供了可能。建立的肺腺癌预测模型能较好的区分肺腺癌和健康个体的能力，具有较强的临床实际意义。
文档编号C12N15/11GK103173448SQ20131004926
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者娄加陶, 薛剑, 王琳, 吴传勇 申请人:上海市胸科医院