专利名称：一种修饰的小干扰核酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。
背景技术：
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing),是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小分子干扰核酸(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex, RISC)。在 RNA 干扰过程中，双链 siRNA 中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。但是，由于小分子干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。目前，由于人们对s iRNA在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，只能依靠各自的经验随机地选择siRNA分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很好地提高siRNA分子的血清稳定性，但由于缺乏理论的指导，通常在siRNA分子中引入了过量的修饰，增加了修饰后的siRNA的细胞毒性，并在很多情况下降低了 siRNA的生物学活性，因而制约了修饰后的siRNA在体内的应用。另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法，也限制了一些具有较好稳定效果，但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。因此，设计具有针对性的修饰方案，通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的siRNA的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题，提供一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸，以及这种小分子干扰核酸的制备方法。
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其特征在于，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述的第一片段为5 ’ -AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3 ’，第二片段为3， -UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5，。本发明通过对UA/UA位点进行特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
具体实施例方式本发明提供的修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成至少一个UA/UA位点，其中，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。本发明的发明人对小干扰核酸分子在体内的降解过程进行了细致的研究，发现在UA/UA位点中仅引入少量修饰的情况下，即可提高修饰的小干扰核酸分子的稳定性，大大降低了由于随机地引入大量的修饰而导致的细胞毒性较高，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。根据本发明，所述的“第一片段”是指具有与基因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。所述“互补”是指两个核苷酸在杂交条件下能够配对，例如，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之间能够配对，以及胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间的配对。
根据本发明，所述小干扰核酸分子的标靶可以为各种基因，例如，可以将在细胞内的功能有待分析的基因作为标靶，也可以将需要抑制其表达的基因作为标靶，例如，可以以与疾病或紊乱相关的基因作为标靶，如癌基因、病毒基因、细胞膜表面受体基因、细胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据其标靶基因，能够设计得到小干扰核酸分子(siRNA)，例如，将目的基因的靶标序列或目的基因在NCBIGenbank中的序列号输入各种小干扰核酸设计程序,如Insert Design Tool for the shRNAVectors (Ambion)、shRNA Explorer (Gene Link)> siDirect (Yuki Naito et al.Universityof Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research),BLOCK-1T RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT), RNAi Explorer(Gene Link)、siRNA Target Finder (Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等，该设计程序将会根据设计者的要求和siRNA的设计原则，针对所提供的基因或序列设计siRNA。并且，有些程序能够对设计好的siRNA做全基因组或mRNA转录组的同源性分析，从而设计出对靶基因或靶序列特异的siRNA。上述提及的siRNA设计程序及其涉及的原则为本领域技术人员所公知，其全部内容在此一并引入作为参考。
根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以包含多个UA/UA位点，并且该多个UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。此外，所述修饰的小干扰核酸中，除了所述UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其生物活性，还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小化，从而进一步地降低修饰引起的小分子干扰核酸的细胞毒性。优选情况下，所述修饰的小干扰核酸的UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。本发明的发明人意外地发现，只要对所述UA/UA位点中的一个尿嘧啶核苷酸进行修饰，就可以提高修饰的小干扰核酸的稳定性，并维持其生物活性，这种情况下，可以使在修饰的小干扰核酸中引入的修饰数量最小化，从而更进一步地降低修饰引起的小分子干扰核酸的细胞毒性。根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以为单链分子也可以为双链分子。当所述修饰的小干扰核酸为单链分子时，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链可以为连续的核苷酸链，也可以为不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链。根据本发明的一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于反义链。根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。本发明中，术语“正义链”是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“反义链”是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。并且，当所述修饰的小干扰核酸为双链分子且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链时，术语“正义链”和“第一片段”可以互换使用，术语“反义链”和“第二片段”可以互换使用。本发明中，术语“正义链部分”是指当所述正义链为不连续的核苷酸时，用于组成正义链的一部分核苷酸链；在所述正义链中，该正义链的所有正义链部分的总长度与所述正义链的长度相等，并且，当所述正义链部分中包含UA/UA位点时，术语“正义链部分”与“第一片段”可以互换使用。根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以由核糖核苷酸组成，也可以为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。根据本发明，术语“细胞毒性”是指由于对核苷酸分子进行修饰而造成的对细胞的
毒性作用。本发明中，所述修饰的方式为本领域技术人员所公知，例如，本发明对所述小分子干扰核酸进行的化学修饰为以下的一种或几种:(1)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的的修饰；(3)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烧化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如图所示分别用硫和硼烧置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定小分子干扰核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。而硼烷化磷酸盐修饰的小干扰核酸的疏水性强，易于在血浆中形成水合蛋白，对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯。
权利要求
1.一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其特征在于，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述的第一片段为 5’ -AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3’，第二片段为 3’ -UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5’。
2.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸中，除了所述UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。
3.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。
4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸为发夹结构的单链分子，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。
5.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于反义链。
6.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。
7.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸为包含核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
8.根据权利 要求1-3中的任意一项所述的修饰的小分子干扰核酸，其中，所述修饰为如下的修饰中的至少一种: (1)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰； (2)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的修饰； (3)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
9.根据权利要求8所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰。
10.根据权利要求9所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH被甲氧基或氟取代。
全文摘要
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸及其制备方法，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其特征在于，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述的第一片段为5’-AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3’，第二片段为3’-UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5’。本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
文档编号C12N15/113GK103184222SQ20131005214
公开日2013年7月3日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者杜权 申请人:百奥迈科生物技术有限公司