专利名称：鉴定大豆Lox1和Lox3缺失体的多重PCR引物及其方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的多重PCR引物及其方法，主要应用于分子标记的技术领域。
背景技术：
大豆脂肪氧化酶(Lox)是一种含非血红素铁、水溶性球蛋白质。Lox通过催化不饱和脂肪酸中顺，顺1，4-戊二烯结构，形成过氧化氢衍生物，再继续转化成低级的醛和酮等有害物质，从而产生豆腥味和其他挥发性物质，阻碍了大豆在食品中的广泛应用。Lox催化产生的过氧化氢物，能直接与食品中的营养成分结合，降低食品的食用品质和营养价值。高温处理可减轻大豆豆醒味，但会导致蛋白质变性，使蛋白质加工性能和利用率降低。此夕卜，通过微波照射、改变介质pH、有机溶剂萃取和醛水解酶水解等方法，也可以降低或消除大豆豆腥味。上述方法都会不同程度增加大豆产品成本，且常常会导致大豆蛋白质溶解度下降，降低食品营养价值。因此，通过遗传育种手段选育大豆Lox缺失体材料，以降低或消除Lox活性的影响具有重要意义。王若兰等(2008)研究认为，大豆Lox缺失体样品在储藏期间的品质变化比正常品种缓慢，Lox缺失可在一定程度上提高大豆储藏品质的稳定性。王金龙等(2000)研究认为，大豆Lox缺失对蛋白质、脂肪及脂肪酸含量没有影响，但可能引起种子中脯氨酸含量降低，而对其它氨基酸无影响。脯氨酸不属于人体必需氨基酸，故Lox缺失不会引起大豆营养品质降低。Julian等(2010)采用探针技术分别鉴定Lox2和Lox3,但该技术存在技术复杂、费用较闻等问题。通过分子标记技术筛选大S.Lox缺失体,可以加快无腥大豆品种选育进程，进而从根本上改善大豆产品豆腥味，提高大豆的储藏品质。对目前已有的LOX缺失体中LOX基因进行测序分析，表明Loxl缺失体在其编码基因的第8个外显子内缺失I个74bp的片段，导致Loxl蛋白翻译过早终止；Lox3缺失体在其编码基因的第I个外显子内缺失I个单核苷酸“G”，从而导致移码突变。Yarmilla等(2011)只针对一个RIL群体开发分子标记，分别鉴定大豆Lox l、Lox2和Lox3。目前已有的方法都只能对三种Lox缺失体单独进行鉴定，检测效率较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的多重PCR引物及其方法。本发明是通过以下技术方案来实现的。一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的多重PCR引物，包括以下两组引物对:LoxlF:ATCTTAGCGTGCTTCACCCA ；Lox IR:CATCAGCGGCATAAGGATAG ；Lox3F:TAACCAGCGTTGGGGGAA ；Lox3R:CATTTATAGACGTGCGTGCA。一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的方法，包括以下步骤:
(I)以待测缺失体的大豆基因为DNA模板，将上述两组引物对上述DNA模板进行PCR扩增；(2)若述PCR扩增产物中有424bp条带，则上述待测大豆基因含有Loxl，若有350bp条带，则上述待测大豆基因缺失Loxl ;若述PCR扩增产物中有474bp条带，则上述待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带，则上述待测大豆基因缺失Lox3。进一步地，上述Loxl缺失体的大豆为五星4号、鉴31中的任意一种。进一步地，上述Lox3缺失体的大豆为五星I号、五星4号、鉴31中的任意一种。本发明的有益效果:本发明提供的特异性引物及其鉴定技术，不但节约时间和费用，而且鉴定结果准确可靠，可显著提高同时对Loxl和Lox3缺失体材料的筛选效率。
图1为实施案例I琼脂糖凝胶电泳的示意图。
具体实施例方式下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。在下述的实施案例I中，一共选取七种大豆品种进行鉴定,这七种大豆品种均由河北省农林科学院提供的常用品种。1、五星I号
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审定编号:冀审豆2001002号品种来源:河北省农林科学院粮油作物研究所1997年育成，亲本组合为冀豆9/Century02、五星2号审定编号:国审豆2004005选育单位:河北省农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆9号XCentury3、五星3号选育单位:河北省农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆9号XCentury4、五星4号审定(登记)编号:冀审豆2009005号选育单位:河北省农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆12 X Suzuyutaka5、鉴 31由河北省农林科学院提供，为推广品种6、中黄 13品种审定编号:国审豆2001008品种来源:豫豆8号/中90052 — 76，为推广品种选育单位:中国农业科学院作物育种栽培研究所
实施案例1:1、DNA 提取:(1)0.1g 大豆粉加入 0.7mLSDS 提取液(0.1M Tris-HCl (PH=8.5),0.1M NaCl,
0.05M EDTA(PH=8.0),2% SDS)在65°C恒温下裂解45min，其间多次震荡。(2)在 4°C 12000rpm 条件下,离心 lOmin。(3)取上清液加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层。(4)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(5)取上清液加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。(6)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(7)取上清液加入等体积的异丙醇于_20°C冰箱静置30min。(8)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(9)用70%的乙醇洗涤两次。(10)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(11)沉淀自然风干。2、引物 LoxlF:ATCTTAGCGTGCTTCACCCA ；Lox IR:CATCAGCGGCATAAGGATAG ；Lox3F: TAACCAGCGTTGGGGGAA ；Lox3R: CATTTATAGACGTGCGTGCA。引物均有Primer Premier 5软件设计。3、反应体系:2uL 2.5mM dNTP，0.5uL IOuM引物，2uL 10*Ex Tap Buffer, 1.4UTaKaRa Tap, 150ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到20uL。4、PCR 反应程序:94°C变性 5min ;94°C变性 45s ;60°C退火 50s ;72°C延伸 50s，30个循环。5、琼脂糖凝胶电泳:1.5%琼脂糖凝胶，缓冲体系为I X TAE溶液，在IOOV恒压下，电泳50min，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存。若扩增产物中有474bp条带，说明待测大豆含有Lox3，若无此条带，说明缺失Lox3 ;若扩增产物中有424bp条带，说明待测大豆含有Loxl，若有350bp条带，说明缺失Loxl。具体实验结果参照图1所示的琼脂糖凝胶电泳的示意图。上述实施例只为 说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的多重PCR引物，其特征在于，包括以下两组引物对:LoxlF:ATCTTAGCGTGCTTCACCCA ；Lox IR:CATCAGCGGCATAAGGATAG ；Lox3F:TAACCAGCGTTGGGGGAA ；Lox3R:CATTTATAGACGTGCGTGCA。
2.一种鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)以待测缺失体的大豆基因为DNA模板，将所述两组引物对所述DNA模板进行PCR扩增； (2)若述PCR扩增产物中有424bp条带，则所述待测大豆基因含有Loxl，若有350bp条带，则所述待测大豆基因缺失Loxl ;若述PCR扩增产物中有474bp条带，则所述待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带，则所述待测大豆基因缺失Lox3。
3.根据权利要求2所述的鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的方法,其特征在于，所述Loxl缺失体的大丑为五星4号、鉴31中的任意一种。
4.根据权利要求 2所述的鉴定大豆Loxl和Lox3缺失体的方法,其特征在于，所述Lox3缺失体的大丑为五星I号、五星4号、鉴31中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定大豆Lox1和Lox3缺失体的多重PCR引物，包括两组引物对Lox1FATCTTAGCGTGCTTCACCCA；Lox 1RCATCAGCGGCATAAGGATAG；Lox3FTAACCAGCGTTGGGGGAA ；Lox3RCATTTATAGACGTGCGTGCA。还公开了鉴定方法以待测缺失体的大豆基因为DNA模板，将两组引物对DNA模板进行PCR扩增；若述PCR扩增产物中有424bp条带，则待测大豆基因含有Lox1，若有350bp条带，则待测大豆基因缺失Lox1；若述PCR扩增产物中有474bp条带，则待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带，则待测大豆基因缺失Lox3。本发明的优点在于提高同时对Lox1和Lox3缺失体材料的筛选效率。
文档编号C12Q1/68GK103160579SQ20131005595
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者张文明, 胡明建, 王晓波, 姚大年, 郑文寅, 司红起 申请人:安徽农业大学