专利名称：编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及ー种重组猪圆环病毒2型(PCV2) Cap蛋白的方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)的主要病原，它不但可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤(All，CT)、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征(PDNS)和呼吸道疾病综合征(PRDS)密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在2010年国际猪兽医大会(IPVS)上，猪圆环病毒感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒感染呈上升趋势。PCV2含有两个主要的开放阅读框:0RF1和0RF2，ORFl编码两种复制酶蛋白，參与病毒复制；0RF2编码核衣壳蛋白Cap，是病毒主要的免疫原性蛋白。McNeiUy等研究证实Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。0RF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。众所周知，PCV2的检测是防控PCV2相关疾病的重要组成部分。现行的PCV2检测方法包括有PCR、免疫组化、原位杂交和ELISA技术等。ELISA技术具有高特异性、敏感性，操作简单、方便易行，便于大量样品检测的优点。Cap蛋白作为PCV2主要的免疫原性蛋白，可作为PCV2 ELISA检测的诊断抗原。因此，获得高纯度的Cap蛋白是建立PCV2 ELISA检测的关键。
但是，现有技术中Cap蛋白采用真核表达系统产量低，分离纯化困难；而进行原核表达则多以无活性的包涵体形式存在，所以Cap蛋白难以规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供ー种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，易于可溶性表达。本发明的另ー目的是提供含有上述基因的重组表达载体。本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组菌，目的蛋白的表达量高，表达产物易于纯化。本发明的再一目的是提供含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，该复合物具有良好的免疫原性，生产效率高，易于纯化，制备方法简单，易于规模化生产。本发明的目的采用如下技术方案实现:
编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID N0:1所示的序列。 还含有肽聚糖锚钩PA蛋白的编码基因。所述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示。ー种含有上述基因的重组表达载体。该重组表达载体是将所述基因插入pET_32a的Nde I和Xho I两个酶切位点之间所得。
含有上述基因的重组菌。所述重组菌是将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。ー种含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，采用如下方法制备:培养所述重组菌，破碎后获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。所述纯化方法为:将乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革兰氏阳性增强基质颗粒；将革兰氏阳性增强基质颗粒加入裂解液上清中进行吸附，离心后取沉淀即得所述复合物。革兰氏阳性增强基质颗粒缩写为GEM颗粒。所述酸为盐酸；革兰氏阳性增强基质颗粒的加入量为:含有0.5 2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9个革兰氏阳性增强基质颗粒。一种所述复合物在制备猪圆环病毒疫苗和猪圆环病毒诊断试剂盒方面的应用。本发明相对于现有技术方法的有益效果:
1.本发明将猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达，解决了 Cap蛋白在真核细胞中表达量低，在原核细胞中表达无活性的难题。由于大肠杆菌原核表达系统比较成熟，所以操作简单。2.本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白含有肽聚糖锚钩蛋白PA，可以与GEM颗粒相结合，有利于后续纯化，生产成本低，易于规模化生产。3.本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。因此，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物可用于制备猪圆环病毒2型的诊断试剂盒及猪圆环病毒2型亚单位疫苗。
图1是肽聚糖锚钩PA蛋白基因PCR扩增产物电泳图，其中M为DNA Marker, I为纯水对照，2为肽聚糖锚钩PA蛋白的基因扩增产物。图2是重组质粒酶切鉴定结果，其中M为DNA Marker,泳道I为质粒PET_32a的双酶切产物；2为阳性重组质粒的双酶切产物。图3(A)和图3(B)为重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的SDS-PAGE分析图；其中M为蛋白相对分子量Marker ;图3(A)中，泳道I和2均为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA的裂解液上清；3为诱导表达的对照菌株的裂解液上清；图3 (B)中，泳道I为未诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA全菌；泳道2为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA全菌；泳道3为诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA裂解液上清；泳道4为诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA裂解液沉淀。图4:重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的Western Blot鉴定结果，其中M为蛋白相对分子量Marker ；1为诱导表达的重组表达菌株BL21_Cap_PA裂解液上清；2为诱导表达的对照菌裂解液上清。图5 (A)和图5 (B)是乳酸乳球菌MG1363和GEM颗粒的透射电镜图，其中图5 (A)为乳酸乳球菌MG1363，图5 (B)为GEM颗粒。图6是含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白相对分子量Marker，泳道I为含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，泳道2为GEM颗粒。图7 (A)和图7 (B)是GEM颗粒和含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物的电镜图，其中图7 (A)为GEM颗粒，图7 (B)为含重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。图8是各组小鼠免疫后的血清抗体水平。
具体实施例方式 肽聚糖锚钩PA蛋白是作为纯化标签而设计的，可以处于重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的N端或C端，对其表达量、抗原性及疫苗免疫后抗体水平没有影响。实施例1肽聚糖锚钩PA蛋白、Cap蛋白基因片段及原核表达质粒的构建 1.肽聚糖锚钩PA蛋白基因片段的获得
(I)引物设计
根据乳酸乳球菌MG1363的基因序列(U17696.1)，设计引物PAF (SEQ ID N0:4)和PAR(SEQ ID NO:5)，扩增其肽聚糖锚钩PA蛋白的基因片段。PAF 的序列为:5’ -ACTACTTATACCGTCAAATC-3’ ；
PAR 的序列为:5’ -TITTAITCGTAGATACTGAC-3’。(2) PCR扩增目的片段
采用常规方法培养乳酸乳球菌MG1363，收获菌体。采用RNAiso Plus (Takara)提取RNA，应用随机引物反转录成cDNA作为PCR反应模板。反转录的体系及反应程序:每份模板(3 4ug)加入随机引物1W，11.75WRnase free H2O,低速瞬离，然后在70 °C条件下保温IOmin ;再冰浴2min,低速瞬离，カロ入 2M-1 5 XM - MLV b uffer, 0.5M-1 dNTP Mix, 0.25M-1 RNase Inhibitor, 0.5M-1 ReverseTranscriptase,42°C, Ih ;接着70°C作用15min，冰浴后-20°C保存，作为cDNA模板备用。PCR 反应体系为:引物 PAF、PAR (10pmol/L)各 ll^l，MgCl2 (25mmol/L)l.5m, dNTPs(2.5mmol/L) 2.0Pl，10 X PCR buffer 2.5^1，cDNA 模板 2.0Pl，Taq 酶(5UM ) 0.2^1，灭菌双蒸水补足体积至25耵。PCR循环參数:95°C预变性5min ;94°C 45s，54°C 45s, 72 °C 45s，进行30次循环；最后72°C延伸lOmin。对照中用纯水替代cDNA。采用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定肽聚糖锚钩PA蛋白的PCR扩增产物(图1)。从图1，可以看出扩增产物大小约为585bp。回收扩增产物，克隆到PMD18-T载体，进行序列分析，肽聚糖锚钩PA蛋白的基因序列如 SEQ ID N0:2 所示(585 bp)。反转录及PCR反应中所用试剂来源TAKARA。2.Cap蛋白基因片段的获得
将PCV2 0RF2基因序列(GENEBANKii*:KC153106.1 )，截除N端41个氨基酸后进行了密码子优化，得到密码子优化的Cap蛋白基因片段，其序列如SEQ ID N0:1所示。在密码子优化的Cap蛋白基因片段5'端加CATATG，在3'端加上CTCGAG，(设计了酶切位点，利用后续的连接和酶切)，交由上海英骏生物技术有限公司合成。3.重组质粒的构建和鉴定
将肽聚糖锚钩PA蛋白的基因与密码子优化的Cap蛋白编码基因的3'端相连，得到重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其序列如SEQ ID N0:3所示。具体方法为:将肽聚糖锚钩PA蛋白的PCR扩增产物与本实施例标题2中合成的片段经T4 DNA连接酶连接，得到连接产物I。用Nde 1、Xho I对连接产物I和pET_32a进行双酶切并进行连接。双酶切体系:IOXH buffer 3^1,
Nde IIMl,
xho Im,
pET-32a或连接产物I8耵，
dH20补足体积至30M1。将双酶切反应体系在37°C条件下作用4h，然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。连接体系:
10XT4 ligase buffer 2.5M-1,pET-32a双酶切片段4 W，
连接产物I双酶切片断12.5W，
T4 DNA ligase1M-1,
dH20补足体积至25M1。将连接体系在16°C条件下连接过夜，得到连接产物2。将连接产物2转染E.coli DH5a感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37°C培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，经Nde I /Xho I双酶切鉴定，电泳后获得图2。从图2可以看出，阳性重组质粒经双酶切后，获得5366bp和1182bp两条目的条带。阳性重组质粒经测序正确后，命名为pET-32a-Cap-PA。实施例2重组表达菌株BL21-Cap-PA的构建
1.将阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)
将实施例1获得的pET-32a-Cap-PA转染大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组表达菌株BL21-Cap-PA。将空质粒pET_32a按照相同的方法转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到对照菌株。2.重组蛋白的诱导表达
(I)分别挑取重组表达菌株BL21-Cap-PA和对照菌株的单菌落，接种于含有氨苄青霉素(100^g/mL)的液体LB培养基中，37°C过夜培养。(2)取上述培养好的菌液IOW接种于4ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37°C、200rpm条件下振摇培养约3h，使0D_达到0.6 0.8。(3)向上述菌液中加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导温度为16°C，诱导时间为24h。(4)将诱导表达后的发酵液在4°C、600(te 条件下离心5min，收集菌体；将菌体用PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次后进行重悬。(5)将菌体置于冰浴中，用超声波裂解菌体，功率为200W，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液澄清。(6)将超声裂解后的菌体， 在4°C、1200(te 条件下离心lOmin，分别收集裂解液上清和裂解液沉淀。将裂解液沉淀用与上清等体积的PBS缓冲液重悬。
3.SDS-PAGE电泳分析
为了分析重组表达菌株BL21-Cap-PA和对照菌株的目的蛋白表达水平，分别取其裂解液上清和沉淀各IOOW，加入6X蛋白上样Buffer，充分混匀后95°C变性5min，上样前瞬时离心，吸取上清点样进行SDS-PAGE分析。从图3 (A)可以看出，与诱导表达的对照菌裂解液上清相比，诱导表达的重组表达菌株BL21-Cap-PA裂解液上清在46kDa处有一条明显的条带。从图3 (B)可以看出，经诱导表达后，重组表达菌株BL21-Cap-PA表达了大量的目的蛋白；目的蛋白中有一半实现了可溶性表达。实施例3重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的抗原性鉴定
1.将诱导培养的BL21-Cap-PA和对照菌的裂解液上清进行SDS-PAGE电泳；
2.转印=SDS-PAGE电泳完毕后，采用半干转印法将蛋白印迹转至PVDF膜；
3.将PVDF膜用含有5%脱脂乳的PBST封闭液封闭，置于室温条件下40min；
4.将封闭后的PVDF膜浸入1:200稀释的猪圆环病毒2型阳性血清(购自VeterinaryMedical Research & Development,美国)，4°C 鮮育过夜；
5.用PBST缓冲液洗涤PVDF膜5次，5min/次；
6.将PVDF膜浸入1:10000稀释的羊抗猪IgG-HRP (南京生兴生物技术有限公司)，室温孵育Ih ；
7.用PBST缓冲液洗涤PVDF膜5次，5min/次；
8.用DAB染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)显色,结果见图4。WesternBlot结果表明，表达的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白可以与猪圆环病毒2型阳性血清反应，具有良好的抗原性。实施例4重组猪圆环病毒2型Cap蛋白大量表达及其复合物的制备
1.重组猪圆环病毒2型Cap蛋白大量表达
按实施例2中诱导条件，诱导表达BL21-Cap-PA 200ml，离心收集菌体，加入50ml PBS缓冲液重悬菌体沉淀，超声裂解后离心，收集裂解液上清。2.GEM颗粒的制备
(1)在厌氧条件下培养乳酸乳球菌MG1363，培养基为添加0.5%葡萄糖的GM17培养基，培养温度为30°C，培养时间为16 18小时。(2)离心收集菌体:将发酵液在4000 g条件下离心5min，取菌体，用蒸馏水洗涤I次。(3)将乳酸乳球菌MG1363用原培养体积1/5的pH 1.0的盐酸重悬菌体，煮沸30min,离心取沉淀即得到GEM颗粒。(4)用PBS (pH 7.2)洗涤GEM颗粒3次后重悬，用血球计数板计数，以IOU的浓度分装(1U=2.5*109 个/ml)，_70°C保存备用。将乳酸乳球菌MG1363和GEM颗粒分别用2.5%的戊ニ醛固定，用透射电镜观察鉴定GEM颗粒，如图5 (A)和图5 (B)所示。从图5 (A)可见，乳酸乳球菌MG1363核区内有核酸；从图5 (B)可见，GEM颗粒的细胞质为均质，原有核区内的核酸和蛋白已经被去除。3.制备含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物
向诱导表达的BL21-Cap-PA裂解液上清中加入GEM颗粒，加入的量按照含有Img蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9个GEM颗粒。室温孵育30min，在12000ダ条件下离心IOmin后收集沉淀，得到含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。将该复合物进行SDS-PAGE分析，结果见图6。从图6可以看出，复合物泳道上有一条46kDa的条带，说明复合物中含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。将含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物适当稀释后，应用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)測定蛋白浓度，_4°C或-20°C保存备用。该重组Cap蛋白表达量 1.5g/L。GEM颗粒实际上是肽聚糖组成的外壳，所以含有肽聚糖锚钩PA蛋白的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够结合在GEM颗粒的表面。4.电镜观察含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物
将GEM颗粒和含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，分别用2.5%的戊ニ醛固定后，用透射电镜观察，结果如图7 (A)和图7 (B)。从这两幅图可以看出，GEM颗粒表面可以结合大量的含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。实施例5重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的小鼠免疫试验
将含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，用PBS缓冲液(pH=7.2^7.4)配制成蛋白浓度为0.5mg/mL的复合 物溶液，其中GEM颗粒的浓度为1.25 X IO9个/mL。配制GEM颗粒溶液，该溶液中GEM颗粒含量与复合物溶液相同。将复合物溶液和GEM颗粒溶液分别与铝胶佐剂等体积混合，乳化后得到复合物疫苗和GEM颗粒对照疫苗。选取5周龄清洁级ICR小鼠30只，随机分成3组，10只/组。第一组，免疫复合物疫苗；第二组，免疫GEM颗粒对照疫苗；第三组:不免作为空白对照组。免疫方法:每只小鼠，在背部皮下多点注射0.2mL疫苗。免疫后21天，将每只小鼠眼球采血分离血清，用猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒(武汉科前生物技术有限公司)检测血清抗体水平。检测时，将试剂盒中的羊抗猪IgG-HRP替换为1:10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP (南京生兴生物技术有限公司)。计算各组小鼠的平均血清抗体水平，具体结果见图8。从图8可以看出，与对照组和免疫GEM颗粒对照疫苗的小鼠相比，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物可以显著诱导小鼠产生高水平的特异性抗体0° <0.01)。因此，该复合物可以用于检测猪圆环病毒2型，或者用于制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。
权利要求
1.编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:含有SEQID N0:1所示的序列。
2.根据权利要求1所述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:还含有肽聚糖锚钩PA蛋白的编码基因。
3.根据 权利要求2所述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:其序列如SEQ ID NO:3所示。
4.ー种含有权利要求1-3之一所述基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于:该重组表达载体是将所述基因插入pET_32a的Nde I和Xho I两个酶切位点之间所得。
6.含有权利要求1-3之一所述基因的重组菌。
7.根据权利要求6所述重组菌，其特征在于:所述重组菌是将权利要求5所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。
8.ー种含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，其特征在于采用如下方法制备:培养权利要求7所述重组菌，破碎后获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。
9.根据权利要求8所述含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，其特征在于所述纯化方法为:将乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革兰氏阳性增强基质颗粒；将革兰氏阳性增强基质颗粒加入裂解液上清中进行吸附，离心后取沉淀即得所述复合物。
10.根据权利要求9所述含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，其特征在于所述酸为盐酸；革兰氏阳性增强基质颗粒的加入量为:含有0.5 2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9个革兰氏阳性增强基质颗粒。
11.一种权利要求8所述复合物在制备猪圆环病毒疫苗和猪圆环病毒诊断试剂盒方面的应用。
全文摘要
本发明提供编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用，属于分子生物学领域。编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO:1所示的序列。本发明还提供含有上述基因的重组表达载体，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。该复合物制备方法为培养重组菌，破碎获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。本发明将Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达；由于上述复合物含有肽聚糖锚钩蛋白PA，有利于后续纯化。本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。
文档编号C12P21/02GK103103205SQ20131006518
公开日2013年5月15日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者李鹏成, 郑其升, 乔绪稳, 陈瑾, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院