专利名称：一种用于转基因水稻pcr检测的重组标准质粒及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于三种转基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性和定量检测的重组标准质粒，以及含有该重组标准质粒的试剂盒。
背景技术：
自首例转基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美国批准商业化生产以来，随着转基因技术迅速发展，许多有价值的外源基因导入了植物中，越来越多的转基因作物被批准在不同国家和地区商业化种植。对水稻而言，目前有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功，转基因水稻品系:KF6、TT51和KMDl为我国拥有自主知识产权的抗虫Bt水稻，其中转基因抗虫水稻华恢I号(TT51)在2009年，我国农业部颁发了其在湖北省生产应用的安全证书。为保障在农产品进出口贸易中的利益，各国相继建立转基因标识制度，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，目前对转基因作物及其产品的检测主要有蛋白质水平检测和核酸水平检测，而由于核酸的提取、保存及稳定性等方面的优势，使得基于核酸检测的转基因检测技术得到快速发展，其中以聚合酶链式反应(PCR)技术发展得最快，转基因作物PCR检测方法又分为4个层次，分别为筛查检测、基因检测、构建特异性检测和转化体特异性检测，在日常的检测工作中，由于转基因样品量较大，转基因的筛查工作显得尤为重要，而阳性标准品的缺乏无法满足转基因安全监管中筛查工作的需求，因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用质粒标准分子具有重要的意义。阳性质粒分子的概念由日本科学家Kuribara H等于2002年提出，它是指一种含有转基因作物检测的目的外源基因和内标准基因的特异性扩增片段的线性化的重组质粒分子。阳性质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，且操作容易，同一个阳性质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，质粒DNA提取容易且纯度较高。转基因作物阳性质粒分子是转基因标准物质 的一种。开发阳性质粒分子可以有效的解决检测工作中缺乏有证标准物质和阳性材料的难题。
发明内容
本发明的目的是提供本发明的目的是提供一种为三种转基因水稻KF6(科丰6号)、TT51 (华恢I号)、KMD1 (克螟稻)的转化体特异性检测用重组标准质粒及其应用，满足转基因水稻安全监管筛查检测工作中的需求。本发明采用的技术方案是:一种用于转基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性和定量PCR检测的重组标准质粒，由如下方法获得:将SEQ ID N0.1所示的KF6侧翼序列、SEQ ID N0.2所示的TT51侧翼序列、SEQ ID N0.3所示的KMDl侧翼序列和SEQ ID N0.4所示的PLD基因依次连接获得融合片段，再将所得融合片段克隆到载体PMD18-T中，获得所述重组标准质粒，记为pMD-KTK。KF6侧翼序列如下(长度454bp):
GatcccgaaggccaacacaataggaccggaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatccagagcgatggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacggcgccggaggcacgacccggccagttaaggccaggagcgcatctgatccaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttataggctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatcccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgaTT51侧翼序列如下(长度305bp):CcggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaacccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgatttgtagagagagactggtgatttcagcgggcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccggacgagtgctggggcagataagcagtagtggtggggctacgaacatattccttttccttctggacgctaccactcatatgttccaaaattacaaatttgtcctttgtatttgttgcaattttcatgtaagaaatccaacgaggctKMDl侧翼序列如下(长度398bp):TgtggagcgtcaactgggagcttatcttattactaattagtattaccattgccattacgtctgaaacagacggggctcccatttctttttgatgtcgttagtacagccggcttcgtttttcttttctggctgtctcggctgtcacctgtcagtctcgtcagcaactggggtgttccgccgacgagggcgccgtggacttcgcgggctcgcggcgatggcgatgcgcgctccaactgcggcgggtctcaccgggctgcgtgcgtacgccgatatgcctgcccatctcgggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagcPLD基因序列如下(长度250bp):Agaccagaagacattgagccgttgcatctgattcccagagagatttctctgaagattgtgaacaagattgaagctggtgagcgttttgcag tctatgttgtgctgccaatgtggcctgaaggacctcctgctagtggatcagtgcaggcaatactggattggcagaggaggacaatggagatgatgtactatgatattgccgttgcacttgaggcgaagaggatcaatgctgacccgagggattacctta。本发明根据三个转基因水稻KF6、TT51、KMDl的转化体特异性序列及水稻内标基因PLD的序列，设计相应的引物，利用重叠PCR技术将四个序列片段融合在一起，再利用分子克隆技术将融合片段克隆到PMD18-T载体中，获得质粒分子重组标准质粒pMD-KTK。具体的，所述融合片段核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示(长度1407bp):gatcccgaaggccaacacaataggaccggaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatccagagcgatggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacggcgccggaggcacgacccggccagttaaggccaggagcgcatctgatccaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttataggctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatcccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgaccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaacccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgatttgtagagagagactggtgatttcagcgggcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccggacgagtgctggggcaga taagcagtagtggtggggctacgaacatattccttttccttctggacgctaccactcatatgttccaaaattacaaatttgtcctttgtatttgttgcaattttcatgtaagaaatccaacgaggcttgtggagcgtcaactgggagcttatcttattactaattagtattaccattgccattacgtctgaaacagacggggctcccatttctttttgatgtcgttagtacagccggcttcgtttttcttttctggctgtctcggctgtcacctgtcagtctcgtcagcaactggggtgttccgccgacgagggcgccgtggacttcgcgggctcgcggcgatggcgatgcgcgctccaactgcggcgggtctcaccgggctgcgtgcgtacgccgatatgcctgcccatctcgggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactggggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagcagaccagaagacattgagccgttgcatctgattcccagagagatttctctgaagattgtgaacaagattgaagctggtgagcgttttgcagtctatgttgtgctgccaatgtggcctgaaggacctcctgctagtggatcagtgcaggcaatactggattggcagaggaggacaatggagatgatgtactatgatattgccgttgcacttgaggcgaagaggatcaatgctgacccgagggattacctta。本发明所述重组标准质粒pMD-KTK具体可按如下方法构建:(I)利用GenBank数据库和相关文献检索,犾得水稻内标准基因PLD及转基因水稻KF6、TT51、KMDl各自的转化体特异性序列。所述的水稻内标准基因PLD，是指水稻磷脂酶D基因，在水稻基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数等特点。所述的转基因水稻KF6、TT51、KMDl的各自转化特异性序列，是指相应的转基因水稻外源插入序列与水稻基因组连接区的DNA序列。(2)根据PLD基因序列、转基因水稻KF6、TT51、KMD1的各自转化特异性序列0 应的序列见图2所示)，设计重叠PCR引物，对转基因水稻KF6、TT51、KMDl阳性标准品的基因组DNA进行PCR扩增。所述的重叠PCR引物，是指与转基因水稻KF6、TT51、KMDl的各自转化特异性序列及水稻内标准基因PLD的序列完全相同或者互补的引物，使各目的片段达到无缝连接。所述的转基因水稻KF6、TT51和KMDl阳性标准品，是指转基因含量为100%的转基因水稻KF6、TT51和KMDl的阳性标准品粉末。(3)特异性扩增转基因水稻KF6转化体序列。所述特异性扩增是指利用设计的特异性引物扩增转基因水稻KF6的转化体特异性序列，引物分别为:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；KF6-R-add:tatcccgtattgacgccggTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG ；特异性扩增转基因水稻TT51转化体序列。所述特异性扩增是指利用设计的特异性引物扩增转基因水稻TT51的转化体特异性序列，引物分别为:TT51-F-add:ttctttgccctcggacgaCCGGCGTCAATACGGGATAAT ；TT51-R-add:ccagttgac gctccacaAGCCTCGTTGGATTTCTTACA ；特异性扩增转基因水稻KMDl转化体序列。所述特异性扩增是指利用设计的特异性引物扩增转基因水稻KMDl的转化体特异性序列，引物分别为:KM-F-add:aagaaatccaacgaggctTGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ；KM-R-add:ctcaatgtcttctggtctGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT ；特异性扩增水稻内标准基因PLD序列。所述特异性扩增是指利用设计的特异性引物扩增水稻内标准基因
PLD的序列，弓丨物分别为: PLD-F-add: gtgagacgggcaacagcAGACCAGAAGACATTGAGCCG ；PLD-R: TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG ；(4)转基因水稻KF6的转化体特异性序列与转基因水稻TT51的转化体特异性序列的拼接。所述的拼接，指的是将获得的转基因水稻KF6的转化体特异序列的PCR产物与转基因水稻TT51的转化体特异性序列的PCR产物共同作为模板，利用重叠PCR将KF6与TT51的特异序列连接在一起(KF6+TT51)，所用引物为:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；TT51-R-add:ccagttgacgctccacaAGCCTCGTTGGATTTCTTACA ；转基因水稻KMDl的转化体特异性序列与水稻内标准基因PLD的特异性序列的拼接。所述的拼接，指的是将获得的转基因水稻KMDl的转化体特异性序列的PCR产物与PLD的PCR产物共同作为模板，利用重叠PCR将KMDl与PLD的特异序列连接在一起(KMD1+PLD)，所用引物为:KM-F-add:aagaaatccaacgaggctTGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ；PLD-R: TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG ；
完整重组片段的拼接。所述的拼接，是指再将获得的(KF6+TT51)与(KMD1+PLD)的产物共同作为模板，利用重叠PCR将它们连接在一起，完成KF6+TT51+KMD1+PLD的融合连接，所用引物为:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；PLD-R: TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG ；(5)新的重组DNA片段的质粒分子克隆。所述的分子克隆，指的是将上述得到的重组特异性DNA片段连接到质粒载体PMD18-T上，获得转基因标准阳性质粒分子pMD-KTK，获得的质粒分子的外源全序列见图2。(6)构建的重组标准质粒的定性和定量PCR验证。所述的定性PCR验证，是指用定性PCR方法验证构建的重组标准质粒pMD-KTK中能扩增出水稻内标准基因PLD特异序列以及转基因水稻KF6、TT51、KMD1各自的转化体特异性序列，且pMD-KTK中各特异性序列的检测灵敏度能满足定性PCR检测的要求。所述的定量PCR验证，是指用定量PCR方法分析构建的重组标准质粒pMD-KTK中水稻内标准基因PLD和转基因水稻KF6、TT51、KMDl各自的转化体特异性序列的检测极限、定量极限以及重复性、重演性等特性，以鉴定该重组标准质粒替代转基因水稻KF6、TT51、KMDl基质阳性标准品的能力，并利用重组标准质粒pMD-KTK对已知含量的转基因水稻样品进行定量分析，进而验证该重组标准质粒在转基因水稻KF6、TT51、KMD1样品实际检测中的有效性。本发明还涉及所述的重组标准质粒在转基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性和定量PCR检测中的应用。本发明还涉及一种用于转基因水稻KF6、TT51、KMDl的定性PCR检测的试剂盒，主要包括所述的重组标准质粒以及特异性引物；所述特异性引物序列如下:KF6侧翼序列特异性引物:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；KF6-R: TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG ；TT51侧翼序列特异性引物:TT51-F: CCGGCGTCAATACGGGATAAT ；TT51-R:AGCCTCGTTGGATTTCTTACA ；KMDl侧翼序列特异性引物:KM-F: TGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ；KM-R:GCTGTTGCCCGTCTCACTGGT ；PLD基因特异性引物:PLD-F:AGACCAGAAGACATTGAGCCG ；PLD-R:TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG。本发明还涉及一种用于转基因水稻肝6、1751、腸01的定量PCR检测的试剂盒，主要包括所述重组标准质粒以及特异性引物和探针；所述特异性引物和探针序列如下:
KF6侧翼序列特异性引物和探针:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；KF6-R: TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG ；KF6-107P:FAM-ACGACCCGGCCAGTTAAGGCCA-TAMRA ；TT51侧翼序列特异性引物和探针:TT51-F: CCGGCGTCAATACGGGATAAT ；TT51-R:AGCCTCGTTGGATTTCTTACA ；TT51-120P:FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQI ；KMDl侧翼序列特异性引物和探针:KM-F: TGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ；KM-R:GCTGTTGCCCGTCTCACTGGT ；KM-P:FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-TAMRA ；PLD基因特异性引物和探针:PLD-F:AGACCAGAAGACATTGAGCCG ；PLD-R: TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG ；TMOI3:FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQI。该试剂盒的关键在于重组标准质粒和特异性引物的设计，试剂盒中其他组成，例如PCR反应试剂，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCUMgCl2等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物混合，再加入待测样品或标准品，即可进行PCR扩增反应，PCR扩增产物用2%的琼脂糖跑胶，若样品的PCR扩增产物出现250bp条带，表示待测样品含有水稻成分(否则不含有水稻成分)；进一步，若同时出现250bp和454bp的条带，则可判断含有转基因水稻KF6成分；若同时出现250bp和305bp的条带，则可判断含有转基因水稻TT51成分；若同时出现250bp和398bp的条带，则可判断含有转基因水稻KMDl成分。为达到定量检测的要求，可首先以标准质粒分子pMD-KTK为校准品，使用特异性引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR扩增，制作水稻内标准基因PLD标准曲线和转基因水稻KF6、TT51、KMD1的各自转化体特异性标准曲线；提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，代入标准曲线，计算出样品的起始拷贝数，然后根据转基因水稻的转化体事件的拷贝数与水稻内标准基因的拷贝数之比，即可得到样品中转基因水稻KF6/TT51/KMD1的百分含量。本发明利用重叠PCR和分子克隆技术首次构建了含有水稻内标准基因PLD以及同时含有三个转基因水稻KF6、TT51、KMDl的各自转化体特异性序列的重组标准质粒pMD-KTK。本发明重组标准质粒可以替代转基因水稻KF6、TT51和KMDI的阳性标准品，用于对转基因水稻KF6、TT51、KMDl转化体特异性定性和定量PCR检测，很好地解决了转基因水稻KF6、TT51、KMD1在检测过程中阳性标准品匮乏的问题。该重组标准质粒在实际检测中具有特异性好、灵敏度高等优点，应用该重组标准质粒进行实际样品定量分析时，样品检测结果的偏差在国际上广泛认可的允许范围内。因此，本发明构建的重组标准质粒PMD-KTK完全适用于对转基因水稻KF6、TT51、KMDl及其产品中转化体成分的定性和定量PCR检测。
图1为本发明构建的标准质粒分子pMD-KTK的示意图；图2为本发明构建的标准质粒分子pMD-KTK的全部外源序列，其中KF6、TT51、KMD1和PLD分别代表转基因水稻KF6、TT51、KMD1各自的转化体特异性序列及水稻内标准基因的特异序列；阴影部分序列为重叠PCR引物中的重叠部分；实线尖头序列部分重叠PCR引物和定性PCR引物；虚线尖头序列为定量PCR引物，实线无尖头序列为探针；图3为本发明中构建的标准质粒各个元件的荧光定量的扩增曲线与标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:重组标准质粒pMD-KTK的构建一、实验材料转基因水稻KF6、TT51 和 KMDI。二、实验试剂pMD18-T载体、ExTaq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；水稻基因组提取试剂盒及定量PCR试剂盒购自上海英俊生物工程技术服务有限公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5a感受态菌株购自北京全式金生物技术有限公司；生化试剂购自上海生工生物技术有限 公司；引物由上海英俊生物工程技术服务有限公司合成。三、主要仪器设备PCR仪(德国Biometra)、凝胶成像系统(美国GE)、UltrospecllOOpro紫外分光光度计(美国GE)、其他仪器包括:恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。四、实验方法和过程1、重叠PCR引物设计利用GenBank及相关文献资料查询获得水稻内标准基因PLD、转基因水稻KF6、TT51和KMDl的各自转化体特异性序列；利用Primer Premier5软件，设计四对重叠PCR引物，分别用于扩增水稻内标准基因PLD、转基因水稻KF6、TT51和KMDl转化体特异性序列。引物序列见表I。表1:构建标准质粒分子pMD-ΚΤΚ的重叠PCR引物
权利要求
1.一种用于转基因水稻肝6、1751、腸01的定性和定量PCR检测的重组标准质粒，由如下方法获得:将SEQ ID N0.1所示的KF6侧翼序列、SEQ ID N0.2所示的TT51侧翼序列、SEQID N0.3所示的KMDl侧翼序列和SEQ ID N0.4所示的PLD基因依次连接获得融合片段，再将所得融合片段克隆到载体PMD18-T中，获得所述重组标准质粒，记为pMD-KTK。
2.如权利要求1所述的重组标准质粒，其特征在于所述融合片段核苷酸序列如SEQIDN0.5所示。
3.如权利要求1所述的重组标准质粒在转基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量PCR检测中的应用。
4.一种用于转基因水稻肝6、1751、腸01的定性PCR检测的试剂盒，主要包括权利要求1所述的重组标准质粒以及特异性引物；所述特异性引物序列如下: KF6侧翼序列特异性引物:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；KF6-R:TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG ； TT51侧翼序列特异性引物:TT51-F:CCGGCGTCAATACGGGATAAT ；TT51-R:AGCCTCGTTGGATTTCTTACA ； KMDl侧翼序列特异性引物:KM-F:TGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ； KM-R:GCTGTTGCCCGTCTCACTGGT ； PLD基因特异性引物:PLD-F:AGACCAGAAGACATTGAGCCG ；PLD-R:TAAGGTAATCCCTCGGGTCAGo
5.一种用于转基因水稻肝6、1751、腸01的定量PCR检测的试剂盒，主要包括权利要求1所述的重组标准质粒以及特异性引物和探针；所述特异性引物和探针序列如下: KF6侧翼序列特异性引物和探针:KF6-F:GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG ；KF6-R:TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG ；KF6-107P:FAM-ACGACCCGGCCAGTTAAGGCCA-TAMRA ； TT51侧翼序列特异性引物和探针:TT51-F:CCGGCGTCAATACGGGATAAT ；TT51-R:AGCCTCGTTGGATTTCTTACA ；TT51-120P:FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQ1 ； KMDl侧翼序列特异性引物和探针:KM-F:TGTGGAGCGTCAACTGGGAGC ；KM-R:GCTGTTGCCCGTCTCACTGGT ；KM-P:FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCG-TAMRA ； PLD基因特异性引物和探针:PLD-F:AGACCAGAAGACATTGAGCCG ；PLD-R:TAAGGTAATCCCTCGGGTCAG ；TM013:FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1。
全文摘要
本发明提供了一种用于转基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量PCR检测的重组标准质粒，由如下方法获得将SEQ ID No.1所示的KF6侧翼序列、SEQ ID No.2所示的TT51侧翼序列、SEQ IDNo.3所示的KMD1侧翼序列和SEQ ID No.4所示的PLD基因依次连接获得融合片段，再将所得融合片段克隆到载体pMD18-T中，获得所述重组标准质粒，记为pMD-KTK。该重组标准质粒可以替代转基因水稻KF6、TT51和KMD1的阳性标准品，用于对转基因水稻KF6、TT51、KMD1转化体特异性定性和定量PCR检测，具有特异性好、灵敏度高等优点，应用该重组标准质粒进行实际样品定量分析时，样品检测结果的偏差在国际上广泛认可的允许范围内，很好地解决了转基因水稻KF6、TT51、KMD1在检测过程中阳性标准品匮乏的问题。
文档编号C12Q1/68GK103146824SQ201310065279
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者徐俊锋, 陈笑芸, 汪小福, 缪青梅, 朱妍晴, 朱青 申请人:浙江省农业科学院