专利名称：塔宾曲霉szx-6及其发酵液和发酵液提取物与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种塔宾曲霉(Aspergillus
本发明还涉及该菌株的发酵液以及发酵液的提取物，本发明还涉及该发酵液以及发酵液提取物的用途。
背景技术：
自从上世纪50年代Newton等从海洋真菌Cephalosporium acremonium的发酵产物中发现抗菌化合物cephalosporin C以来,海洋微生物抗菌活性物质的研究日益成为药物研究的热点领域。海洋真菌迥异于陆生真菌的独特生存环境(如寡营养、高盐、弱碱性等)使海洋真菌形成特殊的代谢和防御体系，从而能够产生不同于陆生真菌的结构特异和活性优良的次生代谢产物。到目前为止，已从海洋真菌的发酵产物中发现了一千多种新的次生代谢产物，结构类型涉及生物碱、聚酮、大环内脂和萜类等，这些代谢产物呈现出良好的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。近十几年来，我国水产品养殖业发展迅速，水产品产量居世界首位，但也不断出现各种动物疾病。獲弧菌(Vibrio <3/ 讲/77<3/ )、副溶血弧菌{Vibrio parahaemolyti cus) >嗜水气单胞菌(Aoromorms、哈维氏弧菌{Vibrio harveyi)和霍乱弧菌{Vibrio cholerae)等是引起养殖动物疾病的主要病原细菌。水产养殖中抗菌药物的长期使用或滥用所引起的致病菌耐药性、高残留和环境污染问题日益严重。因此，开发新的高效、广谱和低污的水用抗生素具有重要的意义
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的塔宾曲霉SZX-6菌株。本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述塔宾曲霉SZX-6菌株的发酵液及发酵液提取物。本发明所要解决的再一个技术问题是提供上述塔宾曲霉SZX-6菌株的发酵液及其提取物的用途。本发明是一种塔宾曲霉QAspergi I Ius tubingensis ) SZX-6 CCTCC NO:M2012540。本发明所涉及的菌株塔宾曲霉tubingensis ) SZX-6,已于2012年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2012540，保藏地址:中国武汉市武汉大学，电话027-68754052。本发明还公开了一种塔宾曲霉SZX-6发酵液，其特点是，该发酵液以所述的塔宾曲霉SZX-6发酵获得，发酵方法为:将塔宾曲霉SZX-6菌种接种到海水沙氏液体培养基中，160 r/min, 28°C培养7 d，获得塔宾曲霉SZX-6发酵产物，滤除菌丝体后获得发酵液；所述的海水沙氏液体培养基的组成为:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陈海水定容。本发明还公开了一种塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物，其特点是，该提取物以上述技术方案所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液为原料，依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。本发明所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液或者塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物具有显著的抑菌用途，其可以抑制的菌为鳗弧菌{Vibrio、副溶血弧菌{Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水气单胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈维氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍乱弧菌(Yibrio cholerae)。本发明所述的塔宾曲霉SZX-6是从海水养殖动物三疣梭子蟹共附生微生物中分离得到。其分离纯化方法为:将三疣梭子蟹用无菌剪子剪碎，加入无菌水制成悬液，取0.1mL均匀涂布沙氏固态培养基中，28°C恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化。所述沙氏固态培养基是将4% (W/V)葡萄糖、1% (W/V)蛋白胨和2% (W/V)琼脂加热溶解后，力口陈海水定容，在121°C灭菌20 min后获得。本发明塔宾曲霉SZX-6的生物学形态描述为:在海水沙氏培养基上生长迅速，28°C培养7天，菌落直径可达65-70 mm，质地绒毛状，菌丝初生时为白色，渐变为棕、黑色，无渗出液，反面黄褐色，如图1所示；在光学显微镜和扫描电镜下观察，菌丝有横隔，分生孢子头呈球形，褐黑色；顶囊膨大，顶囊上放射状密生着两轮小柄；分生孢子柄无色透明；分生孢子呈椭圆形，褐黑色，表面不光滑，有小刺，串生，如图2、3所示。本发明所述的塔宾曲霉SZX-6的遗传性特征如下:属海洋真菌,其ITS序列已在Genbank登录,登录号为JX287371。该序列与NCBI核酸数据库(Genbank http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/) BLAST比对结果显示,该序列与曲霉属真菌(Aspergillus sp.)的ITS序列具有很高的同源性， 其中与菌株tubingensis A1KA> A.tubingensis wxm77(序列号分别为AM745112214443.1和HM037959)的ITS序列同源性为99%，在以N-J法构建的系统发育树上聚为同一簇群。与现有技术相比，本发明的塔宾曲霉SZX-6菌株的发酵液、发酵液的提取物均具有抗菌活性的特征。因此，其发酵液、发酵液的提取物可用于抗菌药物，或可用于提取分离具有抗菌活性的化合物来开发抗菌药物。
图1为塔宾曲霉SZX-6菌株的菌落形态 图2为塔宾曲霉SZX-6菌株的产孢结构 图3为塔宾曲霉SZX-6菌株的分生孢子 图4为塔宾曲霉SZX-6菌株的发酵液和发酵液提取物对主要水产病原菌的抑制活性图。
具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种塔宾曲霉 QAspergiIIus tubingensis ) SZX-6 CCTCC NO:M2012540。实施例2，一种塔宾曲霉SZX-6发酵液，该发酵液以实施例1所述的塔宾曲霉SZX-6发酵获得，发酵方法为:将塔宾曲霉SZX-6菌种接种到海水沙氏液体培养基中，160r/min, 28°C培养7 d，获得塔宾曲霉SZX-6发酵产物，滤除菌丝体后获得发酵液；所述的海水沙氏液体培养基的组成为:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陈海水定容。实施例3，一种塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物，该提取物以实施例2所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液为原料，依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。实施例4，实施例2所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液以及实施例3所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物的抗菌实验。1.抗菌活性指示菌液制备:将鳗弧菌{Vibrio anguillarum )、副溶血弧菌{Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水气单胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈维氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍乱弧菌{Vibrio cholerae)分别以无菌水制成孢子悬液(IO7个/mL)。将孢子悬液按5%接种量接种到已灭菌的内含200 mL牛肉膏蛋白胨培养基的500 mL三角瓶中，于温度37°C、转速160 r/min的恒温振荡培养箱中，振荡培养I天，获得指示菌液。2.抑菌活性测试:将 熔化后冷却至45_50°C的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒入90.00 mm平板中，每板倒20 mL左右，放置冷却至凝固。分别于每个平板上涂抹100 μ L指示菌液，放置30 min。然后在平板上放好牛津杯，将100 μ L发酵液或发酵液提取物加入孔中。37°C培养箱中培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，活性大小以抑菌圈直径(mm)表不。结果见图4。实验表明:塔宾曲霉SZX-6发酵液及发酵液提取物(乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物)对5种主要水产病原菌鳗弧菌、Vibrioanguillarum)、Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水气单胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈维氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍乱弧菌(Jibrio cholerae)均具有显著的抑制活性,按抑菌活性大小排序为发酵液 > 萃余物 > 乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物。因此，塔宾曲霉SZX-6发酵液、发酵液的提取物可用于抗菌药物，或可用于提取分离具有抗菌活性的化合物来开发抗菌药物。
权利要求
1.一种塔宾曲霉tubingensis) SZX-6 CCTCC NO:M 2012540。
2.一种塔宾曲霉SZX-6发酵液，其特征在于，该发酵液以权利要求1所述的塔宾曲霉SZX-6发酵获得，发酵方法为:将塔宾曲霉SZX-6菌种接种到海水沙氏液体培养基中，160r/min, 28°C培养7 d，获得塔宾曲霉SZX-6发酵产物，滤除菌丝体后获得发酵液；所述的海水沙氏液体培养基的组成为:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陈海水定容。
3.一种塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物，其特征在于，该提取物以权利要求2所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液为原料，依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。
4.权利要求2所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液或者权利要求3所述的塔宾曲霉SZX-6发酵液提取物的抑菌用途，所述的菌为鳗弧菌{Vibrio、副溶血弧菌(KiArioparahaemolyticus)、嗜水气单胞菌{Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和霍乱弧菌{Vib rio cholera^)。
全文摘要
本发明是一种塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)SZX-6 CCTCC NOM2012540。本发明还公开了塔宾曲霉的发酵液及发酵液的提取物。塔宾曲霉的发酵液及发酵液的提取物对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)具有明显的抑制效果，因此，其发酵液、发酵液的提取物可用于抗菌药物，或可用于提取分离具有抗菌活性的化合物来开发抗菌药物。
文档编号C12P1/02GK103114046SQ20131006588
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者郭雷, 朱成文, 许福泉, 刘玮炜, 陈丽 申请人:淮海工学院