专利名称：氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用的制作方法
氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用技术领域
本发明属于微生物农药领域，具体涉及氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用；以及利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法；此外还涉及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是土壤中一类比较重要的生防微生物群体，能够防治多种植物病害(何礼远.生物防治通报，1985，1(3):28-31 ；Yu G Y等，SoilBiology and Biochemistry.2002，34:955-963)。芽孢是芽孢杆菌在发酵后期产生的一类抗逆性较强的休眠体(沈萍等，微生物学，高等教育出版社.2006，55-60)，常被作为有效成分制作成微生物农药，但是相对于化学农药，以芽孢为有效成分的微生物农药货架期相对较短，而芽孢的耐热能力是影响其货架期的主要因素之一。
芽孢的耐热性能除了受相关基因的控制外，外界环境中金属离子、温度、酸碱度等均能影响芽孢的形 成与性能，其中金属离子Ca2+、Mn2+、Fe2+对芽孢的耐热性能有不同程度的提高效果(Granger A C等.Applied and EnvironmentalMicrobiology.2011，77(1):32-40)。因此，提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热性是延长相应的微生物农药货架期的有效途径之一。发明内容
针对枯草芽孢杆菌微生物农药货架期短的问题，本发明目的在于提供氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。
本发明另一目的在于提供利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法。
本发明第三目的在于提供一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂。
本发明第四目的在于提供上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。
本发明的目的通过以下的技术方案实现:
氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。
本发明利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每IOOmL发酵培养基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2 ;其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每IOOmL发酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2 ;其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0X IO9 1.0X IOltl个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90%。
所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如BAB-K2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC N0.2099)ο
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中，其所述的发酵液按照如下方法制备:
(I)菌种活化
将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板上划线，然后在28V 32°C下培养20 24小时，得活化菌种；
(2)种子液制备
按照将一接种环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30°C 32°C、170 210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液；
(3)发酵液制备
按照体积百分比为3% 5%的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min条件下振荡培养40 50h，得发酵液。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.2%，其余为水。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，其余为水。
上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
本发明一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，按照如下方法制备:向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。
上述枯草芽孢杆菌菌剂,按照每IOOmL发酵培养基中添加0.1g 0.3gMgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2 ;其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%, NaNO31% 2%, K2HPO40.2% 0.4%,MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
上述枯草芽孢杆菌菌剂，按照每IOOmL发酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2 ;其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0X IO9 1.0X 101°个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90%。
所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如BAB-K2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC N0.2099)ο
上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵液，按照如下方法制备:
(I)菌种活化
将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在28 32°C下培养20 24小时,得活化菌种；
(2)种子液制备
按照一接种环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30°C 32°C、170 210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液；
(3)发酵液制备
按照体积百分比为3% 5%的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min条件下振荡培养40 50h，得发酵液。
所述的枯草芽孢杆菌可以是BAB-1 (2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.2099)。
上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。
上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.2%，其余为水。
上述枯草芽孢 杆菌菌剂中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，其余为水。
上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%, NaNO31% 2%, K2HPO40.2% 0.4%,MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。
上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每IOOmL发酵培养基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2 ;其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每IOOmL发酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2 ;其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0X IO9 1.0X IOltl个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90%。
上述制备方法中所述的枯草芽孢杆菌发酵液，按照如下方法制备:
(I)菌种活化:将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在28°C 32°C下培养20 24小时，得活化菌种；
(2)种子液制备:按照将一接种环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基的比例将活化的菌种接种于种子液培养基中，在30°C 32°C、170 210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液；
(3)发酵液制备:按照体积百分比为3% 5%的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30°C 32。。、ρΗ7.0 7.5、170 210r/min条件下振荡培养40 50h，得发酵液。
上述制备方法中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。
本发明芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂按照本领域技术人员熟知的方式可以制备成悬浮剂、可湿性粉剂、泡腾片剂、颗粒剂等农药剂型。
本发明具有的优点和有益效果为:与现有的枯草芽孢杆菌菌剂相比，本发明通过向发酵培养液或发酵培养基中添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；本发明枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。
图1.发酵液中添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。
图2.发酵培养基中添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明作进一步的说明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。
实施例1增强枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的金属离子筛选试验
(I)将保存在_80°C冰箱的枯草芽孢杆菌BAB-1菌种(2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCCN0.2099)在LB培养基固体平板中划线，将平板置于30°C培养箱中活化培养24h，得活化菌种。
(2)用接种环挑取一环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基(种子液培养基的组成成分及其重量比为:葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水IOOOmL)中，在31°C、180r/min条件下振荡培养12h,得到种子液。
(3)按照体积百分比为4%的比例将种子液接种到发酵培养基(发酵培养基的组成成分及其重量比为:葡萄糖20g，可溶性淀粉40g，蛋白胨lg，NaNO3IOg, K2HP043g,MgSO4.7H201g, CaCO3Ig,水 IOOOmL)中，在 31°C、180r/min 条件下振荡培养 48h，得发酵液。
(4)取样10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于90%时，停止发酵；
(5)取5份相同体积的发酵液，按照0.2g/100mL的比例向发酵液中分别添加金属离子:NaCl、CaCl2、MgCl2、MnS04、FeSO4,以不添加任何金属离子的处理作为对照(CK)。
(6)将各处理发酵液置于54°C培养箱中静置14d。
(7)将各处理发酵液取出，分别取ImL样品，用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至10'将LB培养皿分为四个区，每区点20yL稀释液。培养皿置于35°C培养8h，计数每区菌落，以10-40个菌落浓度为宜，并计算出每mL发酵液中芽孢的数量，比较不同金属离子处理的发酵液芽孢存活数量
芽孢数量=(A1+A2+A3+A4)/ 4X10nX50 (单位:f/mL)。
其中A1、A2、A3、A4为培养皿各区的菌落数，η为稀释倍数。
(8)结果(见表I) 54°C处理7d后对照的芽孢数量为6.1XlO9, NaCl、CaCl2、MnSO4和 FeSO4 处理的芽孢数量分别为 6.0 X 109，5.5 X IO9,6.0 X IO9,6.2 X IO9,6.2 X 109，而 MgCl2处理的芽孢数量为8.4X 109，显著高于对照和其他金属离子处理的芽孢数量，说明NaCl，CaCl2, MnSO4和FeSO4对枯草芽孢杆菌芽孢耐热性基本没有影响，而MgCl2能够显著提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热能力。
表I不同金属离子对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的试验结果
权利要求
1.氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。
2.利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，其特征在于向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于按照每IOOmL发酵培养基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2 ;其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%, NaNO31% 2%，K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%,其余为水。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于按照每IOOmL发酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2 ;其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0X109 1.0X 101°个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90%。
5.按照权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的发酵液按照如下方法制备: (1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板上划线，然后在28°C 32°C下培养20 24小时，得活化菌种； (2)、按照将一接种环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30°C 32°C、170 210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液； (3)、按照体积百分比为3% 5%的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30°C 32°C、pH7.0 7.5、170 210r/min条件下振荡培养40 50h，得发酵液。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为:酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.2%，其余为水；所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，其余为水；所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为:葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%，NaNO31% 2%，K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
7.—种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于按照如下方法制备:向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。
8.按照权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于按照每IOOmL发酵培养基中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2 ;其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为: 葡萄糖2% 2.5%，可溶性淀粉3% 5%，蛋白胨0.1% 0.2%，NaN03l% 2%, K2HPO40.2% 0.4%, MgSO4.7Η200.1% 0.2%, CaCO30.05% 0.15%，其余为水。
9.按照权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于按照每IOOmL发酵液中添加0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2 ;其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0X IO9 1.0X IOltl个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90%。
10.按照权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于所述的发酵液，按照如下方法制备: (1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在28 32°C下培养20 24小时,得活化菌种； (2)、按照一接种环活化菌种接种于IOOmL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30°C 32°C、170 210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液；(3)、按照体积百分比为3% 5%的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30°C 32°C、 pH7.0 7.5、170 210r/min条件下振荡培养40 50h，得发酵液。
全文摘要
本发明公开了氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用，属于微生物农药领域。本发明还公开了利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，以及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，主要是向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，添加比例为每100mL发酵培养基或发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl2。本发明添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；其次，本发明枯草芽孢杆菌菌剂的货架期长。
文档编号C12N1/38GK103146634SQ20131007907
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者马平, 李社增, 鹿秀云, 郭庆港, 张晓云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所