专利名称：生产γ-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途。
背景技术：
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)最初由Kinoshita及其同事在土壤环境中分离得到，呈短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或成八字排列，菌体0.7 0.9X 1.0 2.5微米，革兰氏阳性，无芽孢，不运动、菌落湿润、圆形，广泛存在于土壤、沟水、堆肥中及食品厂、酿酒厂、酱油厂、味精厂周围。在生物素限制、添加Tween40或盘尼西林等条件下，C.glutamicum通过磷酸烯醇式丙酮酸糖转运系统(PTS系统)利用葡萄糖、果糖、甘露糖和蔗糖作为碳源和能源用于生长和产谷氨酸(DominguezH,Lindley ND.Complete sucrose metabolism requires fruetose phosphotransferaseactivity in Corynebacterium glutamicum to ensure Phosphorylation in liberatedfructose.Appl Environ Microbiol, 1996，62:3878-3880.)DY-聚谷氨酸(Poly γ-glutamic acid, γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体以Y-羧基与α-氨基以肽键的形式缩合而成的一种均聚氨基酸化合物，结构式如图1，分子量一般在100 IOOOkDa之间，相当于500 5000个左右的谷氨酸单体。作为一种生物高分子材料，Y-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点，因此Y-PGA及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等领域具有广泛的应用前景。Y-PGA具有良好的生物亲和性和生物降解性，可作为药物载体提高药物缓释性、靶向性和水溶性，降低药物毒副作用，是一类理想的可生物降解的医药用高分子材料(Duburel P, DekieLjSchacht E.Poly-l-glutamic acid derivatives as multifunctional vectors forgene delivery.Part A.Synthesis and physicochemical evaluation.Biomacromolecules, 2003,4(5):1168-1176.)。Y-PGA优良的生物相容性、生物降解性及无毒无污染性，使其在污水处理、食品工业、日用品工业及化工领域也具有良好的应用(Choi HJj Yang R, KuniokaM.Synthesis and characterization of pH-sensitive and biodegradable hydrogelsprepared by gamma irradiation using microbial poly (gamma-glutamic acid)andpoly (epsilon-lysine).Appl Polym Sci，1995，58:807-814.) 近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了 Y -PGA产业化研究和探索的进程。早在1937年由研究人员首次在炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的细胞荚膜中发现 Y -PGA( Ivnaovics G and Bruckner V.Chemishe undimmunologiche studieniiberden Mechanismus der milzbrandinfektin und immunitat;die chemische Strukturder Kapselsubstanz des Milzbrandbazillus und der serologisch identischenspezifischen Subtanz des Bazillus mesentericus.Z.1mmunitatsforschj 1937，90:304-318.)，此后微生物发酵法生产Y-PGA成为最具有工业化前景的生产方法。目前国内外主要选用以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)为代表的微生物发酵法来生产Y-PGA。Kubota 等人(Kubota H.Production of poly ( y -glutamic acid)by Bacillussubtilis F-201.Biosci Biotechnol Biochem, 1993，57:1212-1213.)从土壤中分离得到一株B.subtilis F-201,其最高产量在最佳发酵条件下可达到50g/L,该菌株已经被日本明治制果株式会社(Meiji Seika Kaisha)成功用于工业化大规模生产γ-PGA。Ogawa等 A (Ogawa Y, Yamaguchi F，Yuasa K,Tahara Y.Efficient production of Y-polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto)in jar fermenters.Biosci BiotechnolBiochem, 1997，61:1684-1687.)对 B.subtilis MR141 进行发酵培养条件优化，使 Y -PGA最大产量达到 35g/L。Yoon 等(Yoon SH, Do JH, Lee SY, Chang HN.Production ofpoly-y-glutamic acid by fed—batch culture of Bacillus licheniformis.BiotechnolLett, 2000, 22(7):585-588.WfBacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养方法，在2.5L发酵罐中发酵35小时后Y -PGA产量达到39g/L。此外，Y -PGA生产菌株还有B.subtilis IF03335、B.subtilis IF03336等。目前研究较多的Y-PGA生产菌株都是谷氨酸依赖型菌株，需要在培养基中加入谷氨酸或谷氨酸盐才能合成Y -PGA，因此在生产过程中降低成本及提高产量，是Y -PGA研究领域的重要课题之一。在筛选优质Y-PGA生产菌株方面，与传统诱变育种相比，基因工程定向育种手段有望成为提高Y-PGA产量的有效改造方式，近年来大量研究工作围绕Y-PGA合成酶复合体的研究展开。Ashiuchi 等人(Ashiuchi M, Soda K, Misono H.A poly- Y -glutamatesynthetic system of Bacillus subtilis IF03336:gene cloning and biochemicalanalysis of poly-y-glutamate produced by Escherichia coli clone cells.BiochemBiophys Res Cornrnun, 1999，263 (I): 6-12.)发现 B.subtilis 中关键的 γ-PGA 合成系统为Y-PGA合成酶(Poly Y-glutamate synthetase,简称Y-PGS)复合体,该酶复合体(PgsBCA)由三种酶组分PgsB、PgsC和PgsA构成，它们分别由pgsB、pgsC和pgsA三段基因负责编码，开读框大小分别为1182bp、450bp和1143bp。研究证实，酶组分PgsA负责Y-PGA合成后的跨膜转运；酶组分PgsB是重要的Y-酰胺连接酶，用于连接形成Y-PGA，该酶具有谷氨酸依赖的ATP水解酶特征；酶组分PgsC的功能尚不十分清楚(Ashiuchi M, MisonoH.Biochemistry and molecular genetics of poly-gamma-glutamate synthesis.Appl Microbiol Biotechnol, 2002，59 (I): 9-14.)。Jiang 等人(Jiang H, Shang L, YoonSH.0ptimal production of poly-y-glutamic acid by metabolically engineeredEscherichia col1.J Biotechnol Lett, 2006，28:1241-1246.)将 γ-PGS 编码基因 pgsBCA串联在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达，使E.coli BL21(DE3)能够合成最高产量的γ-PGA。尽管目前在Y-PGA的发酵生产方面取得了较大进展，但是由于γ-PGA合成中关键酶(PgsBjP Y-酰胺连接酶)的活性需要依赖谷氨酸，在发酵生产过程中需不时地添加谷氨酸，所以高效低成本生产Y -PGA仍有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能生产Y -PGA的生产Y -聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途。本发明的技术解决 方案是:一种生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征是:是以野生型C.glutamicum ATCC13869为出发菌株，转入含有Y-PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。—种生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:包括下列步骤:(I)构建含有Y -PGA合成酶基因pgsB、pgsC和pgsA的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将pgsBCA基因插入E.coli/和C.glutamicum穿梭载体pEKEx2，得到的重组质粒pEKEx2 - BCA ； (2)将步骤(I)构建的重组表达质粒转化入C.glutamicum ATCC13869中。所述重组质粒为pEKEx2 - BCA,该质粒是通过如下方法得到的:以枯草芽孢杆菌TKPGO11基因组为PCR模板，分别PCR扩增pgsB、pgsC和pgsA，然后装入E.coli/C.glutamicum穿梭载体pEKEx2中，得到重组质粒pEKEx2 — BCA。所述PCR扩增的引物为:正义链1:5，_gttgttggatccatgtggttactcattatagcctgtg_3，(下划线为 BamHI 酶切位点)，反义链1:5，_gttgttaagcttcatgcttacgagctgcttaacc_3，(下划线为 Hind III酶切位点)；正义链2:5'-gttgttaagcttctagatgttcggatcag-3'(下划线为 Hind III酶切位点)，反义链2:5’ -gttgttcatatgcattaaattaagtggtaaac-3^ (下划线为 NdeI 酶切位点)；正义链3:5'-gttgttcatatgaagaaggaactgagctttc-3'(下划线为 NdeI 酶切位点)，反义链 3:5，-g ttgtgtctagattatttagattttagtttgtcactatgatc-3，(下划线为XbaI酶切位点)。所述的pgsBCA基因如下序列表(SEQ ID NO:1)所示:atgtggttac tcattatagc ctgtgctgtc atactggtca tcggaatatt agaaaaacga 60cgacatcaga aaaacattga tgcaagccct gttcgggtga atattaacgg catccgcgga 120aaatcgactg tgacaaggct ggactgtgga atattaatag acacaccgga caagactgtt 180ggaaaaacaa caggaacaga tgcaagaatg atttactggg aagccggtta ggaaaagccg 240attaaacgga gccgaatatc ggagagcaaa aacctcaggg aagaagtcat gagagaaacg 300gtagatagag gattgtctgc ctgttgaccc gggctaatgc gaatgcatgg agattatcaa 360atcatctttc aggaagaact tctgcaggcc aatatcggcg tcattgtgaa tgttttagaa 420gaccatatgg atgtcatggg gccgacgctt gatgaaattg cagaagcgtt taccgctaca 480attccttata atggccatct tgtcattaca gatagtgaat ataccgagtt ctttaaacaa 540aaagcaaaag aacgaaacac attgctgata aaaagtcatc actcaaaaat aacagatgag 600tatttacgta tcttccgctg aatttgaata cctgataacg cttctctggc gctgggtgtg 660gctcaagcac tcggcattga cgaagaaaca gcatttaagg gaatgctgaa tgcgccgcca 720gatccgggag caatgagaat catggtattc atcagtccga gcgagcctgg gcactttgtt 780aatgggtttg ccgcattcga cgcttcttct actttggcta tatggaaacg tgtaaaagaa 840atcggttacc cgaccgatga tccgatcatc attatgaact gccgcgcaga ccgtgtcgat 900cggacacagc aattcgcaaa tgacgtattg ccttatattg aagcaagtga actgatctta 960atcggtgaaa caacagaacc gatcgcaaaa gcctacgaag aaggcaaaat tcctgcagac 1020aaactgcatg acctagaata taagtcaaca gatgatatta tggaattgtt aaagaaaaga 1080
atgcacaacc gtgtcatata tggcgtcggc aatattcatg gtgccgcaga gcctttaatt1140gaaaaaatcc acgaatacaa ggttaagcag ctcgtaagct agctagatgt tcggatcaga1200tttatacatc gcactaattt taggtgtact actcagttta atttttgcgg aaaaaacagg1260gatcgtgccg gcaggacttg ttgtaccggg atatttagga cttgtgttta atcagccggt1320ctttatttta cttgtggtgc tagtgagctt gctctgtagg gttattgtga aatacggttt1380atccaaattt atgattttgt acggacgcag aaaattcgct gccatgctga taacagggat1440cgtcctaaaa atcgcgtttg cccgattgta ccatttgaaa aattgccaat tcgcagaatt1500ggcatcatcg tcgaggaatc tgccaggttt attttctata accattcaga aacaaggttt1560aaccattacg ttcggaagca cgctgctatt gagcggagcg acctttgcta tcatgtttgt1620ttaccactta atttaatgta aatgaagaag gaactgagct ttcatgaaaa gctgctaaag1680ctgacaaaac agcaaaaaaa gaaaaccaat aagcacgtat ttattgccat tccgatcgtt1740tttgtcctta tgttcgcttt catgtgggcg aaacgccgaa ttatgatggg ggtcaaaacg1800tactctgacg acgtactctc agcctcattt ggaaaagcgg gtaggcgata acgctatgtt1860gaaaaagtaa cggagcaaaa agccgcagac agtatttttc aatatgttga accgatcttt1920agagcctcgg ggactttagc aggaaacttt gaaaacccgg taacctatca aaagaattat1980aaacaagcag ataaagagat caacagcgca tcatctgcag aatcagtgaa agtcttgaag2040gatatgaatc tcacggttct acgaataagg aacaaccacg caatggatta cggcgttcag2100ggcatgaaag atacgcttgg agaatttgcg aagcaaaacc ttgatatcgt tggagcggga2160tacagcttaa gtgatgcgaa aaagaaaatt ttgtaccaga aagtcaacgg ggtaacgatt2220gcaacgcttg gctttaccga tgtgtccggg aaaggtttcg cggctaaaaa gaatacgccg2280ggcgtgctgc ccgcagatcc tgaaatcttc atccctatga tttcagaagc gaaaaaacat2340gctgacattg ttgttgtgca ggacaagagt gtcacactgg atgacaatga tccaaatgac2400cgccagcgcc agccatgtct gatgcgggag gattgaagta ctgacatcat cgtcggccat2460cacccgcaca tcttagaacc agcttgcaag tataacggaa ccgtcatttt ctacagcctc2520ggcaactttg tctttga tca agaacaagag agacagcctt acagtgcact ggttcagtat2580cacctgaaga aaaatggaac aggccgcttt gaagtgacac cgatcgatat ccatgaagcg2640acacctgcac ctgtgaaaaa aggctggacg aaacagaaaa ccattattcg cgaactgacg2700aaagactcta gaaagtagaa atttcgcttg gacggaaaac tgacgtttga tattgatcat2760agtgacaaac taaaatctaa ataa2784一种生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌在Y-PGA生产中的应用。本发明的重组谷氨酸棒杆菌由于含有Y-PGA合成酶复合体基因pgsBCA，在生物素限制或添加TweeMO发酵条件下，可以合成大量Y -PGA，降低Y -PGA生产过程中的谷氨酸添加成本，为更好地实现一步法生产Y-PGA的创新奠定基础。本发明方法简单、易操作。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1是Y -PGA结构式。图2是重组质粒pEKEx2 — BCA的酶切鉴定结果:M，DNA marker ；I,BamHI和XbaI双酶切过的阳性克隆DNA。
具体实施例方式实施例1:重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869 (pEKEx2 — BCA)的构建(I)菌种:谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum ATCC13869(2)外源基因:质粒 pEKEx2 — BCA(3)载体:Ε.coli/C.glutamicum 穿梭载体 pEKEx2 (Eggeling L, Bott M.Handbookof Corynebacterium glutamicum.CRC press, 2005, Boca Raton)(4)重组质粒pEKEx2 — BCA的构建以枯草芽孢杆菌TKPG011基因组作为PCR模板，设计引物分别扩增pgsB、pgsC和PgsA0将pgsB片段两端分别接上BamHI和Hind III位点，引物为:正义链:5，-gttgttggatccatgtggttactcattatagcctgtg-3> ；反义链:5’ -gttgttaagcttcatgcttacgagctgcttaacc-3，，PCR 扩增参数如下:95 °C 30s, 54°C 50s, 72 °C lmin30s,共 30 个循环；将 pgsC片段两端分别接上Hind III和NdeI位点，引物为:正义链:5’ -gttgttaagcttctagatgttcggatcag-3’ ；反义链:5’ -gttgttcatatgcattaaattaagtggtaaac-3’，PCR 扩增参数如下:95。。30s，56°C 40s, 72°C lm in,共30个循环；将pgsA片段两端分别接上NdeI和XbaI位点，引物为:正义链:5’ -gttgttcatatgaagaaggaactgagctttc-3’；反义链:5’ -gttgtgtctagattatttagattttagtttgtcactatgatc-3J ,PCR扩增参数如下:95°C 30s, 51°C 50s, 72°C lmin30s,共30个循环。将pgsB、pgsC和pgsA片段分别酶切装入载体pEKEx2中，形成pgsBCA融合片段(如SEQ ID N0:1所示)，重组质粒进行酶切鉴定(见图2)，DNA测序证实插入序列与SEQID NO:1 一致。(5)谷氨酸棒杆菌感受态的制备:挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13869，接种入含0.5% (质量体积比)葡萄糖的2ml液体LB培养基中，30°C，200r/min培养12小时，再按1%(接种量与培养基的体积百分比)接种到含3% (质量体积比)甘氨酸和0.1% (体积比)Tween80的50ml LB中，使起始OD600达到0.4，在30°C中继续培养至OD600达到0.9。将菌液冰浴20分钟，离心收集菌体，用预冷的10%(体积百分比)甘油重悬细胞，用1.5ml离心管分装，每管80 μ I。将感受态细胞放_70°C冰箱保存或直接用于电击转化。(6)电击转化重组质粒pEKEx2 — BCA:在1.8kv, 5ms条件下使用电击仪(BioRad公司产品)将质粒 pEKEx2 — BCARKAC.glutamicum ATCC13869 中。在含有 25 μ g/ml 卡那霉素的固体LB培养基上筛选出阳性克隆，得到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869(pEKEx2 — BCA)。并通过提取质粒的方法对该重组菌进行验证，结果表明，重组谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum ATCC13869 (pEKEx2 — BCA)含有质粒 pEKEx2 — BCA。实施例2:利用重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869 (pEKEx2 — BCA)发酵生产Y-PGA(I)发酵菌种:重组谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum ATCC13869 (pEKEx2 — BCA)(2)两种发酵培养基生物素限量培养基:50g葡萄糖，30g (NH4)2S04，Ig KH2PO4,0.4g MgSO4.7Η20，0.0lgFeS04.7H20,0.0lg MnSO4.4H20，200 μ g 维生素 B1HC1，13.8ml 大豆蛋白水解物(总氮量为35g/L)，50gCaC03 (需单独灭菌)，KOH调pH至8.0 (总体积为1L)。添加Tween40 培养基:50g 葡萄糖，30g(NH4)2S04，Ig KH2PO4,0.4g MgSO4.7H20，0.0lg FeS04.7Η20，0.0lg MnSO4.4H20, 200 μ g 维生素 BlHCl，60 μ g 生物素，13.8ml 大豆蛋白水解物(总氮量为35g/L)，50g CaCO3 (需单独灭菌)，KOH调pH至8.0，添加Tween40至终浓度5mg/ml (总体积为1L)。 Y -PGA含量测定:直接测定法(杨革，细菌聚谷氨酸的研究2001:江南大学博士学位论文)测定Y-PGA含量。发酵结果表明，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869(pEKEx2 - BCA)在生物素限量和添加Tween40发酵条件下均具有Y -PGA合成能力，生物素限量条件下￥- 64产量最高达到188/1，添加1'硏^1140条件下Y-PGA产量最高达到10g/L，而野生谷氨酸棒杆菌C.glu·tamicum ATCC13869在这两种发酵条件下均无法合成γ-PGA。
权利要求
1.一种生产Y -聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征是:是以野生型c.glutamicumATCC13869为出发菌株，转入含有Y -PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。
2.—种权利要求1所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:包括下列步骤:(I)构建含有Y -PGA合成酶基因pgsB、pgsC和pgsA的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将pgsBCA基因插入E.coli/和C.glutamicum穿梭载体pEKEx2,得到的重组质粒pEKEx2 — BCA ； (2)将步骤(I)构建的重组表达质粒转化入C.glutamicumATCC13869 中。
3.根据权利要求2所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:步骤(I)的具体方法是:以枯草芽孢杆菌TKPG011基因组作为PCR模板，设计引物分别扩增PgsB、pgsC和pgsA,将pgsB片段两端分别接上BamHI和Hind III位点，引物为:正义链:5’ -gttgttggatccatgtggttactcattatagcctgtg-S’，反义链:5’ -gttgttaagcttcatgcttacgagctgcttaacc-3’，PCR 扩增参数如下:95°C 30s, 54°C 50s, 72°C lmin30s,共 30 个循环；将pgsC片段两端分别接上Hind III和NdeI位点，引物为:正义链:5’_gttgttaagcttctagatgttcggatcag-3’，反义链:5’ -gttgttcatatgcattaaattaagtggtaaac-3’，PCR 扩增参数如下:950C 30s, 56 V 40s, 72°C lmin,共30个循环；将pgsA片段两端分别接上NdeI和XbaI位点，引物为:正义链:5’ -gttgttcatatgaagaaggaactgagctttc-3’，反义链:5’ -gttgtgtctagattatttagattttagtttgtcactatgatc-3’，PCR扩增参数如下:95°C 30s, 51°C 50s, 72°C lmin30s,共30个循环 ；将pgsB、pgsC和pgsA片段分别酶切装入载体pEKEx2中，形成pgsBCA融合片段。
4.根据权利要求2所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征是:步骤(2)的具体方法是:谷氨酸棒杆菌感受态的制备:挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869，接种入含0.5%质量体积比的葡萄糖的2ml液体LB培养基中，30°C，200r/min培养12小时，再按接种量与培养基的体积百分比为1%接种到含质量体积比为3%的甘氨酸和体积比为0.1%的TWeen80的50ml LB中，使起始OD6tltl达到0.4，在30°C中继续培养至0D_达到0.9 ;将菌液冰浴20分钟，离心收集菌体，用预冷的体积百分比10%的甘油重悬细胞,用1.5ml离心管分装,每管80 μ I，得谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13869感受态细胞；将谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869感受态细胞放_70°C冰箱保存或直接用于电击转化； 电击转化重组质粒pEKEx2 — BCA:在1.8kv, 5ms条件下使用电击仪将质粒pEKEx2 —BCA转化入谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869感受态细胞中；在含有25 μ g/ml卡那霉素的固体LB培养基上筛选出阳性克隆，得到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869(pEKEx2 - BCA)ο
5.—种权利要求1所述的生产Y-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌在Y-PGA生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生产γ-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和应用，其特征是是以野生型C.glutamicumATCC13869为出发菌株，转入含有γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。本发明的重组谷氨酸棒杆菌由于含有γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA，在生物素限制或添加Tween40发酵条件下，可以合成大量γ-PGA，降低γ-PGA生产过程中的谷氨酸添加成本，为更好地实现一步法生产γ-PGA的创新奠定基础。
文档编号C12P13/02GK103146630SQ20131007915
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者姚文娟, 孟国梁, 张伟, 陈向凡, 殷润婷 申请人:南通大学