专利名称：便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法，具体为便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
20世纪以来，通过转基因技术培育植物新品种，从而提高产量和抗逆性能，被认为是一种对植物定向改造有效的途径。目前，转基因棉花、大豆、玉米、油菜等已经得到了广泛的种植，为农业种植领域带来革命性的改革，也为农业增收带来了新的曙光。
植物表达载体是外源基因在植物细胞中进行扩增和表达的媒介，所以也称作工程载体。但在科学研究中构建一种高效的植物表达载体并非易事。中间需要经过质粒载体和连接片段的双酶切、纯化、连接、转化、验证等一系列步骤，费时费力。
鉴于TA克隆载体的连接模式，我们构建了这种便利连接目的基因的新型植物表达载体。在操作过程中只要选用Taq-Plus酶使目的片段的PCR产物末端带有游离的腺嘌呤A就可以直接用来做连接反应，省去了连接片段酶切、回收、纯化等一系列中间步骤，大大提高了我们实验的效率。
在提高连接效率的基 础上，我们还考虑到转基因生物安全性的问题。通常使用的植物表达载体携带有编码抗生素的抗性基因，用于构建载体过程中进行筛选，同时可以在转入植物后对转化植株进行筛选。当转化植株被筛选出来后，这些抗生素抗性基因在基因组中的存在就显得没有意义了，并且它们会随着转基因植物的繁殖而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。
为了在转基因农作物中得到广泛应用，载体中不能含有抗生素抗性基因，因而用抗除草剂基因(bar)作为转化植株的筛选基因，可以有效避免抗生素抗性基因给人和牲畜健康带来的危害。发明内容
本发明的目的在于提供一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，目的基因可通过简单的TA克隆连接入载体，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
本发明所提供的植物表达载体按照如下步骤得到:出发的原始表达载体为pGreenI10229, pCAMBIA2300, pCAMBIA3300-35S-HAK, pGH_X6145G 上(购自上海生工)，分别用引物从pGreenI10229上克隆两个片段，分别含有LB和RB (RB位于从pGreenI10229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenI10229克隆的2#片段中部)，且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；WpCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-N0S片段(3#片段)；从pGH-X6145G上克隆多克隆位点片段(4#片段);从pCAMBIA2300 (实验室保存)上克隆35S启动子(5#片段)最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD-1718，新构建的载体上作为载体标签的是凝血酶基因和大豆蛋白肽基因。其中，所述1#片段序列如序列SEQ ID NO:1所示，所述2#片段序列如序列SEQ IDNO:2所示，所述3#片段序列如序列SEQ ID NO:3所示。其中，所述RB序列如序列SEQ ID NO:4所示，所述LB序列如序列SEQ ID NO:5所示，所述凝血酶基因(thrombin)序列如序列SEQ ID NO:6所示,所述大豆蛋白肽基因(soybean peptide)序列如序列SEQ ID NO:7所示。连接4#片段测序结果如序列SEQ IDNO:8所示，所述5#片段序列如序列SEQ ID NO:9所示。专利中所用pGreenI10229, pCAMBIA3300, pCAMBIA2300 均从 CAMBIA 公司购买，pCAMBIA3300-35S-HAK为本实验室构建(《HAK基因对玉米的遗传转化及其耐盐性研究》)，凝血酶基因和大豆蛋白肽为公开的序列，具体可参考文献:Sequence of a humantranscript expressed in T-1ymphocytes and encoding a fibrinogen-like protein和 A novel methionine-rich protein from soybean cotyledon: cloning andcharacterization of cDNA (accession n0.AF005030)。本发明所构建的植物表达载体，还可以按照包括如下步骤得到:
(1)用PCR的方法以载体pGreenI10229为模版克隆1#片段，切胶回收2kb片段；同样以载体pGreenI10229为模版克隆2#片段，切胶回收1600bp片段，这两个片段两段都分别带有Afoi nWMIU I的酶切位点；
(2)1#和2#片段用Afoi/和/酶切并回收，连接这两个片段，得到载体pJWWD-12 ； (3)以载体pCAMBIA3300-35S-HAK为模版克隆得到3#片段，切胶回收3#片段，两端带有ZAo /酶切位点；
(4)用通ο/分别酶切pJWWD-12和3#片段并回收，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWWD -123 ；
(5)以pGH-X6145G上(购自上海生工)为模版克隆4#片段(其中含有多克隆位点)，切胶回收300bp片段；
(6)用SacI分别酶切载体pJWWD-123和4#片段并回收，连接切开的载体和4#片段，得到载体PJWWD-1234。(7)以PCAMBIA2300为模版克隆35S启动子(5#片段)，切胶回收800bp片段；
(8)用Pst I分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段并回收，连接切开的载体和5#片段
得到载体PJWffD-1718
上述任一所述构建的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用属于本发明的保护范围。上述任一所述构建的表达载体在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述构建的表达载体在大肠杆菌中转化的应用也属于本发明的保护范围。所述的应用中所述植物为为所有的单子叶和双子叶植物例如:水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘鹿、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵等。本发明植物表达载体含有LB、RB、凝血酶基因、大豆蛋白肽基因和bar基因，并且在多克隆位点含有两个I J酶切位点，可以方便地进行TA克隆。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，目的基因可通过简单的TA克隆连接入载体，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
图1 为载体 pGreenI10229。图2 为载体 PJWW0230 中 35S-HAK 片段。图3 为载体 pJWWD-1234。图4 为载体 pJWWD-1234 的 1#、2#、3# 片段 PCR 结果。图5为载体pJWWD-1234的4#片段测序图。图6 为载体 pCAMBIA2300。图7 为载体 pJWWD-1718。
图8为载体pJWWD-1718的35S酶切验证图。图9为载体PJffffD-1718-EPSPS中基因片段PCR验证图。图1O为转EPSPS基因大豆的PCR验证图。图11为载体PJffffD-1718-LYCB中LYCB基因PCR验证如图。图12为转Ζ7以基因玉米的PCR验证图。
具体实施例方式下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
实施例1
载体pJffWD-12的构建
①以质粒pGreenI10229为模板，以I片段F (正向)引物(SEQ ID N0:10)和I片段R(反向)引物(SEQ ID NO:11)为引物，用pfu酶克隆载体1#片段，单管PCR反应体系为:
权利要求
1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到:出发表达载体为 pGreenI10229 和 pCAMBIA3300-35S_HAK，分别用引物从 pGreenI10229 上克隆两个片段，分别含有LB和RB，且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从PCAMBIA3300-35S-HAK上克隆35S-N0S片段；UpGH_X6145G上克隆多克隆位点片段为4#片段；从pCAMBIA2300上克隆35S片段，最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体 PJffffD-1718 ； 其中，RB位于从pGreenI10229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenI10229克隆的2#片段中部； 其中，所述1#片段如序列SEQ ID NO:1所示，所述2#片段如序列SEQ ID NO:2所示，所述3#片段如序列SEQ ID NO:3所示，5#片段如序列SEQ ID NO:9所示； 其中，所述RB如序列SEQ ID NO:4所示,所述LB如序列SEQ ID NO:5所示,所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO:6所不,所述大 蛋白妝基因如序列SEQ ID NO:7所不。
2.一种植物 表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到: (1)用1#F引物和1#R引物克隆pGreenI10229的1#片段，两端分别带有I琳MIUI的酶切位点，切胶回收2kb片段；用2#F引物和2#R引物克隆pGreenI10229的2#片段，两端也分别带有J和i/ZZ/ I的酶切位点，切胶回收1600b片段； (2)用Afoi/和酶切回收的1#和2#片段，连接这两个片段，得到载体pJWWD-12 ； (3)用3#F引物和3#R引物克隆pCAMBIA3300-35S-HAK上的3#片段，切胶回收3#片段，两端带有通0 /酶切位点； (4)用通ο/分别酶切pJffff-12和3#片段，连接切开的载体和3#片段，得到载体pJWWD-123； (5)用4#F引物和4#R引物从pGH-X6145G克隆4#片段，其中含有多克隆位点，切胶回收300bp片段； (6)用SacI分别酶切载体pJWWD-123和4#片段，连接切开的载体和4#片段，得到载体pJWWD-1234 ； (7)从pCAMBIA2300上克隆35S启动子(5#片段)，切胶回收800bp片段； (8)用PstI分别酶切载体pJWWD-1234和5#片段并回收，连接切开的载体和5#片段得到载体PJWffD-1718。
3.权利要求1或2所述的表达载体在大肠杆菌转化中的应用。
4.权利要求1或2所述的表达载体在农杆菌介导的植物遗传转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶和双子叶植物，包括:水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。
6.权利要求1或2所述表达载体在植物育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的植物为单子叶和双子叶植物，包括:水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、甘蔗、美人蕉、白玉兰、大豆、花生、苹果、菊花、棉花、向日葵。
全文摘要
本发明涉及一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。该载体按照如下步骤获得用PCR的方法从出发表达载体pGreenII0229，pCAMBIA3300-35S-HAK，pGH-X6145G上(购自上海生工)，pCAMBIA2300，上克隆1#、2#、3#、4#和5#片段。用NotI和MIUI分别酶切1#和2#片段并连接得到载体pJWWD-12；用XhoI分别酶切pJWWD-12和3#片段并连接得到载体pJWWD-123；用SacI分别酶切载体pJWWD-123和4#片段并连接得到表达载体pJWWD-1234；用PstI分别酶切pJWWD-1234和5#片段并连接最终得到表达载体本pJWWD-1718。本发明可方便快捷插入目的基因，目的基因可通过TA克隆插入到本载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
文档编号C12N15/66GK103173486SQ20131007935
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者季静, 王罡, 吴疆, 刁进进 申请人:天津大学