一种分离反硝化细菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离反硝化细菌的方法，首先制备牛肉膏一蛋白胨液体培养基，加入琼脂后加热灭菌，冷凝成平板固体培养基，然后将混合微生物菌群均匀涂布于牛肉膏一蛋白胨平板，静置冷凝后于生化培养箱30℃下培养7-10天，在形成的菌落中挑取单菌落到牛肉膏一蛋白胨平板划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，采用格利斯试剂直接点滴入适量培养液中进行硝化活性鉴定，鉴定试验以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养液作空白对照。本发明通过牛肉膏一蛋白胨琼脂平板分离，氨氧化能力鉴定液体培养基培养和格利斯试剂显色等步骤，可从混合微生物系中分离筛选反硝化细菌，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。
【专利说明】一种分离反硝化细菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离反硝化细菌的方法，具体涉及一种从处理人工模拟城市生活污水系统中分离筛选，并鉴定具有硝化活性的反硝化细菌的方法，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]水体环境中构成氮循环的主要环节是:生物体内有机氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。自然水体中的氮来自水生动植物尸体及排泄物的积累及腐败，含氮有机化合物通过营腐生细菌分解成氨氮、硫化氢等小分子无机物，然后由各种自养型微生物主要为硝化细菌的作用，转化为亚硝酸盐和硝酸盐，这三种氮素一方面被藻类和水生植物吸收，另一方面硝酸盐在缺氧条件下被反硝化细菌通过脱氮作用将硝态氮转化为氮气逸出水体，大气中的氮被固氮菌利用重新回到水体。因此反硝化细菌在水体环境的维护和改良方面起着十分重要的作用，水体环境中反硝化细菌含量不足，就会造成水体环境亚硝酸盐含量高，水体就不能应用水产养殖，农业灌溉，特别是在处理高浓度生活污水方面，通过现有污水处理方法不容易达到良好除氮的效果，而通过人为给待处理水体投放反硝化细菌，由于反硝化细菌本身繁殖速度较快，大概在十八分钟繁殖一代，因此在短时间内都能产生良好的除氮效果。
[0003]目前对反硝化菌的研究中，真菌被认为是数量最大、效率最髙的反硝化菌，如青霉菌和香曲霉菌、轮枝菌等等。此外，某些放线菌、细菌甚至藻类在自然界或实验室的纯培养中，也被确定为具有硝化能力的异养微生物。如反硝化假
单胞菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerwgifl1s)、焚光假单胞菌iPseudomonas/7Wore1Scefl1S)、产铖杆菌、节抒菌、異产械菌iAlcaligenus faecal is) > PB16假单胞菌以及一些新发现的菌种(或属)等等。
[0004]为了有效的调控、监测和评价硝化作用，对脱氮系统活性污泥中微生物种群分布进行一定的研究，建立的一套新型可靠的分离反硝化细菌的分离方法对系统中混合微生物菌群中的反硝化细菌进行分离活性鉴别显得十分重要和必要，具有重要的理论和应用价值。
[0005]Winogradsky认为:自养硝化作用不能在牛肉明胶平板上发生生长,硝化细菌,特别是铵盐氧化细菌，只能在无机盐中运用特异性的化能自养方式生活，根本不能在营养明胶或营养琼脂平板上生长。据此在分离自养硝化细菌的过程中，为了证实分离自养硝化菌株的培养液中，是否存在有机营养微生物污染，就会用到肉膏琼脂平板来进行检验，即肉膏琼脂营养平板成为了检验“反硝化细菌”纯度的辅助工具，其上生长的为非分离目的反硝化菌株的杂菌，而从不用以分离自养硝化细菌。
[0006]20世纪50年代，Quasel等对传统的硝化作用反硝化细菌发生说提出了质疑，并以丙酮肟为唯一碳氮源，采用土柱渗滤进行选择性加富培养，获得了具有产生N02-能力的反硝化细菌菌株，后来的研究者多采用相似的方法进行反硝化活性菌株的分离。目前常用的培养基有:丙酮酸肟，乙酰胺及其它一些有机物如肟、吡啶等。这些方法的缺点是样品前处理比较繁琐，耗时费力，重复性差，分离的菌株单一且缺乏代表性。
[0007]经文献检索发现，《微生物世界》2001年第五期，公开了一种分离鉴定纯化反硝化微生物的方法:将待检样品涂布于牛肉浸膏一蛋白胨琼脂平板后，挑取单菌落至上述牛肉浸膏一蛋白胨琼脂平板继续划线纯化，经28°C培养10天，格利斯试剂直接点滴到平板，进行硝化活性确认，并以不接菌的平板作空白对照。虽然所述方法操作相对简便且所需时间较短，因此具较高实用性，然而，其所述的方法存在以下不足:
在应用上述方法时，由于试剂的纯度不高所带来的影响不易排除，因此需要对培养基的成分做较髙要求，比如对其中的亚硝酸盐及硝酸盐的含量需要进行提前的验证。由于目前国内市售的蛋白胨及牛肉青中成分复杂，如果为了降低成本而使用市面上较易购得的蛋白胨后，往往在实验分离过程中的涂布及划线过程前，菌落周围就由于培养基的影响而具有一定量的亚硝酸盐或硝酸盐，这样势必给实验结果的判断带来很大的影响，从而影响到对反硝化细菌的分离结果。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于针对以上所述各种分离方法的不足，提出一种新的分离筛选反硝化细菌的方法，简化实验操作步骤，降低实验试剂中杂质对实验结果的干扰，从而提高检出率。
[0009]为实现这一目的，本发明首先制备牛肉膏一蛋白胨液体培养基，加入琼脂后加热灭菌，冷凝成平板固体培养基，然后将混合微生物菌群均匀涂布于牛肉膏一蛋白胨平板，静置冷凝后于生化培养箱30*C下培养7-10天，在形成的菌落中，挑取单菌落到牛肉膏一蛋白胨平板，划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，采用格利斯试剂直接点滴入适量培养液中，进行硝化活性鉴定，鉴定试验以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养液作空白对照。
[0010]本发明的方法具体包括如下步骤:
1、牛肉膏一蛋白胨培养基的制备:按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，100mL蒸馏水的比例配制液体培养基，先将牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸馏水中，用lmol/L的NaOH调节培养基pH为7.0 8.0形成液体培养基，经121°C:高温高压灭菌15 20分钟。在上述牛肉膏一蛋白胨液体培养基中加入15 20g琼脂，加热使其充分溶解后装于锥形瓶中，于121 °C:下灭菌15 20分钟，待培养基冷却至45 50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板，得到牛肉膏一蛋白胨培养基。
[0011]2、混合微生物菌群的稀释:
1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品。然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到ID种不同稀释度的样品。
[0012]3、混合微生物菌群的涂布:
从各个稀释度的样品中均取0.1mL分别加入到制备好的牛肉育一蛋白胨培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释样品分散摊开使其千燥。每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管。静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30°C下培养7-10天。
[0013]4、细菌的纯化分离:
在形成菌落的平板内，挑选出90-110个孤立菌落的平板。在水平层流双人净化工作台上，把装有选出平板的培养皿中的孤立菌落用接种环挑出，移植到牛肉膏一蛋白胨培养基上，30°C条件下培养7-10天，然后，再用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡。用此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2-3次，即可得到经分离纯化后的反硝化细菌菌株。
[0014]5、氨氧化能力鉴定培养液的制备:
氨氧化能力鉴定培养液的制备:取葡糖糖5g/L，(NH4)2S04 0.5g/L，NaCL 0.3g/L，K2HP04 1.0g/L, MgS04.7H20 0.3g/L, FeS04.7H20 0.03g/L, CaC03 7.5g/L，充分混合溶解后分装于玻璃试管中，每只试管分装3mL，用硅胶塞塞紧，于110°C下高压灭菌20min，制得氨氧化能力鉴定培养液；
6、格利斯试剂的配制:
称取对氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0.1ga-萘胺溶解于10mL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得α-萘胺溶液。将两种溶液等量混合成格利斯试剂使用。
[0015]7、液体纯培养的硝化活性验证:
将经分离纯化后获得的反硝化细菌菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，于30°C条件下培养7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照。若培养液变红即可确定菌株具有硝化活性。
[0016]在将分离纯化后的单菌落菌苔移至液体氨氧化能力鉴定培养液的过程中，注意接种环切莫触碰琼脂，以免琼脂培养基中的杂质带入氨氧化能力鉴定培养液，从而影响鉴定结果；且移入氨氧化能力鉴定培养液时，注意不要触碰试管壁。
[0017]本发明中所适用的格利斯试剂需要在4°C冰箱中避光保存，要在两周内使用，一旦发现混浊需要重新配置。
[0018]本发明通过牛肉青一蛋白胨琼脂平板分离，氨氧化能力鉴定液体培养基培养和格利斯试剂显色等步骤，可从混合微生物系中分离筛选反硝化细菌，与现在所使用的方法相t匕，具有简便，重复性好，分离菌株效果好，准确可靠的特点。
【具体实施方式】
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
[0019]本发明的一个实施例，是在处理城市生活模拟污水的高效膜生物反应器中，对反硝化细菌进行了分离筛选过程。
[0020]方法使用的主要实验仪器和设备有:
立式压力蒸汽灭菌器:上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产，型号YXQ-LS-50SI ； 生化培养箱:广东省医疗器械厂生产，型号LRH-250A ；
水平层流双人净化工作台:江苏苏州净化设备有限公司生产，型号HS-1300 ； 恒温振荡器:江苏常州国华电器有限公司生产，型号SHZ-82 ；
显微镜:日本Olympus生产，型号BX51TF。
[0021]本发明的方法按如下步骤进行:1、牛肉膏一蛋白胨培养基的制备:
制备牛肉膏一蛋白胨液体培养基的配方如下:牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，
NaCl5g/L。
[0022]制作过程:称取牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g溶解于100mL蒸馏水中，用Imol/L的NaOH调节培养基pH为7.0-7.2，形成液体培养基，经高温高压灭菌(121°C，15_20min)待用。
[0023]在上述牛肉膏一蛋白胨液体培养基中加入15_20g琼脂，加热使其充分溶解后装于锥形瓶中，于121°C下灭菌15-20min，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置待冷凝成平板。使用时可放在沸水中溶解后使用。
[0024]2、混合微生物菌群的稀释:
吸取膜生物反应器中的活性污泥20mL，加入到盛有ISOmL的无菌蒸馏水和玻璃珠的500mL三角瓶中，塞上灭菌的棉花塞，于恒温振荡器上以100r/min转速30°C下振荡10小时，而后取5mL稀释液接于含有45mL无菌蒸馏水和玻璃珠的250mL三角瓶中，塞上灭菌的硅胶塞，于恒温振荡器上以lOOr/min转速振荡10分钟。这是第二次稀释倍数为10的稀释，而后迅速用灭菌的移液管吸取1mL加入到90mL灭菌的无菌水中。第三次稀释完毕后塞上经灭菌的棉塞，用手振荡40次，取ImL加到9mL的无菌水中，此为第四次稀释，而后一直再按照第三次稀释方法连续稀释6次。共进行10次稀释，得到10种不同稀释度的样品。
[0025]3、混合微生物菌群的涂布:
从各个稀释度的样品中均取0.1mL分别加入到制备好的牛肉膏一蛋白胨培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释样品分散摊开使其干燥。每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管。静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30°C下培养7-10天。
[0026]4、细菌的纯化分离:
在形成菌落的平板内，挑选出90-110个孤立菌落的平板。在水平层流双人净化工作台上，把装有选出的平板的培养皿中的孤立菌落用接种环挑出，划线分离。
[0027]通常，可以认为一个菌落是由一个细胞发育来的，因此是由一个种类细菌组成的。可是，也有由种类不同的几个细菌细胞形成一个菌落的可能性。所以，为慎重起见需要对这些菌进行纯化。待形成菌落后，再用接种环移植到固体培养基上，30°C条件下培养7-10天。然后，再挑取一接种环的细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡。用此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株。并以不接菌的平板做空白对照。
[0028]5、氨氧化能力鉴定培养液的制备:
配方如下:葡萄糖 5g/L, (NH4) 2So4 0.5g/L，NaCl 0.3g/L，K2HP04 1.0g/L,MgSo4.7H2o 0.3g/L, FeS04.7H2o 0.03g/L, CaC03 7.5g/L。
[0029]制作过程:称取以上各物质相应质量，充分混合溶解后将其分装于玻璃试管中，规格为18x150毫米，每只试管分装3mL，用硅胶塞塞紧，于110°C下高压灭菌20min。制得氨氧化能力鉴定培养液。
[0030] 6、格利斯试剂的配制:格利斯试剂由两种溶液混合使用。1、对氣基苯确酸溶液:称取对氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸饱水的混合液中，过滤，避光保存，此试剂一个月内可用；2、α -萘胺溶液:称取0.1g α -萘胺溶解于10mL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤，避光保存，此试剂一个星期内可用。
[0031]临用前两种溶液等量混合。
[0032]7、液体纯培养的反硝化活性验证:
将获得的经分离纯化后的反硝化细菌菌株，由牛肉膏一蛋白胨固体培养基中，用接种环挑取一菌环纯菌菌苔，接种于氨氧化能力鉴定培养基，3 (TC条件下培养7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照。如现红色乃至褐色，则说明由于硝化作用而积蓄了亚硝酸盐。2-3分钟后再在未显色的试管中用小药匙加入锌粉少许，静置，观察是否呈现红色。如加入锌粉后显红色，则说明培养液中的产生了硝酸盐。即菌株也具有硝化活性，初步确认为反硝化活性菌。
[0033]本发明由膜生物反应器系统的混合菌群中分离筛选出了具有硝化活性的细菌，分别编号为Al及A2，并分别进行了相关的细菌学鉴定以及生理生化试验研究，结果如下:
菌株Al在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养1-2天后形成的菌落呈乳白色，不透明，革兰氏阳性芽抱杆菌，细菌大小为(0.5-0.6) μ m(l.6-2.6) μ m,具球杆变化周期，60°C不生长，不具抗酸性。接触酶阳性，V-P试验阴性，淀粉水解阴性，厌氧洋菜不生长，葡萄糖不产酸，除个别生理生化特征(可利用葡萄糖做有机碳源等)外，其主要特征与也《7^?macro ides 基本一致。
[0034]菌株A2在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养I天后形成的菌落呈乳白色偏灰，不透明，细菌大小为(0.4-0.6) μ m X (1.2-2.1) μ m，具球杆变化周期。革兰氏染色实验中，菌株在培养初期为呈阳性的芽孢杆菌，但革兰氏染色不稳定，在生长至7天左右染色却呈阴性，且菌落变至褐色。6°C不生长，不具抗酸性。接触酶阳性，V-P试验阳性，淀粉水解阴性，厌氧洋菜不生长，葡萄糖产酸，除个别生理生化特征(不具抗酸性，不在铵态氮上生长)外，其主要特征与短芽孢杆菌属Qirevibeicillus')基本一致。
【权利要求】
1.一种分离反硝化细菌的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)牛肉膏一蛋白胨培养基的制备:按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，100mL蒸馏水的比例配制液体培养基，先将牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸馏水中，用lmol/L的NaOH调节培养基pH为7.0 8.0形成液体培养基，经121°C高温高压灭菌15 20分钟；在上述牛肉膏一蛋白胨液体培养基中加入15 20g琼脂，加热使其充分溶解后装于锥形瓶中，于121°C下灭菌15 20分钟，待培养基冷却至45 50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板，得到牛肉膏一蛋白胨培养基； 2)混合微生物菌群的稀释:将样品与无菌蒸馆水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品； 3)混合微生物菌群的涂布:从各个稀释度的样品中均取0.1mL分别加入到制备好的牛肉膏_蛋白胨培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释样品分散摊开使其干燥，每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管，静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30°C下培养7-10天； 4)细菌的纯化分离:在形成菌落的平板内，挑选出90-110个孤立菌落的平板，在水平层流双人净化工作台上，把装有选出平板的培养皿中的孤立菌落用接种环挑出，移植到牛肉膏一蛋白胨培养基上，30°C条件下培养7-10天，然后，再用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，用此细菌悬液按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2-3次，即可得到经分离纯化后的 反硝化细菌菌株； 5)氨氧化能力鉴定培养液的制备:取葡糖糖5g/L，(NH4)2S040.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HP04 1.0g/L, MgS04.7H20 0.3g/L, FeS04.7H20 0.03g/L, CaC03 7.5g/L，充分混合溶解后分装于玻璃试管中，每只试管分装3mL，用硅胶塞塞紧，于110°C下高压灭菌20min，制得氨氧化能力鉴定培养液； 6)格利斯试剂的配制:称取对氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氧基苯硪酸洛液:称取0.1ga-萘胺溶解于10mL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得α -萘胺溶液；将两种溶液等量混合成格利斯试剂使用； 7)液体纯培养的硝化活性验证:将经分离纯化后获得的反硝化细菌菌株用接种环挑取一菌环细菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，30°C条件下培养7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照，若培养液变红即可确定菌株具有反硝化活性。
【文档编号】C12R1/07GK104046575SQ201310079767
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】李朝均 申请人:都江堰惠农生物技术有限责任公司