一种用于生产多杀菌素的发酵培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora?spinosa)发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为：碳源5.0～9.0％、氮源3.0～6.0％、低级醇0.1～0.5％、植物油0.2～2.5％、氨基酸0.1～0.5％。所述发酵培养基能够提高多杀菌素的发酵单位，提高生产效率，并降低生产成本。
【专利说明】一种用于生产多杀菌素的发酵培养基
【技术领域】
[0001]本发明属于生物农药生产【技术领域】，具体涉及一种用于生产多杀菌素的发酵培养基。
【背景技术】
[0002]多杀菌素(Spinosad)是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的大环内酯类抗生素，活性最高的两个组分是spinosyn A和spinosynD。多杀菌素的作用机制新颖、独特:作用于昆虫神经系统及Y-氨基丁酸受体，对昆虫具有快速触杀和胃毒活性(摄食毒性)。此外，多杀菌素活性选择性较高，对鳞翅目、双翅目和缨翅目等害虫表现出极高的毒性，而对哺乳动物、鸟类和大多数益虫毒性较低。在哺乳动物的慢性毒性试验中，多杀菌素无致癌、致畸及致突变作用，也没有神经毒性。与氯氰菊酯相比，多杀菌素对某些重要益虫的毒性低,而对鳞翅目害虫的活性与之相当,对水生生物具有中低毒性。
[0003]多杀菌素最初是美国陶氏农业科学公司生产的，因其具有生物农药的安全性、化学合成农药的速效性且杀虫谱广、杀虫活性高、低残留，被美国环保局归类为降低风险杀虫剂产品。1999年，多杀菌素获得美国“总统绿色化学品挑战奖”，2005年美国环保局批准其作为储粮防护剂，2008年欧盟批准其在有机作物上使用。至2003年，多杀菌素已经在24个国家，超过250种作物上进行注册登记。在我国，1999年多杀菌素的注册商品名为催杀(Tracer48%悬浮液)和菜喜(Success2.5%悬浮液)。可以看出，目前多杀菌素已成为最具有发展前景的生物杀虫剂，对其进行研究开发具有良好的经济与社会效益。
[0004]Z.H.Jin&B.Xu&S.Z.Lin&Q.C.Jin&P.L.Cen ；Enhanced Product1n ofSpinosadin Saccharopolyspora spinosa by Genome Shuffling ；Appl B1chemB1technol (2009) 159:655-663公开了一种多杀菌素产生菌发酵用培养基，所述发酵培养基的配方及含量为:葡萄糖6%、淀粉2%、黄豆粉2%、鱼粉I %、玉米浆I %、谷氨酸盐0.3%、大豆油I %、CaC030.3%。该培养基的发酵单位最高为547mg/L。鉴于此发酵配方的发酵单位偏低，不利于产业化。
【发明内容】
[0005]针对现有的利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的发酵培养基发酵单位较低，产率低等缺陷，本发明提供了一种新的用于刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的发酵培养基，该发酵培养基能够提高多杀菌素的发酵单位，提高生产效率，并降低生产成本。
[0006]因此，本发明旨在提供一种用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为:碳源5.0~9.0 %、氮源3.0~6.0 %、低级醇0.1~
0.5%、植物油0.2~2.5%、氨基酸0.1~0.5%。
[0007]本发明中的百分比单位是重量体积百分比单位g/100mL，其是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
[0008]根据本发明一个优选的实施方式，所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麦粉、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一种或多种；优选地，所述的碳源为3.0~6.0%的葡萄糖和2.0~3.0 %的玉米粉的组合。
[0009]天然淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其直链淀粉与支链淀粉之比一般约为15-28%比72-85%。直链淀粉是D-葡萄糖基以a-(I，4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，支链淀粉分子中除有a-(l，4)糖苷键的糖链外，还有a-(l，6)糖苷键连接的分支，分子中含300~400个葡萄糖基。淀粉与碘呈颜色反应，直链淀粉为蓝色，支链淀粉为紫色。不同来源可溶性淀粉之间并无明显差异。本发明所述的玉米淀粉是从玉米中直接提取所得的天然淀粉，含有直链淀粉及支链淀粉，其成分约为27 %直链淀粉、73 %支链淀粉，具有国家标准，市售可得。
[0010]Saccharopolyspora spinosa NRRL18395 的基因中含有可以表达为 ct-淀粉酶(alpha-amylase)的基因，即刺糖多孢菌能产生α -淀粉酶(EC3.2.1.1)，水解α-(1，4)_糖苷键:既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α-(1，4)_ 链。
[0011]本发明所述的可溶性淀粉是由淀粉经过氧化剂、酸、甘油、酶或其他方法处理而成的淀粉衍生物，其成分为100 %直链淀粉。是一种白色或淡黄色粉末，无味无臭，溶于沸水形成胶体溶液，不溶于冷水、醇和醚。其产品具有国家标准，市售可得。
[0012]根据本发明另一个优选的实施方式，所述的氮源选自棉籽饼粉、酵母浸粉、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、豆柏和牛肉浸膏中的一种或多种；优选地，所述的氮源为2.0~4.0%的棉籽粉和1.0~2.0%的酵母浸粉的组合。
[0013]根据本发明一个优选的实施方式，所述的低级醇选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇；优选为正丁醇0.1~0.5%，最优选为0.2~0.3%。
[0014]根据本发明另一个优选的实施方式，所述的植物油选自大豆油、玉米油、葵花油或花生油；优选为葵花油0.2~2.5%，最优选为2.0%。
[0015]根据本发明一个优选的实施方式，所述的氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸；优选为赖氨酸0.1~0.5%，最优选为0.2~0.3%。
[0016]上述最优选配方的培养基的发酵单位最高可达1559mg/L,是原有发酵水平的2.8倍。
[0017]根据本发明另一个优选的实施方式，所述刺糖多孢菌可以是现有的各种刺糖多抱菌菌株，如 Saccharopolyspora spinosa NRRL18395、Saccharopolyspora spinosaATCC49460。
[0018]本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0019]本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
[0020]相比于现有技术，本发明发酵培养基的有益效果如下:本发明提供了一种有利于刺糖多孢菌高效发酵生产多杀菌素的发酵培养基。通过优选发酵培养基的成分及配比，从而大大提高多杀菌素的产量。本发明提供的发酵生产方法大幅提高了多杀菌素的发酵单位，适用于多杀菌素的规模化生产。
【具体实施方式】
[0021]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]所使用的刺糖多抱菌为:Saccharopolysporaspinosa NRRL18395 或Saccharopolyspora spinosa ATCC49460。
[0023]发酵培养方法:
[0024]装量100mL/750mL，接种量10%，置于28°C恒温室中旋转摇床240rpm摇瓶发酵9天。
[0025]发酵液中多杀菌素含量测定:
[0026]取发酵液2mL置于1mL离心管，加入6mL甲醇溶液，充分振荡，混合超声15min，避光室温浸提12小时，离心(4000rpm，20min)，取上清液经0.45 μ m微孔滤膜过滤后用于高压液相色谱检测。
[0027]色谱条件:色谱柱:C18,4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流动相:甲醇-乙腈-0.05mol/L乙酸铵(45: 45: 10);流速:1.0mL/min ;检测波长:250nm ;柱温:40°C ;进样量:5μ L。
[0028]实施例1
[0029]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0030]葡萄糖6.0g、可溶性淀粉3.0g、棉籽粉5.0g、乙醇0.2g、葵花油2.0g、甘氨酸
0.3g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为783mg/L。
[0031]实施例2
[0032]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0033]葡萄糖6.0g、面粉3.0g、棉籽粉3.0g、豆柏2.0g、正丙醇0.2g、大豆油2.0g、谷氨酸0.3g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为736mg/L。
[0034]实施例3
[0035]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0036]葡萄糖6.0g、燕麦粉3.0g、棉籽粉3.0g、鱼粉蛋白胨2.0g、异丙醇0.2g、玉米油2.0g、脯氨酸0.3g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为641mg/L。
[0037]实施例4
[0038]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0039]葡萄糖6.0g、玉米淀粉3.0g、棉籽粉3.0g、黄豆饼粉2.0g、正丁醇0.2g、花生油
2.0g、甲硫氨酸0.3g,体积100mL。发酵后测得发酵单位为974mg/L。
[0040]实施例5
[0041]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0042]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.2g、葵花油
2.0g、赖氨酸0.3g，体积lOOmL。发酵后测得发酵单位为1327mg/L。
[0043]实施例6
[0044]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0045]葡萄糖6.0g、糊精3.0g、棉籽粉3.0g、牛肉浸膏2.0g、异丁醇0.2g、葵花油2.0g、天冬氨酸0.3g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为842mg/L。
[0046]实施例7
[0047]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0048]葡萄糖8.0g、玉米粉1.0g、棉籽粉1.0g、酵母浸粉4.0g、正丁醇0.2g、葵花油
0.5g、赖氨酸0.5g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为856mg/L。
[0049]实施例8
[0050]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0051]葡萄糖7.0g 、玉米粉2.0g、棉籽粉2.0g、酵母浸粉3.0g、正丁醇0.3g、葵花油
1.5g、赖氨酸0.2g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为921mg/L。
[0052]实施例9
[0053]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0054]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.lg、葵花油
1.0g、赖氨酸0.3g,体积100mL。发酵后测得发酵单位为937mg/L。
[0055]实施例10
[0056]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0057]葡萄糖7.0g、玉米粉2.0g、棉籽粉4.0g、酵母浸粉1.0g、正丁醇0.4g、葵花油
2.0g、赖氨酸0.lg，体积100mL。发酵后测得发酵单位为821mg/L。
[0058]实施例11
[0059]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0060]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉5.0g、正丁醇0.5g、葵花油2.5g、赖氨酸0.4g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为832mg/L。
[0061]实施例12
[0062]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,发酵培养基按照下表所列数据(重量体积百分比)进行配置:
[0063]葡萄糖9.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.2g、葵花油2.0g、赖氨酸
0.3g，体积100mL。发酵后测得发酵单位为711mg/L。
[0064]对比实施例1
[0065]利用多杀菌素产生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395发酵,按【背景技术】中所提及的Jin等人文献所述，使用其发酵培养基葡萄糖6 %、淀粉2 %、黄豆粉2 %、鱼粉I %、玉米浆I %、谷氨酸盐0.3%、大豆油I %、CaCO30.3%。多杀菌素的产量为523mg/L。
【权利要求】
1.一种用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为:碳源5.0~9.0%、氮源3.0~6.0%、低级醇0.1~0.5%、植物油0.2~2.5%、氨基酸0.1~0.5%。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麦粉、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的发酵培养基，其中所述的碳源为3.0~6.0%的葡萄糖和2.0~3.0 %的玉米粉的组合。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的氮源选自棉籽饼粉、酵母浸粉、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、豆柏和牛肉浸膏中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其中所述的氮源为2.0~4.0%的棉籽粉和 .1.0~2.0 %的酵母浸粉的组合。
6.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的低级醇选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇。
7.根据权利要求6所述的发酵培养基，其中所述的低级醇为正丁醇，含量为0.2~.0.3%。
8.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的植物油选自大豆油、玉米油、葵花油或花生油。
9.根据权利要求8所述的发酵培养基，其中所述的植物油为葵花油，含量为2.0%。
10.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸。
11.根据权利要求10所述的发酵培养基，其中所述的氨基酸为赖氨酸，含量为0.2~.0.3%。
【文档编号】C12R1/645GK104046672SQ201310080681
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】李继安, 钟京谕, 林惠敏, 蓝鸿, 石煊雯, 李亚军 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院