专利名称：一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，尤其涉及一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法。
背景技术：
植物组织培养包括器官培养、愈伤组织培养、茎尖组织培养、细胞培养、原生质体培养等。其中愈伤组织培养最常见，因为除茎尖分生组织培养和少数器官培养外，其它类型都要经历愈伤组织阶段才能产生再生植株，其原理是利用植物细胞的全能性，愈伤组织的形成在组织培养技术中有着至关重要的地位，许多药用植物中的活性成分可直接通过愈伤组织进行合成。珊瑚菜是生长在北太平洋沿海地区沙滩地的一种伞形科多年生草药。在我国分布于辽宁、山东、江苏等地，生长于海边沙滩或人工栽培，原为海滩沙生植物群落的建群种之一，对海岸固沙和盐碱土改良具重要作用，但随着海滩的滥用开发和对该植物的过度采挖，使其数量日趋减少，已经处于濒临灭绝的境地，被列为中国珍稀濒危保护植物。而人工栽培技术要求高，种子萌发率低，生长周期长，掠夺式的采集野生资源又会危及生态平衡。珊瑚菜具有较高的药用价值，其根状茎和根可作生药，被收入日本和中国药典。珊瑚菜根(北沙参)中含有多种香豆素和香豆素苷，主要有欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、佛手素、花椒毒酚、花椒毒素、补骨脂素、东莨菪素、紫花前胡苷元等。其中补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素三种香豆素的含量可作为评价北沙参不同部位质量及产地加工方法的标准。研究表明，北沙参在体内具有抗癌作用的主要活性成分为呋喃香豆素，其中浓度为50μ g/mL的欧前胡素和异欧前胡素抑制活性最强。大多数药用植物的根不仅可提供生物药学成分，而且也是农药、风味调料、染料和香料的重要来源，而根中的有效成分是植物的次级代谢产物，具有较高的应用价值，因此利用根的体外培养生产次级代谢产物越来越受到学者们的关注。毛状根培养技术是20世纪80年代后期，在植物细 胞培养技术领域中发展起来的一项新技术，目前美国、英国、加拿大、日本、中国及韩国都在对药用植物毛状根的诱导培养进行着大量的基础研究，研究表明，毛状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次级代谢物质都可以通过毛状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。利用发根农杆菌感染诱导药用植物形成毛状根，并对毛状根进行离体培养增殖，是对药用资源植物可持续利用的有效途径之一。毛状根具有生长速度快、培养增殖不需要加入激素、分化程度高、产生次生代谢产物的能力强、可以通过基因工程的手段来增加次生代谢产物的含量、并能够合成某些悬浮细胞培养所不能合成的次生代谢产物等优点，越来越受诸多专家研究者的重视。但是目前对于珊瑚菜活性物质的诱导及生产还处于利用常规组织培养及细胞培养手段的水平，关于珊瑚菜毛状根的诱导尚未有人研究
发明内容
本发明提供了一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，利用本发明所述方法诱导的珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现:一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，它包括以下步骤:(I)获得珊瑚菜无菌苗；(2)培养供感染用的发根农杆菌；(3)转化外植体进行共培养:取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取根、叶柄或叶片作为外植体，在其表面划出伤口用于感染，放入发根农杆菌菌液中浸泡，然后放入MS固体培养基中共培养，直至外植体周边出现菌斑；(4)诱导毛状根发生:将出现菌斑的外植体清洗后，放入含有头孢噻肟钠的1/2MS培养基中培养，定期更换1/2MS培养基，在更换的培养基中逐步降低头孢噻肟钠的浓度，直到在完全除掉头孢噻肟钠的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系；(5)毛状根的培养增殖:将除菌完全、生长快速的毛状根接种在1/2MS液体培养基中，振荡培养增殖，获得大量毛状根。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(I)中选择饱满的珊瑚菜种子，灭菌，后接种于MS固体培养基中培养获得无菌苗。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(2)中所用菌种为发根农杆菌1.2556。
对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(2)中发根农杆菌的感染菌液最佳浓度为 OD600=0.08。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(3)中所述外植体优选为无菌苗的根，其次为叶柄，再次为叶片。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(3)中珊瑚菜无菌苗放入发根农杆菌菌液中浸泡15-30min。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(3)中共培养时间为2-5d。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(4)中将外植体放入含有头孢噻肟钠300mg/L的1/2MS培养基中，于25°C黑暗培养13_16d。对上述技术方案的进一步改进:所述步骤(4)中在1/2MS培养基中培养每7-10d换一次培养基，最初头孢噻肟钠的浓度为300mg/L，逐步降低Cef的浓度为每换一次培养基降低50mg/L头孢噻肟钠。对上述技术方案的进一步改进:利用分光光度法测定珊瑚菜毛状根中香豆素含量的波长为325nm。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:本发明以珊瑚菜叶片为实验材料，诱导愈伤组织的生成，并利用石蜡切片技术对其发生进行了跟踪观察，为珊瑚菜组织培养提供理论依据，并为后续实验奠定基础。本发明利用已形成的愈伤组织，通过调节激素浓度筛选不定根的最佳诱导条件，以探索获得大量珊瑚菜不定根的组织培养条件，并对形成的不定根进行了扩增培养，为提高珊瑚菜药用活性部位的产量及工业化生产提供理论依据。本发明利用发根农杆菌感染诱导珊瑚菜毛状根的形成，并建立离体毛状根培养系统，分析测定了珊瑚菜毛状根中主要药用成分香豆素的含量，并与不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量进行了对比，以毛状根中香豆素的含量最高，珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，在不含激素的条件下一个多月便可获得大量的毛状根，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素；为将来利用毛状根工业化生产珊瑚菜次级代谢产物提供了新的途径，从另一方面保护该濒危植物，有利于维护生态平衡。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
图1为珊瑚菜叶片在诱导培养基上培养过程的照片，表明珊瑚菜叶片形成愈伤组织过程中外部形态变化，其中图1-1、1-2、1-3、1-4分别为培养时间7d、14d、20d和40d的照片。图2为珊瑚菜愈伤组织诱导不定根的照片，其中2-1表明含IBA3mg/L的1/2MS培养基上不定根的生长情况；其中2-2表明含IBA5mg/L的1/2MS培养基上不定根的生长情况；其中2-3表明不定根在液体培养基中培养IOd的生长状态；其中2-4表明不定根在液体培养基中培养50d的生长状态。图3为珊瑚菜种子的萌发情况，其中3-1为培养IOd的种子，示胚芽突破种子开始萌发；3-2为培养20d的种子，示两片子叶逐渐从种子中冒出；3-3为培养25d的种子，示第一片真叶；3_4为培养40d的种子，示珊瑚菜无菌苗。3-5为诱导培养15d的外植体，白色透明的毛状根；3_6为高浓度菌液处理下外植体生长情况，示褐化死亡的外植体。图4为毛状根在液体培养基中的生长过程，4-1为培养IOd的毛状根，4-2为培养20d的毛状根，4-3为培养35d的毛状根，4-4为毛状根PCR检测结果，图中M为Marker，I为发根农杆菌1.2556T-DNA PCR扩增条带，2为毛状根DNA PCR扩增条带，3为不定根DNA PCR扩增条带，4为无菌苗DNA PCR扩增条带。图5为伞形花内酷标准品溶液的光谱扫描图。图6为珊瑚菜毛状根溶液的光谱扫描图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1一、珊瑚菜叶片愈伤组织发生1、实验材料植物材料选用无病虫害的珊瑚菜叶片。MS (Murashige and Skoog)培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为8g/L。愈伤组织的诱导培养基为MS+2, 4-D0.15mg/L+6_BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L。2、生化试剂和主要仪器MS培养基所用各成分以及酒精、甲醛、冰乙酸、二甲苯等试剂为国产分析纯试剂。细胞分裂素6-BA以及生长素NAA、2，4_D均为上海生物工程公司化学分析纯产品。组织培养常用仪器:无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培养箱坐寸O3、实验方法3.1外植体的处理方法取珊瑚菜叶片若干，洗净表面尘土，放入烧杯中，流水冲洗lh，再用无菌水冲洗2-3次，将经过上述处理的叶片放在无菌操作台上，用滤纸吸干表面的水分，用75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗3-5次，然后放入含有3-4滴吐温20的10%的次氯酸钠(有效氯1%)中消毒15min，无菌水冲洗3-5次，将叶片放在无菌滤纸上，切割成0.25cm2大小备用。3.2愈伤组织的诱导采用常规的组织培养方法(潘瑞炽.植物组织培养.第三版.广州:广东高等教育教出版社，2003，64)培养珊瑚菜叶片，诱导愈伤组织生成。愈伤组织的诱导培养基为MS+2, 4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L，光照周期为 16h:8h(光 / 暗)，其中光照温度为25±2°C，黑暗温度为20±2°C。4、实验结果离体培养和外源激素是形成愈伤组织的关键条件，珊瑚菜叶片经含有2，4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L的MS培养基成功诱导培养出浅黄色透明的愈伤组织。叶片经培养3d后吸水膨胀，实验结果如图1所示，7d左右长出颗粒状愈伤组织(图
1-1);随后愈伤组织逐渐积累(图1-2) ;20d左右形成愈伤组织团(图1-3) ;40d后形成疏松的愈伤组织团(图1-4)。二、珊瑚菜不定根的诱导1、实验材料以上述获得的长势均匀健康的珊瑚菜叶片愈伤组织为实验材料。1/2MS培养基为大量元素减半，其它元素不变的MS培养基，蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6g/L。不定根诱导的培养基为含不同浓度IBA的1/2MS培养基。2、生化试剂和主要仪器MS培养基所用各成分等常规试剂为国产分析纯试剂。IBA为上海生物工程公司化学分析纯产品。主要仪器:无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培养箱等组织培养常用仪器。3、实验方法采用常规组织培养方法，通过含不同浓度IBA的1/2MS培养基诱导愈伤组织形成不定根，IBA分为5个浓度梯度，分别为:l、2、3、4、5mg/L，并以不含IBA的1/2MS培养基作对照，每个浓度及对照分别培养30块大小均匀的愈伤组织块，并设三个平行。黑暗培养，培养温度为25±2°C。记录各条件下最早生根时间，并培养至生根稳定，统计不同条件下愈伤组织块的生根率及平均根长，获得的实验数据采用DPS数据处理软件进行方差分析。4、结果与分析将愈伤组织切割转移至对照及不同浓度IBA的1/2MS培养基中，各培养条件下均生成了不定根。IOd左右愈伤组织在含有各浓度IBA的培养基上相继长出不定根，浓度较高的培养基生根时间相对较早，对照组生成不定根的时间最晚。记录最早生根时间，45d后生根率稳定，不再有新的不定根生成，统计各浓度下生根率及平均根长，实验结果见表I。表I不同IBA浓度下珊瑚菜不定根的诱导结果
权利要求
1.一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于它包括以下步骤: (1)获得珊瑚菜无菌苗； (2)培养供感染用的发根农杆菌； (3)转化外植体进行共培养:取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取根、叶柄或叶片作为外植体，在其表面划出伤口用于感染，放入发根农杆菌菌液中浸泡，然后放入MS固体培养基中共培养，直至外植体周边出现菌斑； (4)诱导毛状根发生:将出现菌斑的外植体清洗后，放入含有头孢噻肟钠的1/2MS培养基中培养，定期更换1/2MS培养基，在更换的培养基中逐步降低头孢噻肟钠的浓度，直到在完全除掉头孢噻肟钠的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系； (5)毛状根的培养增殖:将除菌完全、生长快速的毛状根接种在1/2MS液体培养基中，振荡培养增殖，获得大量毛状根。
2.根据权利要求1所述的珊 瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(I)中选择饱满的珊瑚菜种子，灭菌，后接种于MS固体培养基中培养获得无菌苗。
3.根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(2)中所用菌种为发根农杆菌1.2556。
4.根据权利要求1或3所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(2)中发根农杆菌的感染菌液最佳浓度为OD6tltl=0.08。
5.根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(3)中所述外植体优选为无菌苗的根，其次为叶柄，再次为叶片。
6.根据权利要求1或3所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(3)中珊瑚菜无菌苗放入发根农杆菌菌液中浸泡15-30min。
7.根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:所述步骤(3)中共培养时间为2-5d。
8.根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于所述步骤(4)中将外植体放入含有头孢噻肟钠300mg/L的1/2MS培养基中，于25°C黑暗培养13_16d。
9.根据权利要求8所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于所述步骤(4)中在1/2MS培养基中培养每7-10d换一次培养基，最初头孢噻肟钠的浓度为300mg/L，逐步降低头孢噻肟钠的浓度为每换一次培养基降低50mg/L头孢噻肟钠。
10.根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于:利用分光光度法测定珊瑚菜毛状根中香豆素含量的波长为325nm。
全文摘要
本发明提供了一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，它包括获得珊瑚菜无菌苗；培养供感染用的发根农杆菌；转化外植体进行共培养；诱导毛状根发生和毛状根的培养增殖。本发明利用发根农杆菌感染诱导珊瑚菜毛状根的形成，建立离体毛状根培养系统，并分析测定了其药用成分香豆素的含量，与不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量进行了对比，以毛状根中香豆素的含量最高，本发明中珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素；为将来利用毛状根工业化生产珊瑚菜次级代谢产物提供了新的途径，从另一方面保护该濒危植物，有利于维护生态平衡。
文档编号C12N5/04GK103146638SQ20131008163
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者辛华, 马蓓蓓, 刘汉柱 申请人:青岛农业大学