专利名称：一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，属于功能性乳制品开发技术领域。
背景技术：
血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,简称ACE)抑制肽作为一类具有抑制ACE活性的肽类物质，通过抑制ACE的活性，阻碍有升高血压作用的血管紧张素II的生成，同时抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，从而使高血压下降，达到降血压的功能。目前已有的治疗高血压的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂有卡托普利、阿拉普利等，这些是化学合成物，吸收排泄速度快，会引起咳嗽，肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用，而来源于动物或者植物蛋白的ACE抑制肽，安全可靠。因此，寻找天然的ACE抑制肽则变得非常重要。乳清是生产奶酪的副产物，其再开发是近几年来的研究热点。乳清蛋白中包含有许多生物活性肽序列，可以通过发酵或者酶解的手段得到。目前有关从乳清蛋白中酶解得到ACE抑制肽的报到中使用的酶都为游离酶，利用游离酶制备ACE抑制肽存在一定的弊端:(O不能重复利用，难以将产物和酶分离，需要进一步纯化；(2)游离酶不易保存，易失活而增加成本等。这一系列弊端使ACE抑制肽的大规模生产存在成本高而不稳定的问题。针对以上ACE抑制肽生产中存在的问题，本发明将瑞士乳杆蛋白酶固定化，并且利用了填充床反应器实现乳清ACE抑制肽的连续制备。近年来研究发现瑞士乳杆菌制作的发酵乳具有较强的降血压功能，主要是因为瑞士乳杆菌蛋白酶能水解蛋白产生多肽，即血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。瑞士乳杆菌蛋白酶固定化后可以重复利用，将其作为填充床反应器的填充载体可以实现ACE抑制肽的规模制备。填充床反应器，又称固定床反应器，就是将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后以一定的流速通入水解底物，在一定的反应条件下实现酶催化反应，收集水解产物。填充床反应器具有如下优点:高效率、易操作、结构简单等，它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液。迄今为止，国内外虽然有很多关于ACE抑制肽的机制研究和分离方法研究，但是连续大规模制备ACE抑制肽的研究还是较少见的，本发明使用填充床反应器可以实现ACE抑制肽的连续化制备，对乳源ACE抑制肽的生产开发具有一定的经济价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的:本发明的目的是提供一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法。 —种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法是，将海藻酸钠与瑞士乳杆菌蛋白酶酶液混匀，用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤浙干，即得到固定化蛋白酶；以固定化瑞士乳杆菌蛋白酶为填充床反应器的填充载体，进行乳源ACE抑制肽的制备；水解液经中空纤维膜超滤，冷冻干燥后制成ACE抑制肽产品。
本发明的具体步骤如下:( I)海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶将瑞士乳杆菌用液体MRS培养基37°C培养16-24h。4°C，4500r/min，离心20min，收集瑞士乳杆菌菌体，并洗涤三次。取瑞士乳杆菌菌体，用PH7.8Tris-HCl缓冲液重新悬浮，菌体与缓冲液比例为Ig:30mL，搅匀后在300W，破碎时间3s，间隔时间5s的超声波破碎条件下破碎200次。将破碎液于4°C，4500r/min，离心20min，取上清液即为瑞士乳杆菌蛋
白酶液。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白含量为8mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀。4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。(2)海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶填充床反应器的制备把固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液(质量浓度5g/100mL的WPC-80浓缩乳清粉)充分混合后装入1.2cmX80cm的填充柱，具体装置见图1。固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中静置水解8h，然后开启恒流泵实现连续式水解，流速为
3.2mL/h，连续收集2d。(3)乳源ACE抑制肽的超滤
选用截留分子量为6000Da的中空纤维超滤膜进行超滤，料液温度为37°C，超滤压力为0.05Mpa，超滤液进行冷冻干燥后即得到ACE抑制肽产品。本发明的有益效果:本发明提供了一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，采用固定化瑞士乳杆菌蛋白酶作为填充床载体，可以重复利用，而且方便产物的分离，从而可以降低生产成本及实现ACE抑制肽的连续化及规模化制备。乳源性ACE抑制肽虽然其效果不及药物，但其具备天然、无毒副作用的特点无疑是控制血压的更佳选择。乳源ACE抑制肽可添加到奶粉、酸奶、麦片等日常食物中，也可以制成片剂或口服液满足不同人群的需要，长期服用可以起到预防和辅助治疗高血压疾病及其并发症的作用。所以本发明的研究不仅存在着巨大的市场潜力，并且对提高国民健康素质有重要作用。
图1为填充床反应器连续制备ACE抑制肽的设备示意图(注:1-层析柱(37°C恒温)；2_水解底物；3_填充载体；4_恒流泵；5_塑料管；6_水解产物；7_水解底物；8_铁架台)。图2A为奶粉浓度对ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影响。图2B为乳清粉浓度对ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影响。图3为前静止水解时间对ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影响。图4A为填充床流速对ACE抑制肽蛋白含量的影响。图4B为填充床流速对和ACE抑制肽ACE抑制率的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，常规的瑞士乳杆菌均可用于本发明，下面实施例所用的具体菌株，是为了举例说明本发明，不是对本发明技术方案的限制。本发明的保护范围不限于此。1.材料与设备1.1主要材料与试剂海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶实验室制备；脱脂奶粉光明乳业股份有限公司；WPC-80浓缩乳清粉浓缩蛋白粉美国HILMAR公司；其它试剂南京化学试剂有限公司。1.2主要设备LRH-250A生化培养箱广东省医疗器械厂；CL_22M高速冷冻离心机赛特湘仪离心机有限公司；754紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；填充柱(1.2cm*80cm)上海煊盛仪器有限公司；HH-Sll-2电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂；DHL-A电脑恒流泵上海沪西分析仪器厂有限公司；实验用膜分离设备上海摩速科学器材有限公司。1.3本发明填充床反应器连续制备ACE抑制肽的设备如图1，由层析柱I ;水解底物2 ;填充载体3 ;恒流泵4 ;塑料管5 ;水解产物6 ;水解底物7 ;铁架台8构成。2实验方法2.1海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶将瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus ATCC15009)用液体 MRS 培养基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐温-801g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，水 合硫酸镁0.5g，水合硫酸锰0.05g,蒸馏水1L，121°C高温灭菌20min)37°C培养16_24h。4°C，4500r/min，离心20min，收集瑞士乳杆菌菌体，并洗涤三次。取瑞士乳杆菌菌体，用PH7.8Tris-HCl缓冲液重新悬浮，菌体与缓冲液比例为Ig: 30mL,搅匀后在300W，破碎时间3s，间隔时间5s的超声波破碎条件下破碎200次。将破碎液于4°C，4500r/min,离心20min,取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白含量为8mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀。4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。2.2固定化瑞士乳杆菌蛋白酶连续制备乳源ACE抑制肽工艺条件选择2.2.1水解底物及其浓度的选择用奶粉配制质量浓度为9g/100mL、10g/100mL、Ilg/100mL、12g/100mL、13g/100mL的牛乳各5mL，用WPC-80浓缩乳清粉配制质量浓度为4g/100mL、5g/100mL、6g/100mL、7g/100mL、8g/100mL的乳清各5mL，分别装在IOmL的试管中，在95°C水浴锅中杀菌20min，冷却后每管加入3g海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。放入37°C恒温培养箱中水解8h。取出水解液后测定蛋白含量和ACE抑制率，确定反应最佳的底物及其底物浓度。2.2.2前静置水解时间的选择取5g/100mL的WPC-80浓缩乳清粉5mL，杀菌(95°C，20min)后，分装在12个试管中，每个试管中加入3g海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶，放入37°C恒温培养箱中水解，每隔Ih测定水解液的蛋白含量和ACE抑制率，确定前静置水解时间。2.2.3流速的选择按图1所示装好填充床反应器，选取1.2cm*80cm的填充柱，往柱内缓慢加入质量浓度为5g/100mL的WPC-80浓缩乳清粉和固定化瑞士乳杆菌蛋白酶的混合物,加至距填充柱顶端2cm时停止。先静置水解恒定时间后，再连续水解2天，水解温度为37°C，进样流速分别设定为6.4mL/h、3.2mL/h和1.6mL/h,期间每隔4h收集I管水解液，测蛋白含量和ACE抑制率，确定最佳流速。2.3蛋白含量测定方法采用双缩脲法测定蛋白含量。收集到的样品(水解液)稀释5倍，先加入ImL稀释后的样品，再加入4mL双缩脲试剂(每IL双缩脲试剂需要1.5g硫酸铜、6.0g酒石酸钾钠和300mL10%氢氧化钠溶液加蒸馏水配制而成)充分混匀后，在室温下(20 25°C )放置30min，在波长540nm处比色，调零管不加样品，直接加ImL蒸馏水进行比色。测得后按下列标准曲线公式计算:P(mg)=5X (0.0477A+0.001)，此公式根据双缩脲标准曲线拟合得到。式中:P表示蛋白含量(mg);A表示在540nm处比色测得的吸光值。2.4ACE抑制活性测定先对测定样品(水解液)进行处理，用50%乳酸调节pH至3.4 3.6，离心(5000r/min, 15min,4°C)收集上清液,再用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.3,离心(5000r/min,15min，4°C)收集上清液备用。测ACE抑制率米用Cushman和Cheung的方法。在IOmL试管中加入200 μ L的
5.0mmol/LHip-His-Leu溶液(简称HHL溶液)和80 μ L的按上述方法处理完的样品，在37°C下保温311^11，再加入2(^1^ ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.lU/mL)，混匀后在37°C下保温30min，再加入250 μ L的1.0moI/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，经15秒种振荡混匀后，静置5分钟后会有明显分层，吸取1.0mL上层的醋酸乙酯，120°C烘箱烘干后，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在228nm处测定吸光度。
ACE 抑制率=[(B-A) /B] X 100%注:A为添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度；B为不添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度。3结果与分析3.1底物及其浓度的选择由图2-A可以看出，当牛乳浓度为12g/100mL时，蛋白含量最低，说明在此浓度下，固定化瑞士乳杆菌蛋白酶可以最大程度地水解牛乳蛋白，此时水解度是最大的，同时，在12g/100mL浓度下，ACE抑制活性也最高，达到56.13%±0.028，也证明了在此浓度下，水解度最大，产生ACE抑制肽最多；图2-B显示当底物为WPC-80浓缩乳清粉时，水解产物蛋白含量呈下降趋势，同样的，ACE抑制率没有明显上升或下降趋势，但总体来说，在50 65%之间，WPC-80浓缩乳清粉浓度为5g/100mL时，ACE抑制率最高达到62.26%±0.033。从图中显示乳清蛋白更易作为瑞士乳杆菌蛋白酶的水解底物，ACE抑制率也是以WPC-80浓缩乳清粉为底物的反应系统更高。实验选择5g/100mL的WPC-80浓缩乳清粉为最佳浓度的底物。
3.2前静置水解时间的选择由图3看出，随着水解时间的变化，蛋白含量在I 3h后开始呈下降趋势，说明此时蛋白水解度增大，图中也可以看到乳清蛋白水解产物ACE抑制活性逐渐上升，此时开始逐渐产生ACE抑制肽；在4 8h时，蛋白含量逐渐下降，而ACE抑制率则处于稳定生成的状态；当水解至9h，蛋白含量不再发生明显改变，此时乳清蛋白水解产物ACE抑制活性也不再上升。综合蛋白含量和ACE抑制率考虑，结合实验成本分析，选择8h为最佳前静置时间。3.3流速的选择由图4可以看出，在填充床反应器中使用不同流速对蛋白含量和ACE抑制率有不同程度的影响。在流速为6.4mL/h时，蛋白含量最高，ACE抑制活性最低，说明流速太快在柱内通过时间短，与固定化瑞士乳杆菌蛋白酶反应不充分，即没有彻底利用底物中的蛋白质进行水解；流速为1.6mL/h时，蛋白含量处于中间值，ACE抑制活性也处于中间值，说明流速过慢，会导致底物过度在固定化瑞士乳杆菌蛋白酶周围积累，也不利于固定化蛋白酶和底物的充分接触；在流速为3.2mL/h时，蛋白含量最低，表示在此流速下，乳清蛋白可以和固定化瑞士乳杆菌蛋白酶充分反应水解，水解度最高，同时在此流速下，ACE抑制活性最高达到40.22%±0.015。结合流速对蛋白含量和ACE抑制率的影响，最终选取流速为3.2mL/h为填充床反应器的最佳流速。3.4ACE抑制肽的超滤在料液温度为37°C，超滤压力为0.05Mpa，选用截留分子量为6000Da的中空纤维超滤膜进行超滤，超滤液进行冷冻干燥后即得到ACE抑制肽产品。
4实验结论本发明了一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液(质量浓度5g/100mL的WPC-80浓缩乳清粉)先于1.2cm*80cm的填充柱中静置水解8h，然后开启恒流泵实现连续式水解2天，流速为3.2mL/h, ACE抑制率达到 40.22%± 0.015。
权利要求
1.一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶 将瑞士乳杆菌用液体MRS培养基37°C培养16-24h，4°C，4500r/min,离心20min，收集瑞士乳杆菌菌体，并洗涤三次，取瑞士乳杆菌菌体，用pH 7.8 Tris-HCl缓冲液重新悬浮，菌体与缓冲液比例为Ig:30mL，搅匀后在300W，破碎时间3s，间隔时间5s的超声波破碎条件下破碎200次，将破碎液于4°C，4500r/min，离心20min，取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液； 在30mL蛋白含量为8mg/mL的瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用，用注射器吸取混合液，以15cm高度滴入0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球，4° C条件下静置4h，洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶； (2)海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌蛋白酶填充床反应器的制备 把固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液充分混合后装入填充柱中；固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中静置水解8h，然后开启恒流泵实现连续式水解，流速为3.2mL/h，连续收集2d ； 3)乳源ACE抑制肽的超滤 选用截留分子量为6000Da的中空纤维超滤膜进行超滤，料液温度为37°C，超滤压力为0.05Mpa，超滤液进行冷冻干燥后即得到ACE抑制肽产品。
2.根据权利要求1所述的一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，其特征在于，所述乳清蛋白溶液是质量浓度5g/100mL的WPC-80浓缩乳清，所述的蛋白酶来源于瑞士乳杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，其特征在于，固定化瑞士乳杆菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中静置水解一段时间，然后再进行连续式水解。
全文摘要
本发明公开了一种填充床反应器制备血管紧张素转化酶(简称ACE)抑制肽的方法。将海藻酸钠与瑞士乳杆菌蛋白酶酶液混匀，用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤沥干，即得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶；以固定化瑞士乳杆菌蛋白酶为填充床反应器的填充载体，WPC-80浓缩乳清粉为水解底物，进行乳源ACE抑制肽的制备；水解液经中空纤维膜超滤、冷冻干燥后制成ACE抑制肽产品。本发明降低了ACE抑制肽的生产成本，可实现ACE抑制肽的连续制备。
文档编号C12R1/225GK103215330SQ20131008399
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者郭宇星 申请人:南京师范大学