专利名称：一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种制备重组人干扰素a 2b的发酵培养基及发酵方法。
背景技术：
随着基因工程技术的发展，工程菌的发酵工艺得到极为广泛的应用，生物工程菌发酵的目的是获得大量的外源性的基因产物，尽可能减少宿主细胞及外来因素的污染，所以高密度、高产率高表达的培养已经成为发酵工业的目标和方向。在高密度表达方面，大肠杆菌是最具代表性及应用最广的宿主菌，大肠杆菌中重组蛋白表达方式有二种，一种为组成型表达，一种为诱导性表达， 目前，在重组蛋白工程菌的高密度发酵培养中，大多为诱导性表达的菌种，其优点在于通过温度诱导或化学诱导，可使工程菌在短时间内迅速生长，达到高比生长速率，同时达到最大表达量，缺点在于在细菌迅速生长的过程中细菌的代谢产物也会迅速产生，如有机酸、二氧化碳等有害物质的迅速积累会抑制细菌的生长和产物的表达，而最大的副产物乙酸的产生，一般认为细菌在低比生长速率条件下，通过氧化代谢作用产生的能量中足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH，这样就会过多产生乙酸，而酸的增加会对细菌繁殖及产物表达抑制作用，同时也会对后续提纯带来很大的负担。大肠杆菌中重组蛋白的组成型表达方式是一种缓慢表达的方式，无需诱导，在细菌生长的过程中持续生长及表达，其生长周期内因没有诱导迅速生长的过程，生长速度均匀，代谢产物中乙酸含量低，可获得理想的产物表达率，但很难实现高密度培养。因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备重组人干扰素a 2b的发酵培养基及发酵方法，通过一种特定培养基及发酵过程的控制，实现组成型表达的重组人干扰素a 2b工程菌的高密度培养及高效表达。本发明的技术方案如下:
一种适用于组成型表达的重组人干扰素a 2b工程菌的发酵培养基，其按照重量份其包括以下组分:
胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2_4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份。所述的发酵培养基，其中，胰蛋白胨浓度为25-35 g/L，酵母提取物的浓度为15-25g/L,磷酸氢二钠浓度为4-8 g/L,磷酸二氢钾浓度为2-4 g/L,氯化铵浓度为0.4-0.6g/L，氯化钠浓度为0.4-0.6 g/L，硫酸镁浓度为0.2-0.4g/L，氯化钙浓度为0.05-0.15 g/L与丙三醇浓度为10-20g/L。一种制备重组人干扰素a 2b的发酵方法，其包括以下步骤:
A、按照重量份将胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份加入发酵罐中，并向所述发酵罐中加入注射用水充分混合得到培养基;
B、再向所述发酵罐中加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，调节所述培养基的PH值到7.0±0.2，然后再将工程菌菌种接种到所述培养基进行培养，所述发酵罐中培养温度为37°C，得到发酵产物；
C、将所述发酵产物采用低温离心法得到菌体，并对所述菌体进行裂解及一系列提纯，获得重组人干扰素a 2b蛋白。所述的发酵培养方法，其中，所述步骤B还包括:
B1、向所述发酵罐中加入所述磷酸，将所述培养基的PH值调节至4.2±0.2，并在121°C条件下灭菌15分钟；
B2、将灭菌后的所述培养基温度控制在37°C，然后向所述发酵罐中加入50%的氢氧化钠溶液，将所述培养基的PH值调整至7.0±0.2 ;
B3、发酵培养过程中向所述发酵罐中适时加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，控制所述培养基的PH值为7.0±0.2 ;随着细菌生长培养基的溶解氧自90%逐渐降低至零。本发明提供了一种制备重组人干扰素a 2b的发酵培养基及发酵方法，以丙三醇为唯一碳源，以适量磷酸盐浓度调整目的蛋白的表达速率，并将培养基于酸性条件下灭菌，减少灭菌时间以减少培养基营养成分的流失，培养过程中以50%的磷酸及50%氢氧化钠作为酸碱调节剂来调节发酵液的PH值，保证了工程菌良好的生长状态，实现了高密度培养和高效表达，本发明工艺简单，代谢副产物少，有利于表达产物的后续提纯，降低了重组人干扰素a 2b的制造成本。
图1为本发明中发酵方法的流程示意 图2为本发明中工程菌生长曲线与目的蛋白表达的动态 图3为本发明中发酵产物的电泳图谱的示意图。
具体实施例方式本发明提供了一种制备重组人干扰素a 2b的发酵培养基及发酵方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供了一种适用于组成型表达的重组人干扰素a 2b工程菌的发酵培养基配方，其按照重量份其包括以下组分:胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠
4-8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份。更进一步的，胰蛋白胨浓度为25-35 g/L，酵母提取物的浓度为15-25 g/L，磷酸氢二钠浓度为4-8 g/L,磷酸二氢钾浓度为2-4 g/L,氯化铵浓度为0.4-0.6g/L，氯化钠浓度为
0.4-0.6 g/L,硫酸镁浓度为0.2-0.4g/L，氯化钙浓度为0.05-0.15 g/L与丙三醇浓度为10-20g/L。以丙三醇为唯一碳源，以适量磷酸盐浓度调整目的蛋白的表达速率，并将培养基于酸性条件下灭菌，减少灭菌时间以减少培养基营养成分的流失，培养过程中以50%的磷酸及50%氢氧化钠作为酸碱调节剂来调节发酵液的PH值，保证了工程菌良好的生长状态，实现了高密度培养和高效表达。本发明提供了一种制备重组人干扰素a 2b的发酵方法，如图1所示的，其包括以下步骤:
步骤101:按照重量份将胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙
0.05-0.15份与丙三醇10-20份加入发酵罐中，并向所述发酵罐中加入注射用水充分混合
得到培养基；
步骤102:再向所述发酵罐中加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，调节所述培养基的PH值到7.0±0.2，然后再将工程菌菌种接种到所述培养基进行培养，所述发酵罐中培养温度为37°C，得到发酵产物；
步骤103:将所述发酵产物采用低温离心法得到菌体，并对所述菌体进行裂解提纯，获得重组干扰素a 2b蛋白。其更为具体的:
先按照重量份将胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0. 4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份加入发酵罐中，并向所述发酵罐中加入规定数量的注射用水充分混合溶解上述培养基。然后以50 %磷酸调整PH至4.2±0.2，121°C灭菌15分钟；
在将上述培养基冷却至37°C，以50%氢氧化钠溶液调整PH到7.0±0.2，接种合适的工程菌种子液进行培养；
其中发酵过程中培养参数为:培养温度37°C，pH值为7.0 土 0.2，溶解氧90 %，搅拌转数 200rpm ；
培养过程中根据细菌生长环境的需要补加50 %磷酸和50 %.的氢氧化钠调整pH值，泡沫用消泡剂来控制，最初溶解氧设定为90 %,随着细菌生长溶解氧渐渐下降为零；
而当继续培养至12 14小时，细菌的生长率和目的蛋白的合成量达到高峰时，停止培
养;
最后，采用低温离心法收集菌体，以SDS-PAGE电泳法及ELISA法检测干扰素纯度及含量，检测合格后将对菌体进行裂解及提纯，得到重组干扰素a 2b蛋白。更进一步的，所述步骤102还包括:
向所述发酵罐中加入所述磷酸，将所述培养基的PH值调节至7.0 土 0.2，并在121°〇条件下灭菌15分钟；
将灭菌后的所述培养基温度控制在37°C，然后向所述发酵罐中加入50%的氢氧化钠溶液，将所述培养基的PH值调整至7.0±0.2 ;
发酵培养过程中向所述发酵罐中适时加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，控制所述培养基的PH值为7.0±0.2 ;随着细菌生长培养基的溶解氧自90%逐渐降低至零。本发明工艺简单，代谢副产物少，有利于表达产物的后续提纯，降低了重组干扰素a2b的制造成本。为了更进一步描述本发明，以下列举更具体的实施例进行说明。实施例1
发酵培养基的组分为:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氢二钠1200g，磷酸二氢钾600g，氯化铵100g，氯化钠100g，硫酸镁60g，氯化钙20g与丙三醇3000g。制备重组人干扰素a 2b的发酵培养方法包括以下步骤:
按照重量将上述组分制作成培养基；
在300L发酵罐中以适量的注射用水中溶解所述培养基，总体积定容至200L ；
以磷酸调整所述培养基的PH值至4.2±0.2，并在121°C条件下灭菌15分钟；
然后再将所述培养基冷却至37 °C，以50%氢氧化钠溶液调整所述培养基PH值到7.0±0.2，接种重组人干扰素工程菌种子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)进行培养；
然后将接种后的所述培养基在培养温度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，搅拌速度200+/- 5 r.p.m ,通气量0.5 vvm.,操作压力0.5 atm.,溶解氧90 % min的条件下发酵培养；并且根据细菌生长环境的需要定时补加50 %的磷酸和50 %的氢氧化钠调整pH值在7.0 土 0.2;在发酵过程中产生泡沫时用消泡剂来控制；如图2所示的，采用本发明方法实现了组合型表达的工程菌的高密度培养和目的蛋白的高效表达；
将上述培养基连续续培养至12 14小时，检测OD6tltl为24.00，停止培养；
最后将停止培养后的所述培养基采用低温离心法收集菌体，获得菌体4370g，以SDS-PAGE电泳法检测，蛋白表达量为30.9%，ELISA法检测干扰素含量200.44g/L，对菌体进行裂解及提纯后，可获得重组干扰素a 2b蛋白。实施例2
发酵培养基的组分为:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氢二钠1200g，磷酸二氢钾600g，氯化铵100g，氯化钠100g，硫酸镁60g，氯化钙20g与丙三醇3000g。制备重组人干扰素a 2b的发酵培养方法包括以下步骤:
按照重量将上述组分制作成培养基；
在300L发酵罐中以适量的注射用水中溶解所述培养基，总体积定容至200L ；
以磷酸调整所述培养基的PH值至4.2±0.2，并在121°C条件下灭菌15分钟；
然后再将所述培养基冷却至37 °C，以50%氢氧化钠溶液调整所述培养基PH值到
7.0±0.2，接种重组人干扰素工程菌种子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)进行培养；
然后将接种后的所述培养基在培养温度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，搅拌速度200 +/- 5 r.p.m ,通气 量0.5 vvm.,操作压力0.5 atm.,溶解氧90 % min的条件下发酵培养；并且根据细菌生长环境的需要定时补加50 %的磷酸和50 %的氢氧化钠调整pH值在7.0 土 0.2;在发酵过程中产生泡沫时用消泡剂来控制；如图3所示的，采用本发明方法实现了组合型表达的工程菌的高密度培养和目的蛋白的高效表达；
将上述培养基连续续培养至12 14小时，检测OD6tltl为25.20，停止培养；
最后将停止培养后的所述培养基采用低温离心法收集菌体，获得菌体5200g，以SDS-PAGE电泳法检测，蛋白表达量为31.6%，ELISA法检测干扰素含量253.38g/L，对菌体进行裂解及提纯后，可获得重组干扰素a 2b蛋白。
实施例3
发酵培养基的组分为:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氢二钠1200g，磷酸二氢钾600g，氯化铵100g，氯化钠100g，硫酸镁60g，氯化钙20g与丙三醇3000g。制备重组人干扰素a 2b的发酵培养方法包括以下步骤:
按照重量将上述组分制作成培养基；
在300L发酵罐中以适量的注射用水中溶解所述培养基，总体积定容至200L ；
以磷酸调整所述培养基的PH值至4.2±0.2，并在121°C条件下灭菌15分钟；
然后再将所述培养基冷却至37 °C，以50%氢氧化钠溶液调整所述培养基PH值到
7.0±0.2，接种重组人干扰素工程菌种子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)进行培养；
然后将接种后的所述培养基在培养温度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，搅拌速度200 +/- 5 r.p.m ,通气量0.5 vvm.,操作压力0.5 atm.,溶解氧90 % min的条件下发酵培养；并且根据细菌生长环境的需要定时补加50 %的磷酸和50 %的氢氧化钠调整pH值在7.0 土 0.2;在发酵过程中产生泡沫时用消泡剂来控制；如图2与图3所示的，采用本发明方法实现了组合型表达的工程菌的高密度培养和目的蛋白的高效表达；
将上述培养基连续续培养至12 14小时，检测OD6tltl为24.30，停止培养；
最后将停止培养后的所述培养基 采用低温离心法收集菌体，获得菌体4830g，以SDS-PAGE电泳法检测，蛋白表达量为39.8%，ELISA法检测干扰素含量445.67g/L，对菌体进行裂解及提纯后，可获得重组干扰素a 2b蛋白。为了更进一步凸显本发明的先进性，以下列举部分现有技术中的制备重组人干扰素a 2b的发酵培养方法，进行对比。实施例4
现有技术中重组干扰素a 2b工程菌培养基的组分为:胰蛋白胨20g/L、酵母提取物12g/L、葡萄糖13.7g/L、氯化钠10g/L、磷酸氢二钾2.3g/L、磷酸二氢钾1.5g/L与硫酸镁
0.25g/L0现有技术中制备重组人干扰素a 2b的发酵培养方法包括以下步骤:
按照重量将上述组分制作成培养基；
在300L发酵罐中配制200L上述培养基；
以4摩尔氢氧化钠调整所述培养基pH值为7.0 ±0.2，并在121 °C条件下灭菌30分钟；将所述培养基冷却至37°C，接种重组人干扰素工程菌种子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)进行培养；
然后将接种后的所述培养基在培养温度为37土 0.5 0C 411值控制在7.0 ±0.2，搅拌速度250 +/- 5 r.p.m ,通气量0.5 vvm,操作压力0.5 atm.，溶解氧30-75 % min.的条件下发酵培养；并且根据细菌生长环境的需要定时补加50 %的氢氧化钠调整pH值在7.0± 0.2 ;在发酵过程中产生泡沫时用消泡剂来控制；
将上述培养基连续续培养至14小时，检测0D_为18.2时，停止培养；
最后将停止培养后的所述培养基采用低温离心法收集菌体，获得菌体2500g，以SDS-PAGE电泳法检测，蛋白表达量为18.5%, ELISA法检测干扰素含量145.22 mg/L，对菌体进行裂解及提纯后，可获得现有技术中重组干扰素a 2b蛋白。将实施例1、实施例2、实施例3获得之重组干扰素a 2b蛋白与实施例4获得之现有技术中重组干扰素a 2b蛋白进行检测，将检测结果列于表1，从表1、图2与图3中可看出实施例1、实施例2、实施例3的培养均值以及菌体重量可达到4.8kg，干扰素的表达量可达34.1%，ELISA检测干扰素蛋白量为299.83，明显优于对照组实施例4的结果。
权利要求
1.一种制备重组人干扰素a 2b的发酵培养基，其按照重量份其包括以下组分: 胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2_4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，胰蛋白胨浓度为25-35g/L，酵母提取物的浓度为15-25 g/L，磷酸氢二钠浓度为4-8 g/L，磷酸二氢钾浓度为2-4 g/L，氯化铵浓度为0.4-0.6g/L，氯化钠浓度为0.4-0.6 g/L,硫酸镁浓度为0.2-0.4g/L，氯化钙浓度为0.05-0.15 g/L与丙三醇浓度为10-20g/L。
3.一种制备重组人干扰素a 2b的发酵方法，其包括以下步骤: A、按照重量份将胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4_8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇IO - 2 O份加入发酵罐中，并向所述发酵罐中加入注射用水充分混合得到培养基; B、再向所述发酵罐中加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，调节所述培养基的PH值到7.0±0.2，然后再将工程菌菌种接种到所述培养基进行培养，所述发酵罐中培养温度为37°C，得到发酵产物； C、将所述发酵物采用低温离心法得到菌体，并对所述菌体进行裂解提纯，获得重组干扰素a 2b蛋白。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤B还包括: B1、向所述发酵罐中加入所述磷酸，将所述培养基的PH值调节至4.2±0.2，并在121°C条件下灭菌15分钟； B2、将灭菌后的所述培养基温度控制在37°C，然后向所述发酵罐中加入50%的氢氧化钠溶液，将所述培养基的PH值调整至7.0±0.2 ; B3、发酵培养过程中向所述发酵罐中适时加入磷酸与50%的氢氧化钠溶液，控制所述培养基的PH值为7.0±0.2 ;随着细菌生长培养基的溶解氧自90%逐渐降低至零。
全文摘要
本发明公开了一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法，包括一种适用于组成型表达的重组人干扰素α2b工程菌的发酵培养基配方及其发酵培养方法，发酵培养基配方其按照重量份其包括以下组分胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氢二钠4-8份，磷酸二氢钾2-4份，氯化铵0.4-0.6份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸镁0.2-0.4份，氯化钙0.05-0.15份与丙三醇10-20份，发酵方法的培养过程中以丙三醇为唯一碳源，以适量磷酸盐浓度调整目的蛋白的表达速率，保证了工程菌良好的生长状态，实现了高密度培养和高效表达。
文档编号C12P21/02GK103146787SQ201310084878
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者郭德本, 刘芃实, 刘长春, 贺永山, 卡特琳娜·阿尔瓦斯 申请人:长春海伯尔生物技术有限责任公司