专利名称：云南红梨PyMYB基因及其原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨色素和毛状体发生发育调控蛋白基因PyMYB及其原核表达载体，和原核表达载体和PyMYB抗体的应用。
背景技术：
红色表皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究表明，在拟南芥中，MYB转录因子PAP1/MYB75通过调控拟南芥花青素生物合成途径中的关键酶调控花青素的合成；拟南芥tt (TRANSPARENT TESTA)突变体中，类黄酮生物合成途径的许多步骤都是由MYB_bHLH复合物调控的，该复合物主要催化黄酮醇合成级联反应中的查尔酮合酶(CK )、查尔酮异构酶W/)、二氢黄酮醇还原酶(/ )和黄酮醇合酶0 )基因都是在光应答下协同表达的；油菜中过表达拟南芥MYB转录因子PAPl，导致叶片中酚类化合物大幅度的上升；ESpley等人将苹果中MdMYBlO转录因子在苹果中过表达，获得了红色的转基因苹果；Feng等将“奥冠”梨中的PyMYBlO在拟南芥中过表达，结果增强了拟南芥成熟种子中花青素的含量。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和MYB蛋白(GL1，PAPU PAP2、CPC、TRY)组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等人通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，bHLH转录因子GL3，MYB转录因子GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB, CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。Gonzalez等人发现MYB5和TT2 (MYB)与TTGl能够形成复合物控制外种皮的分化。目前，对云南红梨着色机理研究表明，云南红梨果皮花青素的生物合成可能是由MYB/bHLH/WD40调控的。但是还没有专门用于准确检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、高效的进行PyMYB蛋白的纯化、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况及研究蛋白互作的抗体。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨I号’ PyMYB转录因子基因的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化抗体制备的工作，将弥补这方面的空白，也将为研究云南红梨果皮MYB转录因子在果皮着色机理及果实育种中提供工具。云南红梨属于稀有资源，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，深受广大消费者青睐。因此，红梨将成为梨产业发展的主要方向，红梨育种成为梨树育种的重要目标。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本发明的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云南红梨基因，该基因来源于云南红梨，该基因是云南红梨花青素和毛状体发生发育调控因子，基因在R2结构域中具有所有花青素调控蛋白中的R残基，其R3结构域中具有碱性螺旋环螺旋(bHLH)结合结构域，其C末端也具有 Motif 6。
本发明另一目的是提供云南红梨基因的原核表达载体pGEX-4T_/y#7凡该载体含有招基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/>#73基因的N端含有GST标签。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白PyMYB中，PyMYB蛋白其具有典型的R2R3MYB结构域。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备PyMYB特异性抗体中，PyMYB特异性抗体应用在PyMYB蛋白的亚细胞定位检测、PyMYB蛋白的纯化、PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段的高效分离、检测其在转基因植物中的表达情况并且用于免疫共沉淀(Co-1P)、染色质免疫共沉淀(ChIP)、融合蛋白沉降(pull-down)实验中。本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的:
1、原核表达载体的构建
(1)根据NCBI数据库中梨的基因(AccessionNumber:EU153575.1)序列和原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点，设计一对特异性引物PyMYB-F =Sy-GGATCCGTCTACATGGAGGGATATAACGTTAACTTG-3’ 和 PyMYB-R 5’ -GTCGACGATATCTTCTTCTTTTGAATGATTCCAAAGG-3，,在上下游引物的5’端分别加入和fe7I酶切位点(下划线为酶切位点)。以云红梨I号总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyMYB-Y和PyMYBi进行扩增，得到特异性片段；
(2)回收/>#7沒的cDNA全长片段；
⑶PyMYB基因的T/A克隆和测序:使用pMD18T载体，将回收的cDNA片段进行T/A克隆，酶切验证后，进行测序分析；
(A)PyMYB基因测序和生物信息学分析，并上传GenBank数据库；
(5)构建原核表达载体:使用Banm和Sall对质粒pMD_18T-/y#7S和载体pGEX_4T_l进行双酶切，分别回收、连接，获得原核表达载体pGEX-4T-/y#7S。2,PyMYB基因的原核表达
使用热刺激法将pGEX-4T-/y#7S转入大肠杆菌力中，在IPTG诱导下筛选最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达。3、PyMYB蛋白的纯化
收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖亲和层析柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。4、使用PyMYB纯化蛋白制备抗体，使用PyMYB抗体可以检测PyMYB蛋白。实验结果显示本发明的重组载体pGEX-4T_/y#7S含有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签，可以表达获得纯化含有GST标签的蛋白，制备的抗体可用于GST pull-down实验中研究与PyMYB蛋白相互作用的蛋白，获得GST融合蛋白也可以通过Western Blot用商业化的GST单克隆抗体检测PyMYB蛋白，本发明制备的PyMYB抗体，可以弥补目前没有专门检测PyMYB蛋白、PyMYB蛋白的亚细胞定位以及用于免疫共沉淀(Co-1P)和融合蛋白沉降技术(pull-down)研究蛋白互作的抗体。本发明中所制备的抗体特异性强，能够准确的检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、用于免疫共沉淀实验(Co-1P)中验证蛋白互作、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
图1为本发明中提取的云红梨I号的总RNA电泳示意 图2为本发明基因扩增后的扩增产物电泳示意 图3为本发明pMD18T-/y#l^的酶切电泳示意图，图中=MIII是DNA分子量标准MarkerIII ;1、2、3 分别是 pMDlST-/^#招质粒 BamHI 和 SalI 双酶切结果；CK:ρΜ 18 ~ΡχΜΓβ质粒。图4为本发明原核表达载体pGEX-4T_/y#7沒电泳示意图，图中:1是对照质粒pET32a ；2-4 是 PGEX-ATtdJM^ 质粒；
图5为本发明原核表达载体pGEX-4T-/y#l^的酶切电泳示意图，图中Marker是DNA分子量标准MarkerIII ;1_3分别为pGEX-4T-/>#7沒质粒汉.ΗΙ和fe/I双酶切结果；4是pGEX-4T-/W^ 质粒。图6为本发明原核表达载体pGEX-4T-/y#l^在16°C、IPTG终浓度为I mM条件诱导下的表达情况示意图，图中:6是转化pGEX-4T-l空载体TfoM’力菌体的总蛋白；1是IPTG诱导前原核表达载 体的总蛋白；2-5是原核表达载体在16 °C,IPTG终浓度为I mM条件下诱导2、4、6、8h后的表达情况；M是蛋白质分子量标准SM0431 ；
图7本发明原核表达载体pGEX-4T-/y#l^在37 °C、IPTG终浓度为I mM条件下诱导表达情况示意图；图中I是转化PGEX-4T-1空MAifRosetta (DE3)菌体的总蛋白；2是IPTG诱导前原核表达载体的总蛋白；3-6是原核表达载体在37 °C、IPTG终浓度为I mM条件下诱导2、4、6、8h后的表达情况；M是蛋白质分子量标准SM0431 ；
图8为本发明中PyMYB蛋白纯化电泳示意图，图中I是表达PyMYB饱Rosetta (DE3)细菌总蛋白；2是挂柱后的流穿液；3-4是洗脱液结果；M是蛋白分子量标准Marker0431 ；
图9为本发明中使用PyMYB抗体检测35S:: PyMYB转基因烟草叶片PyMYB蛋白表达示意图，图中1，2，3，5和6是转基因株系，5是野生型对照。图10为本发明使用PyMYB抗体检测果皮中PyMYB与PybHLH蛋白互作示意图，其中1-3为检测的与bHLH蛋白互作的PyMYB蛋白，5为PyMYB蛋白正对照；
图11为本发明原核表达载体pGEX-4T-/>#7沒的构建策略示意图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例中使用的试剂主要为分子生物学试验试剂，各种限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为大连宝生物工程有限公司产品，反转录酶为Promaga公司的，PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，Rosetta (DE3)菌株和感受态细胞为北京Transgene公司产品，其余试剂均为国产分析纯。使用的仪器为GST琼脂糖亲和层析柱子，其它仪器均为分子生物学以及基因工程实验室
常用仪器设备。本发明所有引物序列合成在上海杰瑞生物技术公司进行，本发明中所有基因测序均在北京六合华大基因科技股份有限公司进行。实施例1:原核表达载体pGEX-4T-/y#l^的构建
(I)引物设计
根据NCBI数据库中梨中的基因(Accession Number:EU153575.1)序列和原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点，设计一对特异性引物PyMYB-F =Sy-GGATCCGTCTACATGGAGGGATATAACGTTAACTTG-3，和 PyMYB-R:5，-GTCGACGATATCTTCTTCTTTTGAATGATTCCAAAGG-3’，在上下游引物的5'端分别加入和fe7I酶切位点(下划线为酶切位点)。(2)总RNA的提取
使用异硫氰酸胍法提取云红梨I号果皮的总RNA，电泳检测结果如图1。(3) RT-PCR
以云红梨I号总RNA为模板 ，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyMYB-Y和PyMYBi进行扩增，获得PyMYB片段。(4 ) PyMYB片段的回收
对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳后(见图2)，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。(5)/>#7沒基因的T/A克隆和测序；将回收的PCR产物，按照pMD18T说明书，进行T/A克隆；转化大肠杆菌感受态DH5 α后，涂固体LB + Amp平板，挑取白色菌落，接种到液体LB + Amp培养基中，37°C、200 rpm摇床过夜，提取质粒，进行酶切检测，随后进行I %琼脂糖凝胶电泳(见图3)，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。(5)原核表达载体的构建
使用Bamm和Sall对质粒pMD18T-/y#l^和载体pGEX_4T_l按照说明书进行双酶切，分别获得5’端带有汉3ΜΠ和3’端带有Sall的/>#7沒片段和pGEX_4T_l载体，跑电泳后分别进行胶回收，按照目的基因:载体=3:1 (摩尔比)加样，然后加入连接液I，16 °C连接16h (见图4);将100 μ I感受态大肠杆菌疋Colim^ α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴 30 min，42 °C热刺激 45 s 后，冰浴 2 min ;加入 900 μ I Luria-Bertani (LB)液体培养基,37 °C > 200 rpm摇床培养60 min使菌体复苏；培养结束后,常温8000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时,使用移液枪混勻,接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37 1:过夜培养；挑取白色菌落，接种于LB液体+Amp的培养基,37 °C >180 rpm培养12 h后,提取质粒；进行酶切验证后，再送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序进行测序验证插入基因的正确性，最后获得原核表达载体pGEX-4T-/W^ (见图 5、图 11)。实施例2:原核表达载体pGEX-4T_/y#7S的原核表达使用热刺激法将重组质粒pGEX-4T-/y#7S转化入大肠杆菌(DE3)感受态细胞中，涂布于LB + Amp固体平板上，挑取pGEX-4T-/y#7沒的重组菌落于LB + Amp液体培养基中，37 0C >200 rpm摇床培养过夜，按1:100的比例接种于相同的LB培养基上培养至OD6tltl为0.6-0.8，加IPTG至终浓度为I mM，分别在16 1:和37 °C下培养0、2、4、6、8 h后收集菌液用于分析总蛋白；收集后的菌液4 0C >12 000 rpm离心I min,弃上清液,沉淀用100 μ ISDS 凝胶加样缓冲液(Tris-HCl 50 mM,pH 6.8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚蓝 0.1 % ;甘油10 %)重悬，煮沸5 min后，12 000 rpm离心I min，取20 μ I上清液进行SDS-PAGE检测；用考马斯亮蓝R-250染色液(0.1 %考马斯亮蓝R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脱色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)进行脱色后，使用凝胶成像系统进行拍照，结果显示插入有外源片段的重组质粒pGEX-4T-/y#7S经IPTG诱导后，在预期的蛋白分子量约56kD(包括载体上GST蛋白)左右有I条蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和PGEX-4T-1对照质粒未出现这条蛋白带(见图6、7);表明在16 °〇和37 °C、IPTG终浓度为I mM下重组质粒pGEX_4T_/y#7沒在大肠杆菌办Mite (DE3)中诱导表达了 PyMYB蛋白，因为低温诱导更有利于可溶性蛋白的形成，因此后续试验选用16 °C、IPTG终浓度为I mM下进行诱导表达。实施例3 =PyMYB蛋白的纯化，具体步骤如下:
a、菌体破碎:将在160CU mM IPTG下大量诱导表达I L后的菌体，经超声破碎菌体(工作 5 s,休息 8 s) 10 min ；
b、收集上清和沉淀:将菌体破碎液40C >12 000 rpm离心20 min，分别保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用0.45 μ m滤器进行过滤，除去杂质；
d、GST凝胶层析柱的装柱预处理:轻轻混匀GST凝胶直至完全重悬；用吸管移取适量的GST 凝胶至层析柱中，用 10 倍柱床体积的 PBS Buffer (IOmM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mMNaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0)洗涤柱子；
e、蛋白样品上柱:将含有GST融合蛋白的PBS溶液加入到已平衡好的层析柱中，流速控制在 10-15cm/h ；
f、洗柱:上样完成后，用20倍柱床体积的PBS洗涤，洗涤液中最好加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶活性；
g、洗脱:用10-15倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液(IOmM还原型谷胱甘肽，50mMTris-HCl, pH8.0)洗脱GST融合蛋白，并通过观察280nm处的吸收值来监控融合蛋白的洗脱
情况；分别取等量的流穿液，洗涤液和洗脱收集液进行SDS-PAGE以分析目的蛋白；
h、GST凝胶层析柱的后处理:洗脱完成后，用3-5倍柱体积的IXPBSBuffer洗涤柱子；用3-5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，GST凝胶最后保存在2-3倍柱体积的20%乙醇中；
1、SDS-PAGE检测:分别各取50μ I流穿液，洗涤液和洗脱收集液，加入5 μ I的5 X蛋白上样缓冲液，混匀后，煮沸5 min, 4 °C >13 000 rpm离心5 min后，各取20 μ I上样，进行SDS-PAGE分析，结果如图8所示，流穿液和洗脱液中都含有大量目的蛋白，其中洗脱液中获得了高纯度蛋白，使用I X PBS缓冲液(ρΗ8.0 )透析后，将纯化的蛋白进行兔的多克隆抗体制备。实施例4:PyMYB蛋白特异性抗体的Western blotting检测为检测PyMYB蛋白特异性抗体的有效性，使用PyMYB蛋白抗体检测35S: -.PyMYB转基因烟草和免疫共沉淀实验，具体过程如下:
实验中使用的试剂与仪器如下:
垂直蛋白电泳仪、PVDF 膜(millipore), Sem1-Dry Transfer Cell (BIO-RAD)转膜系
统；
丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED,1X甘氨酸缓冲液，IX磷酸缓冲液，I X PBT,脱脂奶粉，Whitman 3MM 滤纸等 SDS-PAGE 和 Western 试剂。A、35S: -.PyMYB转基因烟草的检测
蛋白样品制备:蛋白样品和1/5体积5X蛋白上样缓冲液(Tris-HCl (pH6.8)250 mM,SDS 10%, BPB 0.5%，甘油50%，β -巯基乙醇:5%)，95°C加热5 min后置于冰上5 min，常温
13000 rpm、离心 lmin。1、SDS-PAGE 检测 Cl)配制SDS-PAGE凝胶；
(2)电泳:需要恒流:浓缩胶30 mA，分离胶40 mA。2、Western 操作
(1)转膜:设定电流为2.0 mA/cm2,转膜40 min ；
(2)封闭(5%的脱脂 牛奶)；
(3)添加一抗(PyMYB抗体)；
(4)添加二抗(羊抗兔的商业化抗体)；
(5)结果观察
弃二抗，洗涤后，加I ml工作液，浸润整个PVDF膜，使用成像系统ChemidocXRS(BIO-RAD)进行成像观察，结果如图9，泳道1、2、3、5、6为转基因烟草总蛋白，4为野生型烟草的总蛋白，在转基因烟草中检测到PyMYB蛋白的表达，而在野生型对照中未检测到PyMYB蛋白，这表明本发明制备的多克隆抗体专一性强，适合进行PyMYB蛋白的表达检测、定位检测等。B、免疫共沉淀分析
蛋白样品的制备:分别取果皮可溶性蛋白(500ug)提取物用来进行免疫共沉淀分析，往果皮总蛋白溶液中分别加入5ug特异性抗体ant1-bHLH，室温震荡孵育2h，然后往蛋白液中加入20ul蛋白A/G琼脂糖并且4°C震荡孵育过夜，孵育后的蛋白混合液4°C，3500g离心5min。收集的蛋白沉淀物用遇冷的I XPBS洗三次，蛋白沉淀物最后溶解于40ul IX电泳上样缓冲液中，取20ul在12%的聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE:
USDS-PAGE 检测
(1)配制SDS-PAGE凝胶；
(2)电泳:需要恒流:浓缩胶30mA，分离胶40 mA。2'Western 操作
(1)转膜:设定电流为2.0 mA/cm2,转膜40 min ；
(2)封闭(5%的脱脂牛奶)；
(3)添加一抗(PyMYB抗体)；
(4)添加二抗(羊抗兔的商业化抗体)；(5)结果观察
弃二抗，洗涤后，加I ml工作液，浸润整个PVDF膜，使用成像系统ChemidocXRS(BIO-RAD )进行成像观察，结果如图10，泳道1、2、3为免疫共沉淀后的总蛋白，泳道4为果皮PyMYB蛋白正对照，在免疫共沉淀中检测到PyMYB蛋白，并且该蛋白与果皮中的PyMYB蛋白一致，这表明本发明制备的多克隆抗体专一性强，适合运用在免疫共沉淀中进行PyMYB蛋白互作分析。
权利要求
1.云南红梨基因，其特征在于沒基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1所述云南红梨/>#7沒基因的原核表达载体pGEX-4T-/y#7凡其特征在于:该载体含有招基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/>#73基因的N端含有GST标签。
3.权利要求2的所述云南红梨基因的原核表达载体在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白PyMYB中的应用。
4.权利要求2的所述云南红梨/>#7沒基因的原核表达载体在制备PyMYB特异性抗体中的应用 。
全文摘要
本发明公开了一种云南红梨色素合成调控和毛状体发生发育调控蛋白PyMYB基因及其原核表达载体，及原核表达载体的应用；本发明利用RT-PCR技术从云红梨1号红色果皮中克隆PyMYB基因，然后再利用原核表达载体将该基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达，采用GST凝胶柱纯化法纯化，获得云南红梨PyMYB纯化蛋白，云南红梨PyMYB纯化蛋白用于制备PyMYB特异性抗体和其在PyMYB蛋白表达检测中及免疫沉淀、染色质免疫共沉淀和融合蛋白沉降实验中的应用；本发明中所制备的抗体特异性强，能够准确的检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、用于免疫共沉淀实验中验证蛋白互作、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
文档编号C12N15/29GK103146710SQ20131008575
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者李昆志, 崔道雷, 张晓东, 樊磊, 陈丽梅, 舒群, 苏俊 申请人:昆明理工大学