专利名称：一种生产犏牛可控性别体外胚胎的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产犏牛体外胚胎的方法，尤其涉及一种生产犏牛可控性别体外胚胎的方法。
背景技术：
犏牛是普通牛Bos taurus ( )为父本与牦牛Bos grunniens (早)为母本通过种间杂交产生的后代，其具有明显杂交优势，乳、肉生产能力、役用能力均优于牦牛，另外利用年限长，市场售价高，是牦牛生产的重要补充，很受人们的喜欢。除此，犏牛对人们的生产和生活具有极其重要的作用:第一，役用，去势的公犏牛不仅具有牦牛同样对高原气候环境的适应力，还具有较温顺易驾驭的优点，所以在牧区犏牛常被用来当做驮牛使用，在半农半牧区或农区被用来当耕牛用来犁地；第二，奶用，与牦牛相比，母犏牛产奶量将成倍增加，且产奶周期长，能较好的满足牧户食奶或青藏高原地区大中城市对牛奶不断增加的需求，一方面牧户利用犏牛食奶，减少牦牛生产中，牧民与牦牛犊争食牦牛奶的问题，另一方面也能较大程度的满足城市人口增长对奶的需求；第三，肉用，公犏牛具有生长速度快、产肉量高等特点，另外犏牛既可以在牧区放牧，也可以利用半农半牧区或农区农作物秸杆等饲草资源丰富的优势，为人们提供大量的牛肉。利用体外受精生产优良犏牛胚胎，国内外已有文献报道。但尚未见有利用体外受精进行异种间杂交生产犏牛可控性别体外胚胎的方法
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，本方法利用性控精液、体外受精及种间杂交相结合这一动物繁殖新技术来生产性别化犏牛胚胎，以达到控制犏牛的性别，同时也为优良性控犏牛胚胎工厂化、性别化生产提供技术支撑。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:本发明所述生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，包括以下步骤:(I)将牦牛卵巢去除周围结缔组织后，用无菌生理盐水冲洗3 4次，从清洗干净的牦牛卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下选取卵母细胞，将选取后的卵母细胞用收集液洗涤2 3次，再用成熟培养液洗涤I次；(2)将洗涤后的卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液和Hepes缓冲液的培养皿中，再将培养皿放入培养箱中进行成熟培养；(3)取由流式细胞仪分离的新鲜的普通牛的含X或Y染色体的精子或37°C解冻的普通牛的含X或Y染色体的精子，通过Percoll梯度分离液将精液中的死精子与活精子分开；(4)将步骤(2)中培养成熟的卵母细胞从Hepes缓冲液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精微滴中，精子稀释后将含X或Y染色体的精子加入到含有卵母细胞的受精微滴中，放入培养箱中进行体外受精培养；(5)体外受精培养至受精后进行囊胚成熟处理；(6)在受精后第6、第7和第8天待囊胚成熟时回收囊胚，如有合适的受体牛，则进行胚胎移植；否则将发育良好的优质性控胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存，供以后胚胎移植用。作为优选，所述步骤(I)中，牦牛卵巢取自屠宰场，屠宰场回收牦牛卵巢后置于30°C无菌生理盐水中，用保温瓶尽快带回实验室，用装有8号的注射器，从卵巢表面直径为2 8mm的卵泡中抽取卵母细胞，在体视显微镜下选取有三层以上致密颗粒细胞且外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞；所述收集液为用Hepes缓冲的、添加有5mmol/L NaHC03、3%0CS(发情牛血清)的TCM199的卵母细胞收集液。所述步骤(2)中，所述成熟培养采用的成熟培养液为Hepes缓冲的TCM199+5%0CS+0.1 μ g/mLFSH(促卵泡素)+3%BFF (牛卵泡液)，每培养皿的成熟培养液为lmL，所述成熟培养的培养时间为21 24小时，培养箱内的条件为39°C、5%C02的空气及饱和湿度。所述步骤(3)中，分离精液中的死精子与活精子的方法为:将精液放入2mL90%: 2mL45%Perco11梯度的离心管中，700Xg离心20分钟，弃上清，加入ImL受精液400Xg离心5分钟，移去上层悬液，留下约50 μ L的精液；所述普通牛为荷斯坦牛、西门塔尔牛、夏洛莱牛、娟珊牛、海福特牛、西黄杂种牛(西门塔尔牛与藏黄牛杂交的后代)或荷黄杂种牛(荷斯坦牛与藏黄牛杂交的后代)。所述步骤(4)中，所述受精微滴为20 μ L，每滴放入16 18枚卵母细胞，在显微镜下检查精子活力符合要求后，精子加到受精微滴中，使其最终浓度达2X106/mL ;在39°C、5%C02的饱和湿度的培养箱 中培养6 8h。所述步骤(5)中，所述囊胚成熟处理的方法为:受精后，在受精微滴中用吸管反复吹打假定的受精卵，去掉部分卵丘细胞，再将假定的受精卵从受精滴中移出，用体外培养液洗涤两次转入含有黄牛颗粒细胞的共培养系统内进行培养，培养液为Hepes缓冲的TCM199+10%NCS (新生牛血清)+0.llmg/mL的丙酮酸纳，每滴加入培养液25 μ L，放入50枚受精卵，在39°C、5%C02、5%02、90%N2的饱和湿度条件下体外培养6 8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。本发明的有益效果在于:通过本发明与其他多种现代胚胎生产技术相结合能够进行性控犏牛的繁育，迅速增加优质犏牛的数量；由于目前分离含有Χ、γ染色体的精子的准确率为90%以上，用含有X染色体的精子受精产生的胚胎移植后90%以上的后代为母牛，用含有Y染色体的精子受精产生的胚胎移植后90%以上的后代为公牛，所以可以根据需要来进行性别化犏牛的生产。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体描述:从屠宰场采集牦牛卵巢，置于30°C无菌生理盐水中，用保温瓶尽快带回实验室。用无菌的生理盐水清洗卵巢3 4次，用装有8号的注射器，从卵巢表面直径为2 8_的卵泡中抽取卵母细胞。在体视显微镜下选取有三层以上致密颗粒细胞且外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞，然后用H印es缓冲的、添加有5mmol/L NaHC03、3%0CS(发情牛血清)的TCM199的卵母细胞收集液洗涤2 3次，再用Ifepes缓冲的TCM-199+5%0CS+0.1 μ g/mL FSH (促卵泡素)+3%BFF (牛卵泡液)的成熟培养液洗涤一次。将洗涤后的卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液和Hepes缓冲液的培养皿中，再将培养皿放入培养箱中进行成熟培养，每培养皿的成熟液为lmL，放入卵母细胞，390C，5%C02的空气及饱和湿度的条件下培养21 24小时。取由流式细胞仪分离的新鲜的普通牛的含X或Y染色体的精子或37°C解冻的普通牛的含X或Y染色体的精子，通过Percoll梯度分离液将精液中的死精子与活精子分开，其方法为:将精液放入2mL90%:2mL45%Percoll梯度的离心管中，700Xg离心20分钟，弃上清，加入ImL受精液400Xg离心5分钟，移去上层悬液，留下约50 μ L的精液。所述普通牛为荷斯坦牛、西门塔尔牛、夏洛莱牛、娟珊牛、海福特牛、西黄杂种牛(西门塔尔牛与藏黄牛杂交的后代)或荷黄杂种牛(荷斯坦牛与藏黄牛杂交的后代)。将培养成熟的卵母细胞从Hepes缓冲液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精微滴中，受精微滴为20 μ L，每滴放入16 18枚卵母细胞，在显微镜下检查精子活力符合要求后，精子加到受精微滴中，使其最终浓度达2X106/mL，精子稀释后将含X或Y染色体的精子加入到含有卵母细胞的受精微滴中，在39°C、5%C02的饱和湿度的培养箱中进行体外受精培养6 8h。受精后，在受精微滴中用吸管反复吹打假定的受精卵，去掉部分卵丘细胞，再将假定的受精卵从受精滴中移出，用体外培养液洗涤两次转入含有黄牛颗粒细胞的共培养系统内进行培养，培养液为ifepes缓冲的TCM199+10%NCS(新生牛血清)+0.llmg/mL的丙酮酸纳，每滴加入培养液25 μ L，放入50枚受精卵，在39°C、5%C02、5%02、90%N2的饱和湿度条件下体外培养6 8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。在受精后第6、第7和第8天待囊胚成熟时回收囊胚，如有合适的受体牛，则进行胚胎移植；否则将发育良好的优质性控胚胎进行冷冻保存处理，然后置于-196°C的液氮罐中冷冻贮存，然后等母 牛的条件成熟后再进行移植。
权利要求
1.一种生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将牦牛卵巢去除周围结缔组织后，用无菌生理盐水冲洗3 4次，从清洗干净的牦牛卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下选取卵母细胞，将选取后的卵母细胞用收集液洗涤2 3次，再用成熟培养液洗涤I次； (2)将洗涤后的卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液和Hepes缓冲液的培养皿中，再将培养皿放入培养箱中进行成熟培养； (3)取由流式细胞仪分离的新鲜的 普通牛的含X或Y染色体的精子或37°C解冻的普通牛的含X或Y染色体的精子，通过Percoll梯度分离液将精液中的死精子与活精子分开； (4)将步骤(2)中培养成熟的卵母细胞从Hepes缓冲液中拣出，用受精液洗涤2次后转入用受精液制成的受精微滴中，精子稀释后将含X或Y染色体的精子加入到含有卵母细胞的受精微滴中，放入培养箱中进行体外受精培养； (5)体外受精培养至受精后进行囊胚成熟处理； (6)在受精后第6、第7和第8天待囊胚成熟时回收囊胚，如有合适的受体牛，则进行胚胎移植；否则将发育良好的优质性控胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存，供以后胚胎移植用。
2.根据权利要求1所述的生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:所述步骤(O中，牦牛卵巢取自屠宰场，屠宰场回收牦牛卵巢后置于30°C无菌生理盐水中，用保温瓶尽快带回实验室，用装有8号的注射器，从卵巢表面直径为2 8mm的卵泡中抽取卵母细胞，在体视显微镜下选取有三层以上致密颗粒细胞且外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞；所述收集液为用Ifepes缓冲的、添加有5mmoI/LNaHCO3、3%0CS (发情牛血清)的TCM199的卵母细胞收集液。
3.根据权利要求1所述的生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述成熟培养采用的成熟培养液为Ifepes缓冲的TCM199+5%0CS+0.1 μ g/mLFSH(促卵泡素)+3%BFF (牛卵泡液)，每培养皿的成熟培养液为lmL，所述成熟培养的培养时间为21 24小时，培养箱内的条件为39°C、5%C02的空气及饱和湿度。
4.根据权利要求1所述的生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，分离精液中的死精子与活精子的方法为:将精液放入2mL90%:2mL45%PerCOll梯度的离心管中，700Xg离心20分钟，弃上清，加入ImL受精液400Xg离心5分钟，移去上层悬液，留下约50 μ L的精液；所述普通牛为荷斯坦牛、西门塔尔牛、夏洛莱牛、娟珊牛、海福特牛、西黄杂种牛(西门塔尔牛与藏黄牛杂交的后代)或荷黄杂种牛(荷斯坦牛与藏黄牛杂交的后代)。
5.根据权利要求1所述的生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，所述受精微滴为20μ L，每滴放入16 18枚卵母细胞，在显微镜下检查精子活力符合要求后，精子加到受精微滴中，使其最终浓度达2X106/mL ;在39°C、5%C02的饱和湿度的培养箱中培养6 8h。
6.根据权利要求1或5所述的生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，其特征在于:所述步骤(5)中，所述囊胚成熟处理的方法为:受精后，在受精微滴中用吸管反复吹打假定的受精卵，去掉部分卵丘细胞，再将假定的受精卵从受精滴中移出，用体外培养液洗涤两次转入含有黄牛颗粒细胞的共培养系统内进行培养，培养液为Hepes缓冲的TCM199+10%NCS (新生牛血清)+0.llmg/mL的丙酮酸纳，每滴加入培养液25 μ L，放入50枚受精卵，在39°C、5%C02、5%02、90%N2的饱和湿度条 件下体外培养6 8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。
全文摘要
本发明公开了一种生产犏牛可控性别体外胚胎的方法，包括以下步骤将牦牛卵巢去除周围结缔组织并清洗后，选取卵母细胞并洗涤；将洗涤后的卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液和Hepes缓冲液的培养皿中，再将培养皿放入培养箱中进行成熟培养；取普通牛的含X或Y染色体的精子，通过Percoll梯度分离液将精液中的死精子与活精子分开；将培养成熟的卵母细胞从Hepes缓冲液中拣出，用受精液洗涤后将含X或Y染色体的精子加入到含有卵母细胞的受精微滴中，放入培养箱中进行体外受精培养；受精后进行囊胚成熟处理；成熟时回收囊胚，进行胚胎移植或贮存。通过本发明与其他多种现代胚胎生产技术相结合能进行性控犏牛的繁育，迅速增加优质犏牛的数量。
文档编号C12N5/073GK103215220SQ20131009351
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者安添午, 罗晓林, 杨平贵, 官久强, 吴伟生, 赵洪文, 毛德才, 谢荣清, 李华德, 周明亮, 陈明华, 蒋世海 申请人:四川省草原科学研究院