专利名称：一种坎利酮高效转化生产11α-羟基坎利酮的方法
技术领域：
本发明属于微生物制备技术领域，涉及一种通过微生物转化来生产11 α -羟基坎利酮的方法，特别涉及一种以赭曲霉为菌种，采取高密度培养实现高效转化生产Ila-羟基坎利酮的方法。
背景技术：
坎利酮(Canrenone)属于一种留体激素类心血管药物，临床上主要作为非选择性醛固酮受体拮抗剂来治疗心血管疾病。心血管疾病主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)有关，利用醛固酮受体拮抗剂则可阻断RAAS的作用，从而降低心血管疾病的发生率和死亡率。但由于其对强心剂地高辛(Digoxin)定量检测有负面干扰，并且在心脏病治疗中有可能引起用药过量而致死的危险后果，人们开始通过硝基化、羟基化等途径，加紧研制其衍生物，以期增强疗效，减少副作用。在坎利酮的衍生化类型中，11 α -羟基坎利酮可以被用来制备一系列有用的坎利酮衍生物，因此受到了极大的关注。Ila-羟基坎利酮由坎利酮通过微生物转化在11位上羟基得到。由于其市场潜力巨大，很早就有坎利酮Ila羟基化反应的报道。1971年，B.1unt等曾尝试用坎利酮生产11 α -羟基坎利酮。1980年，Deshayes在坎利酮投料为1.5g/L时，转化率达95%，但其投料量不大，不适合大规模生产。1996年，Ng John S.等采用间歇补料，虽然投料量大为增加，但转化时间加长，转化率不高，致使成本大大提高。
现有的坎利酮微生物转化技术仍然存在生产周期长，成本高，转化率低等问题，极大地限制了该产品的应用和推广。因此寻求一种廉价、高效的Ila-羟基坎利酮生产方法势在必行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过高密度培养来实现坎利酮高效转化生产Ila-羟基坎利酮的方法。高密度培养可以提高单位体积培养液中菌体的浓度，并使其稳定在较高浓度，进而提高体积产率，相应缩小生物反应器体积，减少生产设备投资。为解决上述技术问题，本发明技术方案如下:通过高密度培养来实现高效转化生产11 α-羟基坎利酮的制备技术是以赭曲霉(Aspergillus ochraceus) TCCC41060为生产菌株,经过产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、种子培养、发酵培养、流加葡萄糖高密度培养转化底物坎利酮得到产物11 α -羟基坎利酮，具体步骤如下:(I)产孢和生产斜面制备生产菌株为赭曲霉TCCC41060，将该菌置于PDA培养基上，25 30°C恒温培养3 6d生成黄色孢子，然后转接到酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖(YPDA)培养基斜面上，25 30°C培养5 8d，生成金黄色孢子，即得生产用斜面，于4°C冰箱保藏，保藏时间在15d以内；(2)孢子悬液制备将10mL2%。(w/v)吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬浮浓度在 4X IO8 8X IO8 个 /IOOmL0⑶种子培养种子培养基组成如下，单位g/L:葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，调pH至
5.0 6.0之间，121°C灭菌20min，每IOOmL种子培养基接入ImL孢子悬液，在摇床温度25 30°C，转速180 200r/min培养18 24h即得种子培养液；⑷发酵培养发酵培养基组成如下，单位g/L:葡萄糖15，玉米浆20，酵母膏20，K2HP042，调pH值5.8，1211:灭菌201^11。将步骤(3)所述种子培养液按8%的接种量接入到发酵培养基中，发酵初始转速150r/min，通气量70 100L/h，罐压0.02Mp,培养温度25 30°C。通过调节发酵罐转速和通气量控制发酵液溶氧在30%以上，培养18 22h，残糖降至10 14g/L时，进行坎利酮底物投料，投料量15 20g/L ；(5)流加葡萄糖高密度培养进行底物转化发酵28 32h，培养基中的葡萄糖基本耗尽时，开始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；取发酵液用高 效液相色谱仪进行检测，当坎利酮转化率大于90%时，结束发酵。有益效果:本发明提供了一种通过高密度培养来实现高效转化生产Ila-羟基坎利酮的制备技术。通过控制流加葡萄糖，提高单位体积培养液中赭曲霉菌体的浓度，并使其稳定在较高浓度，保证高转化率的同时，缩短了转化时间，大大降低了生产成本。本发明是一种新的、高效的、经济实用的生产11 α -羟基坎利酮微生物转化方法，为工业化生产奠定了基础，具有重要的意义。
具体实施例方式实施实例I生产菌种为赭曲霉(AS，TCCC41060)，该菌在PDA斜面置于25°C恒温培养6d生成黄色孢子。然后转接在YPDA斜面上，30°C培养5d，可生成金黄色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。将10mL2%。(w/v)吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬浮浓度为 4X108 个/100mL。种子培养基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，调pH至5.0 6.0之间，121°C灭菌20min，每IOOmL种子培养基接入ImL孢子悬液，在摇床温度30°C，180r/min培养18h即得种子培养液；发酵培养基(g/L):葡萄糖15，玉米浆20，酵母膏20，K2HP042，调pH值5.8，将生长良好的种子培养液按8%的接种量接入到7L(装液量4.5L)发酵罐中，发酵初始转速150r/min,通气量70L/h，罐压0.02Mp,培养温度30°C。通过调节发酵罐转速和通气量控制发酵液溶氧在30%以上，培养18h，残糖降至10g/L，进行坎利酮底物投料，投料量15g/L ;培养28h，培养基中的葡萄糖基本耗尽时，开始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；转化48h之后，取样用高效液相色谱仪检测，色谱PhenomsilC18 (5u，250mm X 4.6mm);流动相为乙腈:水=6: 4(体积比)；流速1.2mL/min ;检测波长280nm ;柱温25V ;进样量20uL ；面积归一法检测。58h时转化率达97%。实施实例2生产菌种为赭曲霉(AS，TCCC41060)，该菌在PDA斜面置于30°C恒温培养3d生成黄色孢子。然后转接在YPDA斜 面上，28°C培养6d，可生成金黄色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。将10mL2%。(w/v)吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬浮浓度为 6X108f/100mL。种子培养基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，调pH至5.0 6.0之间，121°C灭菌20min，每IOOmL种子培养基接入ImL孢子悬液，在摇床温度28°C，190r/min培养20h即得种子培养液；发酵培养基(g/L):葡萄糖15，玉米浆20，酵母膏20，K2HP042，调pH值5.8，将生长良好的种子培养液按8%的接种量接入到7L(装液量4.5L)发酵罐中，发酵初始转速150r/min,通气量80L/h，罐压0.02Mp,培养温度28 V。通过调节发酵罐转速和通气量控制发酵液溶氧在30%以上，培养20h，残糖降至12g/L，进行坎利酮底物投料，投料量18g/L ;培养30h，培养基中的葡萄糖基本耗尽时，开始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；转化48h之后，取样用高效液相色谱仪检测，色谱Phenomsi IC18 (5u，250mm X 4.6mm);流动相为乙腈:水=6: 4(体积比)；流速1.2mL/min ;检测波长280nm ;柱温25V ;进样量20uL ；面积归一法检测。60h时转化率达98 %。实施实例3生产菌种为赭曲霉(AS，TCCC41060)，该菌在PDA斜面置于28°C恒温培养4d生成黄色孢子。然后转接在YPDA斜面上，25°C培养5d，可生成金黄色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。将10mL2%。(w/v)吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬浮浓度为 8X108f/100mL。种子培养基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，调pH至5.0 6.0之间，121°C灭菌20min，每IOOmL种子培养基接入ImL孢子悬液，在摇床温度25°C，200r/min培养24h即得种子培养液；发酵培养基(g/L):葡萄糖15，玉米浆20，酵母膏20，K2HP042，调pH值5.8，将生长良好的种子培养液按8%的接种量接入到7L(装液量4.5L)发酵罐中，发酵初始转速150r/min,通气量100L/h，罐压0.02Mp,培养温度25°C。通过调节发酵罐转速和通气量控制发酵液溶氧在30%以上，培养22h，残糖降至14g/L，进行坎利酮底物投料，投料量20g/L ;培养32h，培养基中的葡萄糖基本耗尽时，开始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；转化48h之后，取样用高效液相色谱仪检测，色谱PhenomsilC18 (5u，250mm X 4.6mm);流动相为乙腈:水=6: 4(体积比)；流速1.2mL/min ;检测波长280nm ;柱温25V ;进样量20uL ；面积归一法检测。56h时转化率大于96%。
权利要求
1.一种坎利酮高效转化生产Ila-羟基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉(Aspergillus ochraceus, TCCC41060)为生产菌株,经过产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、种子培养、发酵培养、流加葡萄糖高密度培养转化底物坎利酮得到产物Ila-羟基坎利酮，具体步骤如下 (1)产孢和生产斜面制备 生产菌株为赭曲霉TCCC41060，将该菌置于PDA培养基上，25 30°C恒温培养3 6d生成黄色孢子，然后转接到酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖培养基斜面上，25 30°C培养5 8d，生成金黄色孢子，即得生产斜面，于4°C冰箱保藏，保藏时间在15d以内； (2)孢子悬液制备 将IOml质量体积比20 %吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬浮浓度在 4X IO8 8X IO8 个 /IOOml ； (3)种子培养 每IOOml种子培养基接入Iml孢子悬液，在摇床温度25 30°C，转速180 200r/min培养18 24h即得种子培养液； (4)发酵培养 将步骤(3)所述种子培养液按8%的接种量接入到发酵培养基中，发酵初始转速150r/min,通气量70 100L/h，罐压O. 02Mp,培养温度25 30°C，通过调节发酵罐转速和通气量控制发酵液溶氧在30%以上，培养18 22h，残糖降至10 14g/L时，进行坎利酮底物投料，投料量15 20g/L; (5)流加葡萄糖高密度培养进行底物转化 发酵28 32h，培养基中的葡萄糖基本耗尽时，开始以100mL/h的流速流加IL IOg/L的葡萄糖溶液；取发酵液用高效液相色谱仪进行检测，当坎利酮转化率大于90%时，结束发酵。
2.根据权利要求I所述的一种坎利酮高效转化生产11α -羟基坎利酮的方法，其特征在于，所述种子培养基组成如下，单位g/L :葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，调pH至5. O 6. O 之间，121°C灭菌 20min。
3.根据权利要求I所述的一种坎利酮高效转化生产11α -羟基坎利酮的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成如下，单位g/L :葡萄糖15，玉米浆20，酵母膏20，K2HP042，调pH值 5. 8，121°C 灭菌 20min。
全文摘要
一种坎利酮高效转化的微生物方法属于微生物制备技术，涉及一种以赭曲霉为菌种，采取高密度培养实现高效转化生产11α-羟基坎利酮的方法。解决了现有的坎利酮微生物转化技术中存在生产周期长，成本高，转化率低等问题。本发明采用高密度培养提高单位体积培养液中菌体的浓度，并使其稳定在较高浓度，保证高转化率的同时，缩短了转化时间，大大降低了生产成本，为工业化生产奠定了基础，具有重要的意义。
文档编号C12P33/10GK103255192SQ20131009706
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者别松涛, 王家明, 路福平 申请人:天津科技大学