专利名称：一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白a亲和配基及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌蛋白A简称蛋白A，是金黄色葡萄球菌表面的一种蛋白质，通过共价键连接到胞壁肽聚糖。蛋白A分子中存在五个同源性很高的E、D、A、B、C序列，由于能和人及多种哺乳动物IgG的Fe段结合，因此称之为抗体结合区。蛋白A与抗体的Fe段结合并不影响抗体对抗原的吸附活性，因此被广泛应用于抗体的亲和纯化。由于B结构域对抗体的结合力最稳定，而且本身结构也最稳定，因此人们对B序列的研究最多。B序列由3个α螺旋和连接螺旋片段的两个Loop组成，按照从N端到C端的顺序依次是Helixl-Loopl-Helix2-Loop2-Helix3。以蛋白A为亲和配基吸附IgG时结合力很强，需要使用较低pH洗脱液(pH3.0左右)，往往会影响IgG的活性。蛋白A亲和层析柱在使用过程中会在柱内残留核苷酸、变性蛋白质、脂类和微生物 等杂质，需要使用在位清洗进行清除，其中NaOH是工业生产中较为廉价和常用的清洗液。天然蛋白A虽然对碱性环境有着较好的耐受性，但是仍然不能满足长期使用强碱对其进行清洗。尽管天然蛋白A抗体结合区的E、D、A、B、C五个结构域彼此之间有很高的同源性，但是它们对IgG的结合能力存在差异，导致最适洗脱条件不一样。因此，本发明针对以上几点，选取B结构域对天然蛋白A进行分子改造。利用分子生物学方法从核苷酸序列上进行改造和连接，利用大肠杆菌高效表达系统实现高效表达，得到一系列个改造序列串联组成而且C端添加一个半胱氨酸的重组蛋白A，将得到的重组蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料，用于抗体的分离纯化，具备较温和洗脱性能和较高的耐碱性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，用于抗体制备的亲和层析填料，具有较好的洗脱性能和耐碱性能。所述的重组蛋白A亲和配基由I到10个Z序列串联构成的一系列蛋白质。Z序列是B序列经过改造后的产物，与B序列的区别在于在Loop2与Helix3之间添加6个甘氨酸，并将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，为了实现蛋白A与填料基质更稳定的连接，在B蛋白序列的C端添加了 2个半胱氨酸，从而实现与基质实现双位点连接。将表达Z序列的基因命名为z，利用同尾酶将I到10个不同数量的z串联，所表达的重组蛋白A中每两个Z序列均由两个丝氨酸相连接。所述的性能改进的重组蛋白A亲和配基的构建方法的步骤为:(I)引物设计
本发明对蛋白A的B片段进行分子改造，根据重叠PCR和同尾酶连接原理设计引物，将改造后的B片段命名为Z，改造内容为Z (6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和I到10个z核苷酸序列的拼接，其中Z (6G)的改造是在B序列第二个Loop后面添加6个甘氨酸增加Loop2长度，从而降低其与抗体的结合力强度，使洗脱更容易进行，Z(N23T，F30A)的改造是对B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸进行定点突变，分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少B序列的脱酰胺作用，增强对高浓度碱液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加3个半胱氨酸，以实现重组蛋白A亲和配基与琼脂糖填料基质实现双位点连接，在引物中添加Nhe 1、Xba 1、Noc I和BamH I四个酶切位点，利用同尾酶作用原理将不同个数的z核苷酸序列首尾相连，组成含有不同个数z序列串联的重组蛋白A表达基因；(2)重组菌的构建本发明根据步骤(I)所设计的引物，以金黄色葡萄球菌基因组为模板进行重叠PCR,获得所需的目的核苷酸序列z，利用T载体pMD18-T构建重组质粒pMD18_T-Zl，转化感受态E.coli JM109进行甘油冻管保 藏，以此为基础进行不同个数z序列(Zn)的构建，然后利用Noc I和BamH I两个酶切位点将构建好的2 序列与表达质粒pET_28a进行酶切连接，得到重组表达质粒pET-28a-zn，最后转化感受态E.coli BL21 (DE3)，得到重组蛋白A的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-zn，制备甘油冻管保藏备用；(3)重组蛋白A的表达本发明利用IPTG对步骤(2)所构建的重组菌E.coli BL21 (DE3)/pET-28a_zn进行诱导表达，获得具有1-10个Z片段串联的重组蛋白A，Wzn表示η (η为1_10)个Z片段串联的重组蛋白Α。本发明利用分子生物学方法对天然蛋白A的B序列进行分子改造，首次对蛋白A的B序列同时进行洗脱性能和耐碱性能的改造，以及实现将改造后的I到10个ζ紧密串联，构建重组表达质粒pET-28a-zn并转化感受态E.coli BL21 (DE3)进行表达。利用本发明表达的重组蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料对抗体具有较好的结合能力、洗脱性能和耐碱性能:使用PH4.0,5.0和6.0的洗脱液分别可以实现97.7%、89.4%和67.5 %的洗脱率；使用2.0moI/L的NaOH溶液浸泡7h和14h，牛初乳IgG结合率分别为86.1 %和72.8%。本发明的关键在于:对B序列进行洗脱性能改造，在B序列Loop2和Helix3之间添加6个甘氨酸，使洗脱条件更加温和；对B序列耐碱性能改造，利用重叠PCR技术将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少脱酰胺作用，增强序列对高浓度碱溶液的耐受性能；利用同尾酶作用原理，将不同个数ζ序列进行串联，经过转化和诱导表达得到一系列包含不同个数Z片段的重组蛋白A。
图1是本发明一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A表达的SDS-PAGE验证图。I, marker ；2, E.coli BL21 (DE3)/pET28a_z5 ;3, E.coli BL21 (DE3)/pET28a。图2是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析填料纯化牛初乳IgG的过程图。
图3是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析填料纯化牛初乳IgG的SDS-PAGE验证图。I，marker ； 2，洗脱液；3，穿透液；4，粗样品IgG。图4是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的洗脱性能分析。图5是本发明制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的耐碱性能分析。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步描述:(I)引物设计实施例1使用重叠PCR技术对蛋白A的B片段进行改造，并将改造后的B片段命名为Z片段，其表达基因为ζ。根据GeneBank提供的基因序列，利用分子生物软件DNAMAN设计ζ序列的正向引物Ftl和反向引物Rci:F0 -.CCATGGCTAGCO CGGATAACAAATTCAACR0: GGATCC TTAGCAACA TCTAGA TTTTGGTGCTTGTGC。正向引物和反向引物分别引入Noc I和BamH I酶切位点，其中斜体部分为酶切位点，下划线部分为添加的两个半胱氨酸的密码子。在B片段第二个Loop后面添加6个甘氨酸，降低蛋白A与IgG的结合力强度，表示为Z(6G);为了增加蛋白 A的耐碱性能，将第23位的天冬酰胺和第30位的苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，用Z(N23T，F30A)表示。根据GeneBank提供的基因序列设计 z 基因序列:CCATGGCTAGO GCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCACCAAAA TCTAGATGTTGCTAA.GG^rCC其中下划线标记的是基因改造部分，斜体标记部分是酶切位点，在ζ前端添加Nhe I和Noc I两个酶切位点，后端添加XbaI和BamH I两个酶切位点。根据重叠PCR原理，利用分子生物软件DNAMAN设计两对引物:F1:ATGACCCAAGCCAAGGTGGCGGAGGGGGCGGTAGCGCTAACCTTTTAR1:TAAAAGGTTAGCGCTACCGCCCCCTCCGCCACCTTGGCTTGGGTCF2:ACTTAACCGAAGAACAACGCAATGGTGCCATCCAAAGCTTAAR2:TTGGATGGCACCATTGCGTTGTTCTTCGGTTAAGT其中FjP R1分别是Z (6G)的正、反向引物，F2和R2分别是Z(N23T，F30A)的正、反向引物。将所设计的引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)重组载体pMD18-T-Zl的构建实施例2提取金黄色葡萄球菌DNA，利用实施例1设计的FpRci为引物，金黄色葡萄球菌DNA为模板，利用Pfu DNA聚合酶对B序列进行PCR。按照Pfu DNA聚合酶说明书，选择50 μ L进行。PCR反应条件:预变性94°C反应5min ;变性94 °C反应40s，退火温度56 °C反应lmin30s，延伸温度72°C延伸30s，进行30个循环；最后72°C保持lOmin。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收B片段。使用重叠PCR的方法，利用Pfu DNA高保真聚合酶，以回收到的B片段为模板，分别以实施例1设计的Ftl和R1A1和Rtl为引物进行PCR，反应体系和条件同上。将PCR回收产物按照体积比1:1混合，将该混合物作为模板，以Ftl和Rtl为模板进行PCR，反应体系和条件同上，琼脂糖凝胶回收增加6个甘氨酸密码子的序列。再以相同的方法和体系对耐碱性进行突变，分别以实施例1设计的Ftl和R2、F2和Rtl以及Ftl和Rtl为引物，以得到的改造后的序列为模板进行重叠PCR，胶回收得到ζ序列。以F0和Rtl为引物、ζ序列为模板，利用Ex-Taq DNA聚合酶进行PCR，反应体系和条件同上，得到两端各带有一个腺嘌呤的ζ序列，利用碱基互补配对原则将ζ序列连接到T载体pMDlS-T上，得到重组质粒PMDlS-T-Z115将重组质粒转化感受态E.coli JM109,得到重组菌E.coliJM109/pMD18-T-Zl进行甘油冻管保藏备用。(3)重组载体pET-28a_zn的构建实施例3Zn表示η (η为1_10)个ζ序列首尾相连。以Nhe I和BamHI作为第一组限制内切酶，Xba I和BamH I作为第二组限制内切酶。过夜培养实施例2得到的重组菌E.coliJM109/pMD18-T-z1；质粒提取pMD18_T-Zl，用两组酶分别对重组质粒pMD18-T-Zl进行酶切反应。胶回收两组酶切产物，利用T4DNA连接酶将两组产物于16°C过夜连接，得到含有两个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z2，将pMD18-T-z2的转化到感受态E.coli JM109进行保存。实施例4过夜培养实施例3得到的重组菌E.coli JM109/pMD18-T-z2,提取质粒pMD18-T-z2，利用实施例3的第二组限制性内切酶对？1 18-1'-21进行酶切，第一组限制性内切酶对PMDlS-T-Z2进行酶切，将两组所得的酶切产物回收后进行连接得到含有3个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z3，转化感受态E.coli JM109进行保存。根据相同的方法，利用实施例3提到的两组酶分别对PMDlS-T-Z2进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有4个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z4,转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对？1 18-1'-22进行酶切，另一组酶对？1 18-1'-23进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有5个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z5，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对pMD18-T-z3进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有6个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z6，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对pMD18-T-z3进行酶切，另一组酶对PMDlS-T-Z4进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有7个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z7，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对PMDlS-T-Z4进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有8个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z8，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3的一组酶对pMD18-T-z4进行酶切，另一组酶对pMD18-T-z5进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有9个ζ序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z9，转化感受态E.coli JM109进行保存；利用实施例3提到的两组酶分别对PMDlS-T-Z5进行酶切，将两组所得的酶切产物进行连接，可得到含有10个Z序列首尾相连的重组质粒pMD18-T-z1(l,转化感受态E.coliJM109进行保存。 实施例5
过夜培养实验室保藏菌株E.coli JM109/pET-28a和实施例4所得10株重组菌E.coli JM109/PMD18-T-ZU，提取质粒，利用限制性内切酶Noc I和BamH I对质粒pET_28a和pMD18-T-Zl,进行酶切，将酶切产物胶回收后进行连接既得重组质粒pET-28a-Zl_1(l，转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到10株表达不同片段长度重组蛋白A的基因工程菌E./oliBL21 (DE3)/ρΕΤ-28&-Ζι_1(ι，甘油冻管保藏。实施例6用烯丙基缩水甘油醚和NHS对Sepharose4FF进行活化和修饰,保藏备用。将实施例5所得重组菌E.coli BL21 (DE3)/pET-28a_z5过夜培养后进行超声破碎，利用IgG亲和层析填料纯化所表达的Z5蛋白片段，将纯化产物进行冷冻干燥备用。将制备的Z5蛋白片段配成适当浓度溶液，偶联到经修饰的Sepharose4FF制备重组蛋白A亲和层析填料。实施例7 基于AKTA purifier层析系统,将实施例6制备的重组蛋白A亲和层析填料装柱进行性能测试。配制不同PH的0.lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为洗脱液，检测填料的洗脱性能。使用ρΗ4.0,5.0和6.0的洗脱液进行洗脱，分别实现了 97.7%,89.4%和67.5%的洗脱率。使用2.0mol/L的NaOH溶液浸泡7h和14h后，本发明重组蛋白A制备的亲和填料对IgG的结合率分别为86.1 %和72.8%。
权利要求
1.一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A，其特征在于重组蛋白A分子结构由I到10个Z片段串联组成。
2.根据权利要求1所述的一种性能改造的重组金黄色葡萄球菌蛋白A，其特征在于编码Z片段的基因具有序列表SEQ ID.3所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种性能改造的重组金黄色葡萄球菌蛋白A，其特征在于Z片段的氨基酸残基具有序列表SEQ ID N0.8所述的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所属的一种性能改造的重组蛋白A，其特征在于Z序列是由B序列改造得到的，是在B片段的Loop2后面添加6个甘氨酸，并将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，在Z序列的C端添加有2个半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的一种性能改造的重组蛋白A，其特征在于I到10个Z片段串联后具有序列表SEQ ID N0.8-17所述的氨基酸序列。
6.—种如权利要求1所述的性能改造的重组蛋白A的构建方法，其特征在于克隆并改造Z基因序列的3对引物F0和R0J1和R1J2和R2，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0.USEQID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，利用重叠 PCR 得到 Z 序列，使用一组同尾酶和限制性内切酶BamH I将I到10个Z序列进行串联得到Zn序列，利用一组限制性内切酶将2 连接到质粒pET-28a，转化感受态E.coli BL21(DE3)得到产不同个数Z序列串联的重组蛋白A菌株，通过一定终浓度的IPTG诱导获得由1-10个Z片段组成的重组金黄色葡萄球菌蛋白A。
7.根据权利要求6所述的一组同尾酶，其 特征在于是NheI和Xba I。
8.根据权利要求6所述的一组限制性内切酶，其特征在于是NocI和BamH I。
全文摘要
本发明公开了一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法。本发明利用分子生物学方法，选取天然蛋白A的B序列进行分子改造，在B序列的C端添加2个半胱氨酸，从而可以将蛋白A通过双位点偶联的层析基质，使连接更加稳定，在B序列第二个Loop后面添加了6个甘氨酸增加其长度，降低与抗体之间的结合力，从而使洗脱条件更加温和。在此基础上对蛋白A耐高浓度碱的性能进行改造，将B序列第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，得到耐碱性能更高的Z序列。然后，利用同尾酶将不同数量的Z序列首尾串联，并利用大肠杆菌的高效表达系统进行过量表达。将表达的重组蛋白A偶联到琼脂糖基质制备亲和层析填料，并用于纯化抗体，结果表明本发明制备的重组蛋白A亲和配基具有较好的洗脱性能和耐碱性能。
文档编号C12R1/445GK103214563SQ20131009755
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者夏海锋, 吴璞强, 梁振东, 王沙莉, 郑梦杰 申请人:江南大学