一种来源于矮沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法

专利名称：一种来源于矮沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其对应编码的氨基酸，此外本发明也涉及到这些基因的克隆方法。
背景技术：
矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Chengf.)，为第三纪孑遗植物，被列为国家二级濒危保护植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、矮的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8°C，气温变化极值可达70°C以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C 30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。I型液泡膜焦磷酸酶是由单个亚基组成的位于液泡膜上利用焦磷酸盐(PPi)势能作为能量在细胞内部各个腔室形成质子梯度的蛋白。I型液泡膜焦磷酸酶基因的表达与非生物胁迫有关，能提高植物耐盐和干旱胁迫的耐受力；1型液泡膜焦磷酸酶能够调节植物激素的转运，进而调节由这些植物激素所介导的生长发育过程，并且受到植物激素(如，脱落酸)的调控。矮沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义
发明内容
本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供来源于植物矮沙冬青具有抗旱和耐盐功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗逆性能。本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，该序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列以及该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物矮沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到:
(I)总RNA的提取和纯化:可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA ;常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于矮沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAot2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行矮沙冬青叶片总RNA提取。纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的矮沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括:DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中间片段的克隆:
A、中间片段cDNA第一 链的合成
以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板,使用3’ RACE Adaptor (可优选TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。B、PCR 扩增
以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述兼并上游引物(jf3)和兼并下游引物(jx3 )，进行PCR扩增。所述I型液泡膜焦磷酸酶基因中间片段扩增引物可优选为: jf3: 5’ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3，，
jx3: 5’ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3’ ；
扩增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选为:
TaqPlusPCR Master Mix20 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L o扩增程序可优选为:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 个循环);
72°C，8 min ;4°C保温。(3) 3’端的克隆:
C、3，-outer PCR 扩增
根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP3-3’-outer和3’端下游引物 3’-RACE outer (可优选 TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)，进行3’端outer PCR扩增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因3’端的特异性上游outer引物可优选为:
GSP3-3’ -outer: 5’ - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3’ ；3’端下游引物3’ -RACE outer可优选为:
3’ -RACE outer: 5’ - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’ ；
扩增得到的产物为cDNA 3’端。
本步骤中，扩增体系可优选为:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)； 72°C，8 min ;4°C保 温。D、3，-1nner PCR 扩增
根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-1nner，以前述步骤C所得3’端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP3_3’-1nner和3’端下游引物 3’-RACE inner (可优选 TaKaRa 公司 3’-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)，进行3’端inner PCR扩增:I型液泡膜焦磷酸酶基因3’端的特异性上游inner引物可优选为:
GSP3-3’ -1nner: 5’ - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3’ ；
3’端下游引物3’ -RACE inner可优选为:
3’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3’ ；
扩增得到的产物为cDNA 3’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3’端完整序列； 本步骤中，扩增体系可优选为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
3，-outer PCR 产物2 μ L，
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)
72°C，8 min ;4°C保温。(4) 5’端的克隆:
E、合成5’端的cDNA第一链:以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，经过对RNA进行预处理(可优选Ambion 公司 FirstChoice’ RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒)，加入 5’ RACE Adapter进行反转录，(通过所述预处理实现对非完整mRNA的脱磷酸化和对完整mRNA的脱帽处理，排除非完整mRNA干扰，使得完整的mRNA能够高效地与5’ RACE Adapter连接。)
所述5’ RACE Adapter可优选为:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3’ ；合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链。F、5，-outer PCR 扩增
根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’-outer和5’端上游引物5’ -RACE outer (可优选FirstChoice’ RLM-RACE Kit试剂盒)，进行5’端outer PCR扩增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因5’端的特异性下游outer引物可优选为:
GSP3-5’ -outer: 5’ - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3’ ；
5’端上游引物5’ -RACE outer可优选为:
5’ -RACE outer: 5’ - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3’ ；
扩增得到的产物为cDNA 5’端。本步骤中，扩增体系可优选为:
cDNA 模板IyL,
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 个循环)；
72°C，8 min ;12°C保温。G、5，-1nner PCR 扩增
根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’ -1nner,以前述步骤F所得5’端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP3-5’-1nner和5’端上游引物 5’-RACE inner (可优选 FirstChoice’ RLM-RACE Kit 试剂盒),进行 5’端 innerPCR扩增:· I型液泡膜焦磷酸酶基因5’端的特异性下游inner引物可优选为:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5’端上游引物5’ -RACE inner可优选为:
5’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3’ ；
扩增得到的产物为cDNA 5’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5’端完整序列； 本步骤中，扩增体系可优选为:5，-outer PCR 产物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L))1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 个循环)；
72。。，8 min，12°C保温。(5)全长序列拼接和基因分析:
将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3’端inner PCR扩增序列和述步骤(4)所得5’端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORFfinder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。(6) I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆:
将上述步骤(5)所分析的完整基因序列作为模板，设计上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并进行PCR扩增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因扩增引物可优选为:
0RF3-S: 5’ - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3’，
0RF3-A: 5’ - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3’ ；
扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。本步骤中，扩增体系可优选为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因扩增程序可优选为:
98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；
与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明是一种来源于植物矮沙冬青具有抗旱和耐盐功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，并首次使用RACE方法在该物种中克隆此基因，得到该基因的完整全长序列。本发明克隆的I型液泡膜焦磷酸酶基因使人们对这个基因的研究对象从细菌及其他植物进一步扩展到矮沙冬青。并且， 根据矮沙冬青I型液泡膜焦磷酸酶的基因在酵母功能验证试验中所具备的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料:如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。


图1为AnVPl基因电泳检测结果图，
图2为AnVPl基因中间片段电泳检测结果图，
图3为AnVPl基因3’端inner PCR电泳检测结果图，
图4为AnVPl基因5’端inner PCR电泳检测结果图，
图5为表达载体pRS6-AnVPl双酶切鉴定的电泳检测结果图。图6为酵母盐胁迫对照试验中的菌斑生长情况照片，图中A、B、C、D、E分别表示培养基中添加的 NaCl 浓度为 O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L,同一NaCl浓度下的3列，从左至右分别为相应菌株的原液、5倍稀释液和25倍稀释液。图7为酵母高温胁迫对照试验的菌斑生长情况照片，图中A:30° C培养的对照菌液、B:53° C 高温处理 2 min、C:53° C 高温处理 4 min、D:53° C 高温处理 6 min、E:53° C高温处理8 min、F:53° C高温处理10 min,同一处理时间下的3列，从左至右分别为相应菌株的原液、5倍稀释液和25倍稀释液。图8为酵母干旱胁迫对照试验的菌斑生长情况照片，图中同一山梨醇添加量下的3列，从左至右分别为相应菌株的原液、5倍稀释液和25倍稀释液。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。在下述各实施例中，将矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶简称为。通过各实施例，最终得到来源于矮沙冬青的I型液 泡膜焦磷酸酶核苷酸序列(如SEQ ID N0.1所述)及其对应的氨基酸序列(如SEQ ID N0.2所述)。实施例1
本实施例为矮沙冬青叶片总RNA的提取和纯化，总RNA提取使用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取试剂盒，CAT#90404-50，包括下述步骤:
(I)估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片或50-100 mg植物种子或200-500 mg植物果实。(2)先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNAL0CKER中的植物组织需用纸吸去RNAL0CKER液体后再剪切成小块)，放入10-15 mL塑料离心管中，加入I mL 65°C预热的溶液A (用前需要摇晃混匀)，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入I mL溶液A，但效果比较差，因为研钵本质是二氧化硅，在溶液A存在时会吸附RNA。(3)将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份，匀浆液会多于I mL，转移时也只取I mL。(4)在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。(5)室温12000 rpm离心3_5分钟，两相间有约5mm厚的细胞破碎物。(6)将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。最好留下100 UL上清液不取。(7)加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。(8)将一半溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000 rpm室温离心半分钟，弃
穿透液。(10)将0.7 mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000 rpm室温离心10-30秒，
弃穿透液。(11) 12000 rpm室温离心10秒以便去除残留液体。(12)将 10 μ L (10 U)的 RNase-free DNase 加入到 50 μ L 37°C预热的 DNA 膜反应液中，吹打混匀配制成DNase工作液。(13)将DNase工作液在37°C预热I分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5分钟。注意:5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了 DNase的活性)，此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。(14)直接在离心吸 附柱中加入0.7 mL通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。(15) 12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(16)再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱，12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(17) 12000 rpm室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留乙醇会影响RNA的使用。(18)将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入30-50 μ L RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。(19) 12000 rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强，一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50 μ LRNA洗脱液一次。实施例2
本实施例为矮沙冬青总RNA的反转录，其反转录得到的cDNA第一链用于基因中间片段和 3，端扩增的模板，按照 Takara 公司的 3，-Full RACE Core Set Ver.2.0，Code:D314 试剂盒说明书进行cDNA第一链合成。实施例3
本实施例为基因中间片段的克隆，方法如下:
以蒺藜苜蓿(FJ176929.1)为询问序列，参考百脉根(EF440187.1)、绿豆(AB009077.1)、大豆(AK285283.1)和豇豆(U31467.1)序列设计兼并引物 jf3/jx3:jf3: 5， - GCCCAAARGAGCTTTCACTY -3 ；jx3: 5’ - GAAGMARGTGACCRGGAAGG -3’。
以实施例2的cDNA第一链为模板，以设计的兼并引物jf3和jx3进行如基因cDNA中间片段的扩增。扩增体系为:TaqPlusPCRMaster Mix20 μ L， cDNA 模板 2 μ L ,
2Χ 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L ο扩增程序为:95° C，5min；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 个循环);
72°C，8 min ;4°C保温。取所得扩增产物20 μ L经1%非变性琼脂糖凝胶100 V电泳30 min, GoLdenView染色后紫外线检测扩增片段，结果如图2所示。扩增得到的产物为如KW基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到的中间片段序列如SEQ ID N0.3所述:
①目的片段的回收与纯化:
将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1.5mL离心管中，用凝胶回收试剂盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GeL Extraction Kit)回收胶中的DNA片段；
②连接反应:
将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19_T载体中。连接反应采用连接试剂盒(Takara公司)，扩增体系总体积10 μ L，16°C连接过夜；
③感受态细胞的制备:
1、从LB平板上挑取新活化的疋coLiDH5σ单菌落，接种于3_5 mL LB液体培养基中，37°C, 225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37°C振荡培养2-3 h至0D600 = 0.35-0.5左右；
I1、将培养液转入离心管，冰上放置10min，然后于4°C下3000 r/min离心10 min ；
II1、弃去上清，用预冷的0.05 moL/L的CaCL2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 min 后，4°C下 3000 r/min 离心 10 min ；
IV、弃去上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.05 moL/L的CaCL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；
V、感受态细胞分装成100μ L的小份，贮存于-70°C可保存半年；
④质粒DNA的转化:
1、从_80°C冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞a，置于冰上融化；
I1、在无菌条件下加入10μ L连接反应液，轻轻震摇混匀后，在冰上放置30 min ；
II1、42°C水浴热击90S，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min ；
IV、加入890μ L无Amp的LB液体培养基，混匀后，37°C、150 r/min摇床振摇培养，温育I h;
V、取100μ L已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37°C避光培养12-16 h ;随后筛选阳性菌落；⑤重组菌落的鉴定与保存:从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进一步鉴定:1、在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于含0.1 g/LAmp的LB液体培养基的1.5 mL离心管中，37°C，150 r/min振摇培养4_6h ；
I1、取IUL菌悬液作为模板，用引物jfl/jxl进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照；
II1、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750μ L，加入250 μ L的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于_80°C冰箱中保存备用；
IV、最后送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。实施例4
本实施例为如基因3’端的克隆，方法如下:
(1)3，-outer PCR 扩增:
根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’ -outer，以实施例2所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP3-3’ -outer和TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中 3’ 端下游引物3’ -RACE outer,进行 3’ 端 outer PCR 扩增:
GSP3-3’ -outer: 5’ - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3’ ；
3’ -RACE outer: 5’ - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’ ；
扩增体系为:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。扩增程序为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)
72°C，8 min ;4°C保温。(2) 3，-1nner PCR 扩增:
根据实施例3得到 的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-1nner，以上述(I)所得outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP3-3’ -1nner和TaKaRa公司3，-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中 3，端下游引物 3，-RACE inner,进行3’端inner PCR扩增:
GSP3-3’ -1nner: 5’ - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3’ ；
3’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3 ；扩增体系为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 μ L,
MgCl2 (25 mM)3 μ L,
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。扩增程序为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)；
72°C，8 min ;4°C保温。
取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。扩增得到的产物为如KW基因3’端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的3’端cDNA完整序列如SEQ ID N0.4所述。实施例5
本实施例为5’端扩增的cDNA第一链合成:
以实施例1纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoiceRLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 5’ RACE Adapter 后，以 RandomDecamers进行反转录:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3’ ；合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链。实施例6
本实施例为基因5’端的克隆，包括下述步骤:
(1)5，-outer PCR 扩增:
根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’-outer，以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’ -outer和试剂盒 FirstChoice’ RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5，-RACE outer，进行 5，端outer PCR 扩增:
GSP3-5’ -outer: 5’ - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3’ ；
5’ -RACE outer: 5’ - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3’ ；
扩增体系为: cDNA 模板IyL,
10X PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5 ，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA polymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。扩增程序为:95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;12°C保温。(2) 5，-1nner PCR 扩增:
根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’ -1nner,以上述(I)所得outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’ -1nner和试剂盒FirstChoice，RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5’-RACE inner，进行 5’端 innerPCR扩增:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3 ；
扩增体系为: 5，-outer PCR 产物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。
·
扩增程序为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;12°C保温。
取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。扩增得到的产物为如KW基因5’端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的5’端cDNA完整序列如SEQ ID N0.5所述。实施例7
本实施例为基因全长序列序列拼接和基因分析，包括下述步骤:将上述实施例3所得中间片段、实施例4所得3’端inner PCR扩增序列和实施例6所得5’端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORFfinder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。实施例8
本实施例为AnVPl基因克隆，方法如下:以实施例7的基因分析设计上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板进行PCR扩增:
0RF3-S: 5’ - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3’，
0RF3-A: 5’ - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3’ ；
扩增体系为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。扩增程序为:
98 °C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；
取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。扩增得到的产物为完整的AnVPl基因序列，如SEQ ID N0.1所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。实施例9
本实施例为基因两端添加酶切位点，方法如下:
根据实施例8得到的基因片段，设计并合成带Xho I酶切位点的上游引物vpU和带BamHI酶切位点的下游引物vpD，进行如KW基因的PCR扩增:vpU: 5’ - AACCTCGAG(Xho I )ATGGGTGCAGCCATTCTCC -3’ ；vpD: 5’ - CTGGATCC(BamH I )TTTTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACC -3’ ；
扩增体系为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2Χ 引物(vpU/vpD)I μ L，
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μ L)0.5 yL ,
ddH2032.5 μ L。扩增程序为:
94。。，2 min ；
98°C, 10 s ；68°C,2 min 30 s (30 个循环)；
取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的产物为两端带有酶切位点的AnVPl基因，通过克隆测序(同实施例3)，验证扩增片段是正确的。实施例10
本实施例为构建转化酵母突变菌株enal (由复旦大学蒯本科教授课题组惠赠)的表达载体pRS6-AnVPl，方法如下:
(O 实施例9扩增的片段以及表达载体pRS6 (由本实验室保存)骨架的制
备:
用限制性内切酶Xho I和BamH I按如下体系双酶切实施例9扩增的片段以及表达载体pRS6。双酶切体系:
BamH I1.0 μ L
Xho I1.0 UL
IOXK Buffer2.0 μ L
DNA4.0 μ LddH2012 μ L
30 ° C酶切8小时后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收与纯化(同实施例3)。(2) 表达载体pRS6_AnVPl的构建:
用T4 DNA连接酶将经过Xho I和BamH I双酶切回收和纯化后的AnVPl片段和pRS6线
性表达载体骨架按如下体系进行连接。连接体系:
目的 DNA0.03 pmol
载体 DNA0.01 pmol
IOX连接酶缓冲液 2.0 yL` T4 DNA连接酶LOyL
16 ° C连接8小时，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收与纯化(同实施例3)。实施例11
本实施例为表达载体pRS6-AnVPl的克隆、鉴定与双酶切检测，方法如下:
(1)表达载体pRS6-AnVPl的克隆与鉴定:(同实施例3)` (2)表达载体pRS6-AnVPl的双酶切检测:
将(I)鉴定的阳性菌液按0.1:50的比列接种到新鲜的含有Amp的LB液体培养基，37° C振荡培养过夜，提取质粒(按OMEGA公司的质粒提取试剂盒说明进行)并用XhoI和BamHI做双酶切鉴定(双酶切体系同实施例10)，结果如图5所示。(3)将酶切正确的质粒所对应菌液送英俊生物技术公司测序。实施例12
本实施例为酵母突变菌株enal的感受态制备，步骤如下:
(I)酵母菌株enal培养于YPD固体培养基上，30° C倒置培养。(2)挑取一个2-3 mm的单克隆菌体于3 mL YI3D液体培养基里，30° C，200 r/min摇床培养8-12 h。(3)取5 μ L培养物至50 mL新鲜的YH)液体培养基中，摇床培养至菌液在600nm波长下的吸光值(OD6qq)为0.15-0.3。(4) 700 r/min, 5min,室温离心菌体，弃上清，沉淀重悬于100 mL YPD液体培养基中。(5 ) 30。C 培养至 OD6qq=0.4-0.5。(6)将培养物平均分配到两个50 mL的离心管中，700 r/min，室温离心5 min。弃上清，沉淀悬浮于30 mL去离子水中。(7) 700 r/min,室温离心 5 min。弃上清,沉淀重悬于 1.5 mL 1.1 X TE/LiAc 中。(8)将菌体重悬物转移至1.5 mL的离心管中，高速离心15 S。(9)弃上清，沉淀重悬于600 μ L的1.1 X TE/LiAC中，准备转化。实施例13
本实施例为表达载体pRS6-AnVPl转化酵母突变菌株enal感受态，步骤如下:
Cl)单链载体DNA (10 mg/mL)的制备:称I g鲑鱼精DNA溶于100 mL TE缓冲液中。用10 mL移液管反复上下抽动使DNA分散均匀，然后置于磁力搅拌器中剧烈搅拌2-3 h直到完全溶解，或将溶液密封，置冷库内搅拌过夜。分装DNA样品，置-20° C条件下保存。使用前，放沸水浴中至少5 min，之后置于冰浴中快速冷却。(2)取2 μL目标质粒pRS6-AnVPl，同5 μ L单链载体DNA于L 5 mL的离心管中，再加入50 μ L酵母感受态细胞，轻轻混匀。(2)再往里面加入0.5 mL PEG/LiAC，轻轻混匀。(3)30。C 培养 30 min，每隔 10 min 混匀一次。(4)再加入20 μ L DMS0，轻轻混匀。(5)42° C，水浴 20 min，每隔 5 min 混匀一次。(6)高速离心15 s,弃上清。(7)沉淀重悬于I mL YH)液体培养基中，30° C，摇床培养90 min。(8)高速离心15 s,弃上清,重悬细胞于I mL 0.9% Cw/v) NaCl中。(9)取100 UL 1/10或1/100稀释度的混合液涂在组氨酸缺失的YNB培养基上，置于30° C，培养2-4 d，并挑选转化子。实施例14
本实施例为酵母盐胁迫对照试验，步骤如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突变菌株enal及转基因菌株enal_AnVPl的单克隆，酵母菌株WT、突变菌株enal接种至YPD液体培养基，转基因菌株enal-AnVPI接种至HIS缺失的YNB液体培养基中；于30° C，200rpm进行过夜培养；
(2)次日按1:100比例扩大培养至OD6tltl=L2-1.5时，用灭菌水稀释到各菌液的OD6tltl约为1.0 ;然后用灭菌水做5倍梯度稀释，各得到三个不同稀释度的菌液；
(3)从各稀释度的菌液中取3μ L，点至分别添加O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7mol/LU.0 mol/L NaCl的YB)固体盐胁迫培养基上，转基因菌株enal-AnVPl设置3个平行样，分别记为 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培养2-3d，观察菌斑生长情况，并照相保存，结果如图6所示:随着培养基中盐浓度的增加，各菌种的均逐渐变差，但在同一盐浓度下enal-AnVPl菌株的生长情况都优于enal菌株，说明本发明所述的AnVPl基因接种到酵母菌体内后能正常表达并是菌株显示出耐盐功能。实施例15
本实施例为酵母高温胁迫对照试验，步骤如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突变菌株enal及转基因菌株enal-AnVPI的单克隆，酵母菌株WT和突变菌株enal接种至YPD液体培养基，转基因菌株enal-AnVPI接种至HIS缺失的YNB液体培养基中；于30° C，200rpm进行过夜培养；
(2)次日按1:100比例扩大培养至0D_=1.2-1.5时，用灭菌水稀释到各菌液的OD6tltl约为1.0;然后按100 μ L/管分装至1.5ml的EP管，于53° C水浴锅进行高温处理2min、4min、6min、8min、IOmin ;以30° C培养的菌液做对照；
(3)将处理后的菌液于4°C冰箱冷却3 min，做5倍梯度进行稀释，各得到三个不同稀释度的菌液，从各稀释度的菌液中取3 μ L，点至YPD固体培养基，转基因菌株enal-AnVPl设置 3 个平行样，分别记为 enal-AnVPl-Ι、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVPl-3 ；
(4)30°C倒置培养2-3d，观察菌斑生长情况，并照相保存，结果如图7所示。随着水浴时间的增加，各菌种的生长情况均逐渐变差，但在同样的水浴时间下enal-AnVPl菌株的生长情况都优于enal菌株和WT菌株，说明本发明所述的AnVPl基因接种到酵母菌体内后能正常表达并使菌株显示出耐高温功能。实施例16
本实施例为酵母干旱胁迫对照试验，步骤如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突变菌株enal及转基因菌株enal-AnVPl的单克隆，酵母菌株WT和突变菌株enal接种至YPD液体培养基，转基因菌株enal-AnVPl接种至HIS缺失的YNB液体培养基中；于30° C，200rpm进行过夜培养；
(2)次日按1:100比例扩大培养至0D_=1.2-1.5时，用灭菌水稀释到菌液的OD6tltl约为1.0 ;然后用灭菌水做5倍梯度稀释，各得到三个不同稀释度的菌液；
(3)从各稀释度的菌液中取3μ L，点至分别添加O mol/L、2.0 mol/L、3.0 mol/L D-山梨醇(Sorbitolum)的YPD固体渗透胁迫培养基上，转基因菌株enal-AnVPl设置3个平行样，分别记为 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培养2-3d，观察菌斑生长情况，并照相保存，结果如图8所示。随着培养基中山梨醇浓度的增加，各菌种的生长情况均逐渐变差，但在同一山梨醇浓度下enal-AnVPI菌株的生长情况都优于enal菌株和WT菌株，说明本发明所述的AnVPl基因接种到酵母菌体内后能正常表达并使菌株显示出耐旱功能。序列表
权利要求
1.一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，该基因具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于:该基因的所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。
3.依照权利要求1所述的一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤: (1)总RNA的提取和纯化: 采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。
(2)中间片段的克隆: A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，以含有接头的3’ RACE Adaptor引物进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。
B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物jf3和下游引物jx3，进行PCR扩增。
扩增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。
(3)3，端的克隆: C、3，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP3-3’-outer和3’端下游引物3’ -RACE outer,进行3’端outer PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 3’端。
D、3，-1nnerPCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-1nner，以前述步骤C所得3’端的outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP3_3’-1nner和3’端下游引物3’ -RACE inner，进行3’端inner PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 3’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3’端完整序列。
(4)5’端的克隆: E、合成5’端的cDNA第一链: 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，对RNA进行预处理，加入含有接头的5’ RACE Adapter引物进行反转录: 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链。
F、5，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’-outer和5，端上游引物5，-RACE outer，进行5，端outer PCR扩增:扩增得到的产物为cDNA 5’端。
G、5，-1nner PCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’ -1nner,以前述步骤F所得5’端的outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’ -1nner和5’端上游引物5’ -RACE inner，进行5’端inner PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 5’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5’端完整序列。
(5)cDNA全长序列拼接和克隆 将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3’端inner PCR扩增序列和步骤(4)所得5’端inner PCR扩增序列进行完整序列的拼接，得到完整的基因序列。
(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆: 将上述步骤(4)合成5’端的cDNA第一链作为模板，根据上述步骤(5)的基因分析设计上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并进行PCR扩增: 扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(I)中，采用的RNA提取方法为试剂盒法；纯化方法为DNA酶消化法。
5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(2)中进行PCR扩增时， 扩增体系为: TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:jf3/jx3I UL , ddH2016 μ L o I型液泡膜焦磷酸酶基因中间片段扩增程序分别可优选为:95°C,3min ；95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min ;35 个循环； 72°C，8 min ;4°C保温。
6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(3)中进行3’-outerPCR扩增时， 扩增体系可优选为: IXcDNA Dilution Buffer II8 yL , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:GSP3-3，-outer/3，-RACE-outerI yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L ， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L , ddH2028.75 μ L。
扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 个循环;72°C，8 min ;4°C保温。
7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(3)中进行3’-1nnerPCR扩增时，扩增体系可优选为:dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L , 3，-outer PCR 产物2 μ L， 2X 引物:GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nnerI yL , IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 yL , ddH2028.75 μ L。
扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 个循环;72°C，8 min ;4°C保温。
8.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5’-outerPCR扩增时，扩增体系可优选为:cDNA 模板IyL,IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , 2X 引物:GSP3-5，-outer/5，-RACE outer2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。
扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 个循环;72°C，8 min ;12°C保温。
9.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5’-1nnerPCR扩增时，扩增体系可优选为: .5，-outer PCR 产物I μ L， .10Χ PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , .2X 引物:GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L , ddH2034.7 5 μ L。
扩增程序可优选为:.95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 个循环;72。。，8 min，12°C保温。
10.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(6)中进行PCR扩增时，扩增体系可优选为:dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,2X 引物:ORF3-S/ORF3-AI yL ,cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因扩增程序可优选为:98°C, 30 s ；62° C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 个循环。
全文摘要
本发明公开了一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，该基因具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。上述基因编码的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本发明还公开了一种上述来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。
文档编号C12N15/55GK103146722SQ20131010023
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月26日 优先权日2012年5月15日
发明者李晚忱, 雍太明, 付凤玲, 刘艳萍, 于好强, 邓龙群, 佘跃辉, 周树峰 申请人:四川农业大学