专利名称：荚用菜豆抗炭疽病分子诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的分子标记辅助早期筛查抗炭疽病菜豆种质资源及新品种的试剂盒及其利用该试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌[_CoIletotrichum Iindemuthianum (Sacc.etMagn.)Br.et Cav.]引起的一种真菌性病害，可侵染菜豆叶片、茎杆及豆荚等。感病品种一旦发病，减产在20%-30% ;当温度和湿度适宜的情况下，减产甚至达到100%。此外，在菜豆种子繁殖田中该病发生也十分普遍，种子带菌现象严重。带病菌的种子用于菜豆种植基地生产，造成炭疽病发生呈现恶性循环的态势。据报道，已有炭疽病发生的地区包括北京、天津、河北、内蒙古、山西、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、浙江、福建、江西、河南、湖南、广东、广西、四川、云南、陕西、台湾及香港等二十几个省市及地区等。
中国是世界上菜豆主产国之一，我国荚用菜豆产量位居世界第一，籽用菜豆产量列世界第三。目前我国荚用菜豆在生产上由于长期使用单一的品种和土地的连作等原因，许多菜田和繁种田炭疽病的发病率逐年升高。当温度13-26°C，相对湿度达到90%以上时容易发生此病。现阶段菜豆生产上对炭疽病防治主要采用化学药剂防治的方法，不仅耗费人力、物力，而且造成严重的农药残留。选育抗炭疽病菜豆品种是防治菜豆炭疽病最经济实用，也是最根本的解决方法。
我国十分重视菜豆抗炭疽病资源筛选和抗病育种，“八五”期间已经完成了种质资源库中保存资源抗病性的鉴定。有些育种单位还通过常规育种技术，选育出一批具有高抗和中抗的菜豆新品种，在生产上发挥了重要的作用，但由于选育周期较长，而且还消耗了大量的土地、人力和物力，所筛选出的品种远远不能满足生产上的需要。因此，依托生物技术，充分利用DNA分子标记遗传稳定性高，不受取材部位、时间、发育时期和环境的影响，操作简单、耗时少的优势，建立能在苗期就可对菜豆抗、感炭疽病性状进行大规模筛查的方法，对抗炭疽病菜豆新品种的选育具有重要意义。
在我国有关利用分子标记辅助育种方法对菜豆抗炭疽病进行抗病育种方面的研究未见报道。利用特异分子标记进行早期筛选的关键是筛选到与抗病相关的特异标记。发明内容
本发明目的是克服常规抗炭疽病菜豆选种技术的不足，提供一种快速、早期、大规模筛选抗炭疽病菜豆种质资源和新品种的试剂盒及其利用该试剂盒进行检测的方法。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容: 一种用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的特异性引物，其特征在于: 该特异性引物 1 为:GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC ； 特异性引物 2 为:ATTACTTGTGGAATITTCCATGAGTCGACA。
本发明进一步公开了用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒，其特征在于它是由特异引物 1:ACTTAACAAAATAAATAAACCTTAATT ;特异引物 2:ATCAATATTTTGTATCAGAAACCA ；dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6 X上样缓冲液、TBE电泳缓冲液及标准阳性 Marker 组成。其中 IOXPCR 缓冲溶液 2.5 μ LU0mmol/L dNTP 0.2-0.8 μ L、10 μ mol/L特异引物I和2各0.5-1.5 μ L、菜豆基因组DNA 200_500ng、Taq聚合酶1-2单位、无菌水补至25 μ L。本发明更进一步公开了采用此试剂盒在苗期对抗炭疽病菜豆品种进行筛查的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)一步法提取菜豆基因组DNA ；
(2)基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；
(3)PCR扩 增:在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入:PCR缓冲溶液、dNTP、特异引物1、特异引物2、菜豆基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为:90°C -95°C变性60-240秒，后进行90°C -95°C变性30-60秒，45 V -55 0C退火40-60秒，70 V -74°C延伸120秒的扩增循环，循环数为30-45个，最后在70°C -74°C延伸480秒，扩增完成；
(4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测:配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入0.5微克/毫升溴化乙锭；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入I微升6 X上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，60-150V恒电压，电泳1800-4800秒后停止电泳，凝胶直接在波长265nm紫外灯下或在凝胶成像仪器上进行观察；
(5)依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断未知菜豆抗、感炭疽病情况。本发明进一步公开了用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的特异性引物在苗期对抗炭疽病菜豆品种筛查的试剂盒方面的应用。采用试剂盒检测的实际情况如下:
1、方法
(I)样本(苗子)制备:在温室的营养钵中培育苗子，直至苗子长到两叶一心(10-15天)。(2)样本(苗子)标记、取样，提取样本DNA作为模板(8小时)。(3)按照试剂盒步骤在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入试剂盒中的药品(加药时间按照样品数量多少不同，约需要约0.5-1小时)，放入PCR仪中，2-3小时后得到PCR结
果O(4)电泳检测PCR结果，约需要0.5-1.2小时。2、步骤
(O提取抗、感炭疽病菜豆基因组DNA:取幼嫩菜豆叶片lOOmg，用剪刀将其剪碎置于组织研磨器中，加入10(^1^提取缓冲溶液(1%505，10臟01/1 Tris,0.3mol/L EDTA, 1%PVP,pH8.0)，充分研磨成匀浆，然后加入400 μ L提取缓冲溶液，混匀后置90°C水浴中温育20分钟，期间要不时的颠倒摇匀，取出后置于冰浴中5分钟，4°C保存备用。(2) DNA浓度的测定:可采用两种方法进行，一是利用紫外分光光度计测量，二是利用自制的已知标准的凝胶平板测量，一般的浓度要求在200ng以上/μ L即可。(3)PCR扩增:在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入:其中10XPCR缓冲溶液
2.5μ LU0mmol/L dNTP 0.2_0.8 μ L、10 μ mol/L特异引物 I 和 2 各 0.5-1.5 μ L、菜豆基因组DNA 200-500ng、Taq聚合酶1-2单位、无菌水补至25ML，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为:90°C _95°C变性60-240秒，后进行90°C -95°C变性30-60秒，45°C -55°C退火40-60秒，70°C _74°C延伸120秒的扩增循环,循环数为30-45个，最后在70°C -74°C延伸480秒，扩增完成。(4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测:配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升);在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入I微升6X上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，60-150V恒电压，电泳1800-4800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪器上进行观察；
(5)依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断菜豆抗、感炭疽病情况。如图1和图2所示:泳道M为DNA标准的分子量箭头示800bp ;泳道21为试剂盒提供的标准阳性Marker为750bp，1_10是已知抗炭疽病的菜豆植株；11_20是已知感病的菜豆植株，图2是田间随机取材检测的结果，随机取样的单株随后进行大田抗炭疽病性状观察:大田观察结果证实，有750bp带的是抗炭疽病的菜豆植株，无750bp条带的是感病的菜豆植株。结果检测结果与田间的吻合率达96%，检测重复性达到100%，特异性达到100%。本发明公开的用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒所具有的积极效果:
Cl)本发明的检测结果与田间的吻合率达96%，检测重复性达到100%，特异性达到
100%，而且具有简便、快速、准确，不受生长季节、环境条件等影响的特点，再定苗移栽前即可检测，节省了大量土地、人力、物力，缩短了选种的时间，在菜豆育种上具有重要的应用价值。(2)通过本发明选育的菜豆新品种是聚合了抗性基因和综合优良性状的抗炭疽病品种，生产上使用抗病品种，在适宜发病的自然条件下，菜豆不会发病，不再需要喷洒化学药剂防治。不仅节省了生产成本，而且降低了农药残留对环境的污染。
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图1为已知菜豆抗炭疽病植株的检测；
图2为菜豆田间随机检测炭疽病的结果。
具体实施例方式下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。实施例1.利用已知抗炭疽病和感炭疽病菜豆植株进行检测方法，包括以下步骤:
(O提取抗、感炭疽病菜豆基因组DNA:取幼嫩菜豆叶片lOOmg，用剪刀将其剪碎置于组织研磨器中，加入10(^1^提取缓冲溶液(1%505，10臟01/1 Tris,0.3mol/L EDTA, 1%PVP,pH8.0),充分研磨成匀浆，然后加入400 μ L提取缓冲溶液，混匀后置90°C水浴中温育20分钟，期间要不时的颠倒摇匀，取出后置于冰浴中5 分钟，4°C保存备用。(2) DNA浓度的测定:可采用两种方法进行，一是利用紫外分光光度计测量，二是利用自制的已知标准的凝胶平板测量，一般的浓度要求在200ng以上/μ L即可。
(3)PCR扩增:在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入:10XPCR缓冲溶液2.5 μ L、IOmmoI/L dNTP 0.5 μ L、10 μ mol/L 特异引物 I 和 2 各 I μ L、菜豆基因组 DNA 400ng、Taq聚合酶2单位、无菌水补至25 μ L，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为:95°C变性120秒，后进行95°C变性30秒，50°C退火50秒，72°C延伸120秒的扩增循环，循环数为30个，最后在72°C延伸480秒，扩增完成。
(4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测:配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升);在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入I微升6X上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，100V恒电压，电泳3000秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪器上进行观察； (5)依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断菜豆抗、感炭疽病情况，结果见图1电泳照片。
实施例2 用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒，其特征在于它是由特异性引物1:GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC ;特异性引物 2:ATTACTTGTGGAATTTTCCATGAGTCGACA ;dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6 X上样缓冲液、TBE电泳缓冲液及标准阳性Marker组成:其中10XPCR缓冲溶液2.0微升、10mmol/L dNTP 0.2微升、10 μ mol/L特异引物I和2各I微升、菜豆基因组DNA 400ng、Taq聚合酶2单位、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为:95°C变性120秒，后进行95°C变性30秒，55°C退火60秒，70°C延伸120秒的扩增循环，循环数为40个，最后在70°C延伸480秒，扩增完成； (4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测:配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入0.5微克/毫升溴化乙锭；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入I微升6 X上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，60V恒电压，电泳4800秒后停止电泳，凝胶直接在波长265nm紫外灯下或在凝胶成像仪器上进行观察。
实施例3 比较试验: 本发明是一种选育抗炭疽病荚用菜豆新品种的关键方法。通过本发明选育的菜豆新品种是聚合了抗性基因和综合优良性状的抗炭疽病品种，如果生产上使用抗病品种，在适宜发病的条件下，菜豆不会发病，不再需要喷洒化学药剂。不仅节省了生产成本，而且降低了农药残留对环境的污染。下面采用对比实验进一步加以说明: 表1:人工苗期接种鉴定与分子诊断试剂盒对比
权利要求
1.一种用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的特异性引物，其特征在于该特异性引物I为:GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC ;特异性引物 2 为:ATTACTTGTGGAATITTCCATGAGTCGACA。
2.一种用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒，其特征在于它是由特异引物1:GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC ;特异引物 2:ATTACTTGTGGAATTTTCCATGAGTCGACA ;dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6 X上样缓冲液、TBE电泳缓冲液及标准阳性Marker组成。
3.一种采用权利要求1所述的试剂盒在苗期对抗炭疽病菜豆种质资源进行筛查的方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)一步法提取菜豆基因组DNA ； (2)基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测； (3)PCR扩增:在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入:PCR缓冲溶液、dNTP、特异引物1、特异引物2、菜豆基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为:90°C _95°C变性60-240秒，后进行90°C -95°C变性30-60秒，45°C _55°C退火40-60秒，70 °C _74°C延伸120秒的扩增循环,循环数为30-45个，最后在70°C -74°C延伸480秒 ，扩增完成； (4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测:配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入0.5微克/毫升溴化乙锭；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入I微升6 X上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，60-150V恒电压，电泳1800-4800秒后停止电泳，凝胶直接在波长265nm紫外灯下或在凝胶成像仪器上进行观察； (5)依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断未知菜豆抗、感炭疽病情况。
4.权利要求1所述用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的特异性引物在制备苗期对抗炭疽病菜豆种质资源筛查的试剂盒方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于荚用菜豆抗炭疽病分子诊断的试剂盒，其特征在于它是由特异引物1GGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC；特异引物2ATTACTTGTGGAATTTTCCATGAGTCGACA；dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6×上样缓冲液、TBE电泳缓冲液及标准阳性Marker组成。本发明的检测结果与田间的吻合率达96%，检测重复性达到100%，特异性达到100%，而且具有简便、快速、准确，不受生长季节、环境条件等影响的特点，在实验室即可检测，节省了大量土地、人力、物力，缩短了选种的时间，在菜豆育种上具有重要的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK103146837SQ20131010237
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者古瑜, 韩启厚 申请人:天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所