次黄嘌呤核苷酸的生产方法
【专利摘要】本发明提供一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。该方法以腺苷酸为底物，原料供应充足，而且对设备要求低，分离提取方便，能够实现次黄苷酸的半连续生产，底物方便易得且转化彻底，成本较低。
【专利说明】次黄嘌呤核苷酸的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物合成领域，具体涉及一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法。
【背景技术】
[0002]次黄嘌呤核苷酸，又名次黄苷酸、肌苷酸或羟基嘌呤核苷酸，简称5，-1MP,是嘌呤核苷酸体内代谢的重要中间代谢产物，是腺苷酸与鸟苷酸代谢的纽带，可实现腺苷酸与鸟苷酸的相互转化，以保持体内嘌呤核苷酸代谢的平衡。次黄嘌呤核苷酸参与体内能量代谢和核蛋白的合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，使处于低能、缺氧状态下的组织细胞能够继续顺利地进行代谢，以及活化肝功能，使受损害肝细胞加快修复，并刺激体内产生抗体，适用于白细胞和血小板减少症、心肌损伤、肝炎及肝硬化。同时，次黄嘌呤核苷酸还是呈味核苷酸中的一种，与鸟甘酸合用可以显著增强味精的鲜味效果。
[0003]目前，次黄嘌呤核苷酸主要有化学合成法、天然原料提取法、微生物发酵法、发酵-催化结合法以及酶转化法等生产方法。而以上几种生产方法都有一定的缺陷。化学合成法由于产率低、副产物多且分离困难、设备要求较高等因素而不利于工业生产；天然原料提取法由于受到原料来源限制而不能大规模生产，难以满足社会需求；微生物发酵法及发酵-催化结合法以廉价原料实现次黄苷酸的生产，然而微生物积累的次黄苷酸的量是有限的，从而导致发酵液中次黄苷酸的浓度偏低，给后期的分离提取造成困难；酶转化法由于酶固有的缺陷而受到限制。这些缺陷导致次黄嘌呤核苷酸供应紧缺。
[0004]专利申请(CN1406273A)公开了一种利用工业微生物菌株一产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体生产次黄嘌呤核苷酸的生产工艺。其中烧瓶发酵与5L发酵罐中次黄苷酸的积累量可分别达到19.lg/L、70.3g/L，即便如此，从7.03%的溶液中分离提取次黄嘌呤核苷酸依然相当困难。`
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的主要目的在于提供一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法，该方法以腺苷酸为底物，原料供应充足，而且对设备要求低，分离提取方便，能够实现次黄苷酸的半连续生产，底物方便易得且转化彻底，成本较低。
[0006]本发明提供一种黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。
[0007]进一步地，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物或丙烯酸聚合物为骨架，以伯胺基、叔胺基或季胺基为功能基团的树脂；
[0008]优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物为骨架，以季氨基为功能基团的树脂；进一步优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以叔氨基为功能基团的树脂；或者以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以季铵基为功能基团的树脂。
[0009]进一步优选地，所述阴离子树脂为Amberlite IRA-900、Amberlite IRA-93或Amberlite IRA-400 树脂。[0010]进一步地，所述生产方法具体包括:
[0011]步骤1，对阴离子树脂进行预处理，并将腺苷酸脱氨酶固定于阴离子树脂；
[0012]步骤2，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸。
[0013]进一步地，所述步骤I具体包括:
[0014]步骤la，将阴离子树脂采用醇溶液浸泡、洗涤，抽滤，然后经强酸溶液浸泡、洗涤、抽滤，再经强碱溶液浸泡、洗涤、抽滤；然后再采用中性盐酸盐溶液浸泡、洗涤、抽滤，得到氯离子型阴离子树脂；
[0015]优选地，所述醇溶液为无水甲醇或无水乙醇，优选无水乙醇；
[0016]优选地，所述强酸溶液为HCl或H2SO4溶液；所述强酸溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强酸溶液优选IM的HCl溶液；
[0017]优选地，所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液；所述强碱溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强碱溶液优选IM的NaOH溶液；
[0018]优选地，所述中性盐酸盐溶液为NaCl或KCl溶液；所述中性盐酸盐溶液的浓度为
0.5-3M，优选IM ;所述中性盐酸盐溶液优选IM的NaCl溶液。
[0019]步骤lb，将得到的氯离子型阴离子树脂及腺苷酸脱氨酶溶液置于摇床上进行腺苷酸脱氨酶的固定化，设置温度20-35°C，取出后洗涤，使腺苷酸脱氨酶固定于树脂上；
`[0020]优选地，在步骤Ib之前，将腺苷酸脱氨酶溶液置于缓冲溶液中，调节pH为5-8，优选PH为5-6 ;优选地，所述缓冲溶液为乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。
[0021]进一步地，所述步骤2具体包括:
[0022]将底物腺苷酸溶解至去离子水中，调节pH为5-8，优选pH为5-6，40-55°C预热10-30min,优选IOmin,再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶,然后40-55°C保温，50-120转/分搅拌，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸；
[0023]优选地，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，采用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，优选3M的HCl溶液调节pH。
[0024]进一步地，所述底物腺苷酸的浓度为100-300g/L。
[0025]进一步地，所述生产方法还包括阴离子树脂的再生步骤。
[0026]进一步地，所述再生包括以碱洗脱阴离子树脂，然后再采用NaCl溶液，优选IM的NaCl溶液进行浸泡、洗涤、抽滤，将羟基型阴离子树脂转变为氯离子型阴离子树脂。
[0027]以下为本发明技术方案的详细描述:
[0028]本发明的基本原理如下:腺苷酸脱氨酶蛋白分子的等电点在5.6左右，表明在中性及微酸性环境中蛋白质分子带负电荷的状态为优势形式，可以与阳离子形成离子键。利用此机理，本发明将选择的阴离子树脂来固定腺苷酸脱氨酶，以达到高效的固酶效果，从而利用固定化腺苷酸脱氨酶实现次黄嘌呤核苷酸的半连续生产。
[0029]其中，本发明采用的腺苷酸脱氨酶为已商品化的脱氨酶，该酶可由蜂蜜曲霉发酵纯化制得，单位酶活为10U/ml酶液(IU=实验条件下每分钟内生成Img次黄嘌呤核苷酸所需的酶量)。
[0030]本发明对选用的阴离子树脂进行醇-碱-酸-碱处理，即依次用醇、强碱、强酸、强碱对阴离子树脂进行预处理，去除阴离子树脂在制备过程中残留的醇、强酸及强碱可溶性杂质，最后用盐酸盐溶液对阴离子树脂进行转型，然后将转型后的树脂置于PH5-6的乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中进行腺苷酸脱氨酶的固定化，由于腺苷酸脱氨酶蛋白分子在中性及微酸性的溶液环境中带负电，因此可以与阴离子树脂表面的Cl—进行交换，实现酶蛋白的固定化。
[0031]具体的固定化步骤如下:
[0032]步骤A，称取一定质量的阴离子树脂于容器中，加入无水醇溶液，浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液中无醇残留，然后抽滤，其中所述无水醇醇溶液为无水甲醇或无水乙醇，优选无水乙醇；
[0033]步骤B，将步骤A中得到的树脂用I-3M优选IM的强碱溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液，优选IM的NaOH溶液；
[0034]步骤C，将步骤B中得到的树脂用I-3M优选IM的强酸溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强酸溶液为HCl或H2SO4溶液，优选IM的HCl溶液；
[0035]步骤D，将步骤C中得到的树脂用I-3M优选IM的强碱溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液，优选IM的NaOH溶液；
[0036]步骤E，将步骤D中得到的树脂用0.5-3M优选IM的中性盐酸盐溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，得到氯离子型阴离子树脂，其中所述盐酸盐溶液为NaCl或KCl溶液，优选IM的NaCl溶液；
[0037]步骤F，将步骤E中得到的氯离子型阴离子树脂与一定体积的腺苷酸脱氨酶溶液，置于20-35°C, 150-250rpm的摇床上固定化2h,取出后用去离子水洗漆至洗脱液中无酶活与蛋白残留；
[0038]优选地，在步骤F之前，将腺苷酸脱氨酶溶液置于缓冲溶液中，调节pH为5-8，优选pH为5-6 ;优选地，所述缓冲溶液为乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；
[0039]步骤G，将步骤F得到的固定化酶在4°C下保存，得到固定化腺苷酸脱氨酶。
[0040]根据本发明提供的固定化酶方法，所得到的固定化酶的酶活可达到10-23U/g湿树脂。
[0041]本发明中的酶活测定的方法如下:
[0042]将步骤Ig得到的固定化酶在室温干燥后称取0.3g，加入到4ml经预热的底物缓冲液(75g/L)中，55°C保温15min，然后加入4ml7%的高氯酸溶液终止酶反应，液相检测反应液中次黄嘌呤核苷酸的含量。
[0043]其中，上述测定方法中采用的缓冲液为0.2M的乙酸缓冲溶液体系，pH为5.6。
[0044]液相检测条件如下:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm。
[0045]进一步地，本发明的次黄嘌呤核苷酸的具体制备过程如下:
[0046]将腺苷酸溶解至去离子水中，用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，优选3M的HCl溶液调节pH为pH5-8优选pH5-6，40-55°C下水浴预热10-30min，优选IOmin,然后加入上述得到的固定化腺苷酸脱氨酶,40-55°C水浴保温,50-120rpm机械搅拌，定时取样检测反应液中腺苷酸及次黄嘌呤核苷酸的含量，以确定转化程度，至OD265nm不再下降或液相检测不到次黄嘌呤核苷酸出峰信号，此时认为腺苷酸已全部转化为次黄嘌呤核苷酸，结束一个生产周期。
[0047]其中，上述反应过程中需要严格控制pH，使pH稳定在pH5-8优选pH5-6范围内。
[0048]其中，一个生产周期结束后，可将本发明的固定化腺苷酸脱氨酶用去离子水淋洗，然后投入到下一个生产周期或者于4°C保存以备后续使用。
[0049]另外，当本发明的固定化腺苷酸脱氨酶经多次反应催化性能降低时，可以碱洗脱的方式对阴离子树脂进行再生，然后将再生后的阴离子树脂采用盐酸盐进行转型，以重复使用。
[0050]与现有技术相比，本发明提供的次黄嘌呤核苷酸的生产方法至少具有以下优点:
[0051]一、本发明以固定化酶技术为基础，以阴离子交换树脂为固定化载体对腺苷酸脱氨酶(EC3.5.4.6)进行固定化，生产次黄嘌呤核苷酸，可实现腺苷酸到次黄嘌呤核苷酸的半连续转化生产，与化学合成方法相比，降低了对设备的要求，减少了固定资产的投入；
[0052]二、本发明采用核苷酸工业中的过生产物腺苷酸为底物，底物方便易得(约占核苷酸总量的25%)，供应充足，可实现高浓度下的催化转化，并可使底物达到99.99%以上的转化率，便于后续的分离提纯；次黄嘌呤核苷酸需求紧缺，因此以腺苷酸为底物，经腺苷酸脱氨酶催化生成次黄嘌呤核苷酸具有重要意义；
[0053]三、本发明通过吸附作用将腺苷酸脱氨酶固定到树脂表面，固定化方法简便易行，提高了腺苷酸脱氨酶的催化稳定性，且固定化成本低，与游离酶催化相比，该固定化酶技术使得腺苷酸脱氨酶的最适PH变宽，更加适用于腺苷酸脱氨的催化过程；
[0054]四、本发明的腺苷酸脱氨酶通过本发明中的固定化方法可以进行多次循环使用，有利于降低成本，且固定化过程中不使用交联试剂，生产过程中杂质少，使生产更加绿色，且有利于减少后期分离提取成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0056]图1显示了采用Amberlite IRA-900树脂固定的腺苷酸脱氨酶的催化反应活性随反应批次的变化曲线。
【具体实施方式】
[0057]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0058]下述实施例中的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0059]实施例1
[0060]树脂的预处理:根据下述方法步骤对Amberlite IRA-900树脂进行预处理:
[0061]步骤la，称取200g Amberlite IRA-900树脂于IL三角烧瓶中，加入600ml无水乙醇，浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液中无乙醇残留，然后抽滤；
[0062]步骤lb，将步骤Ia中得到的树脂用600ml IM NaOH溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈pH中性，然后抽滤；
[0063]步骤lc，将步骤Ib中得到的树脂用600ml IM HCl溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤；
[0064]步骤ld，将步骤Ic中得到的树脂用600ml IM NaOH溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈pH中性，然后抽滤；
[0065]步骤le，将步骤Id中得到的树脂用600ml 0.5M NaCl溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈pH中性，然后抽滤，得到预处理的AmberliteIRA-900树脂。
[0066]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-900树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(21.98U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约1.25h后，0D265nm不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次，如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至1.40h。
[0067]图1显示了采用Amberlite IRA-900树脂固定的腺苷酸脱氨酶的催化反应活性随反应批次的变化曲线，从图1看出，随着反应批次的增加，腺苷酸脱氨酶的催化反应活性逐渐降低，经30次反应后，腺苷酸脱氨酶的`催化反应活性降低至约89.29%。
[0068]实施例2
[0069]树脂的预处理:根据与实施例1相同的方法对Amberlite IRA-93树脂进行预处理。
[0070]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-93树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(13.17U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约2.5h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后，批次反应时间延长至3.21h。
[0071]实施例3
[0072]树脂的预处理:根据与实施例1相同的方法对Amberlite IRA-400树脂进行预处理。
[0073]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-400树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入乙酸盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(14.37U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约3.25h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至4.51h。
[0074]实施例4
[0075]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-900树脂进行预处理，不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为2M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为IM0
[0076]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-900树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入碳酸氢盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(20.98U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，80rpm机械搅拌条件下进行脱 氨反应，通过滴加3M盐酸溶液控制pH为约5.6。约1.28h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至1.45h。
[0077]实施例5
[0078]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-93树脂进行预处理。不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为2.5M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为1.5M。
[0079]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-93树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入碳酸氢盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(13.27U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L，pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约2.5h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后，批次反应时间延长至3.21h。
[0080]实施例6
[0081]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-400树脂进行预处理，不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为1.5M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为1M。
[0082]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-400树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入硼酸盐缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于20°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(14.37U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约3.25h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至4.52h。
[0083]实施例7
[0084]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-900树脂进行预处理，不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为3M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为2M。
[0085]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-900树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl缓冲溶液，调节pH为5-6)，将三角瓶置于25°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(22.98U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，IOOrpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加5M乙酸溶液控制pH为5-6。约1.15h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化`酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至1.29h。
[0086]实施例8
[0087]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-93树脂进行预处理。不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为3M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为3M。
[0088]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-93树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl缓冲溶液，调节pH为5-6),将三角瓶置于30°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(13.56U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，50rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约2.48h后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至3.26h。
[0089]实施例9
[0090]树脂的预处理:根据与实施例1相似的方法对Amberlite IRA-400树脂进行预处理，不同的是步骤Ib-1d中的NaOH及HCl溶液的浓度为2M，步骤Ie中的NaCl溶液的浓度为3M。
[0091]催化反应:称取上述预处理过的Amberlite IRA-400树脂IOg于IOOml的三角瓶中，然后加入50ml腺苷酸脱氨酶溶液(10U/ml，其中加入Tris-HCl缓冲溶液，调节pH为5-6),将三角瓶置于35°C, 150rpm的摇床上固定化2h后回收固定化酶,采用去离子水对固定化酶进行洗涤，直至洗脱液中无蛋白及酶活残留。将得到的固定化酶(15.37U/g)加入到IOOml经40°C预热的腺苷酸溶液中(100g/L, pH5-6)，使腺苷酸在40°C，60rpm的机械搅拌条件下进行脱氨反应，通过滴加IM盐酸溶液控制pH为5-6。约3.1Oh后，0D265不再下降，液相检测(液相条件:流动相为0.02M磷酸二氢铵溶液，含有3.5%的甲醇(v/v)，流速为lml/min，色谱柱为C18亲水柱，检测器波长为254nm)不到次黄嘌呤核苷酸信号，腺苷酸的转化率为99.99以上％。固定化酶滤出后采用去离子水洗涤三次，投入到下一批次。如此重复使用固定化脱氨酶，第30次使用后,批次反应时间延长至4.48h。
[0092]实施例10
[0093]与实施例4相似，所不同的是催化反应过程中固定化时所用腺苷酸脱氨酶溶液为30ml,固定化酶单位酶活为17.86U/g。第I批次反应时间约为1.51h，第30批次反应时间约为1.71h。
[0094]实施例U
[0095]与实施例5相似，所不同`的是催化反应过程中用3M乙酸溶液调节pH为5-6。
[0096]实施例12
[0097]与实施例6相似，所不同的是催化反应过程中使腺苷酸在55°C下进行脱氨反应。第I批次反应时间约为2.51h，第30批次反应时间约为3.49h。
[0098]实施例13
[0099]与实施例1相似，所不同的是催化反应过程中在30°C下回收固定化酶，固定化酶单位酶活为23.56U/g。第I批次反应时间约为1.17h，第30批次反应时间约为1.31h。
[0100]实施例14
[0101]与实施例8相似，所不同的是催化过程中用6M乙酸溶液调节pH为5-6。
[0102]实施例15
[0103]与实施例1相似，所不同的是步骤Ib-1d中对树脂进行预处理的酸碱分别为2M的H2SO4溶液与2M的NaOH溶液，步骤Ie中树脂转型所用的盐酸盐溶液为IM的KCl溶液。
[0104]实施例16
[0105]与实施例2相似，所不同的是步骤Ib-1d中对树脂进行预处理的酸碱分别为3M的H2SO4溶液与3M的NaOH溶液，步骤Ie中树脂转型所用的盐酸盐溶液为3M的KCl溶液。
[0106]实施例17
[0107]与实施例1相似，所不同的是催化反应时所用腺苷酸溶液的浓度为150g/L。
[0108]实施例18
[0109]与实施例8相似，所不同的是催化反应时所用腺苷酸溶液的浓度为250g/L。[0110]实施例19
[0111]与实施例11相似，所不同的是催化反应时所用腺苷酸溶液的浓度为300g/L。
[0112]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【权利要求】
1.一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物或丙烯酸聚合物为骨架，以伯胺基、叔胺基或季胺基为功能基团的树脂； 优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物为骨架，以季氨基为功能基团的树脂；进一步优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以叔氨基为功能基团的树脂；或者以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以季铵基为功能基团的树脂； 进一步优选地，所述阴离子树脂为Amberlite IRA-900、Amberlite IRA-93或Amberlite IRA-400 树脂。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法具体包括: 步骤1，对阴离子树脂进行预处理，并将腺苷酸脱氨酶固定于阴离子树脂； 步骤2，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述步骤I具体包括: 步骤la，将阴离子树脂采用醇溶液浸泡、洗涤，抽滤，然后经强酸溶液浸泡、洗涤、抽滤，再经强碱溶液浸泡、洗涤、抽滤；然后再采用中性盐酸盐溶液浸泡、洗涤、抽滤，得到氯离子型阴离子树脂； 优选地，所述醇溶液为无水甲醇或无水乙醇，优选无水乙醇； 优选地，所述强酸溶液为HCl或H2SO4溶液；所述强酸溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强酸溶液优选IM的 HCl溶液； 优选地，所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液；所述强碱溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强碱溶液优选IM的NaOH溶液； 优选地，所述中性盐酸盐溶液为NaCl或KCl溶液；所述中性盐酸盐溶液的浓度为0.5-3M，优选IM ;所述中性盐酸盐溶液优选IM的NaCl溶液； 步骤lb，将得到的氯离子型阴离子树脂及腺苷酸脱氨酶溶液置于摇床上进行腺苷酸脱氨酶的固定化，设置温度20-35°C，取出后洗涤，使腺苷酸脱氨酶固定于树脂上； 优选地，在步骤Ib之前，将腺苷酸脱氨酶溶液置于缓冲溶液中，调节pH为5-8，优选PH为5-6 ;优选地，所述缓冲溶液为乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求3或4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2具体包括: 将底物腺苷酸溶解至去离子水中，调节PH为5-8，优选pH为5-6，40-55°C预热10-30min,优选IOmin,再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶，然后40-55?保温，50-120转/分搅拌，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸； 优选地，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，采用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，优选3M的HCl溶液调节pH。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的生产方法,其特征在于,所述底物腺苷酸的浓度为 100 -300g/L。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法还包括阴离子树脂的再生步骤。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述再生包括以碱洗脱阴离子树脂，然后再采用NaCl溶液，优选IM的NaCl溶液进行浸泡、洗涤、抽滤，将羟基型阴离子树脂转变为氯离子型阴 离子树脂。
【文档编号】C12P19/32GK103451255SQ201310106699
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年3月28日 优先权日:2013年3月28日
【发明者】应汉杰, 曹治, 陈勇, 陈晓春, 吴菁岚, 谢婧婧 申请人:南京工业大学