专利名称：一种ssap分子标记技术在牡丹上的标记方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法。
背景技术：
牡丹suffruticosa Andr.)为苟药科苟药属牡丹组的木本植物,是原产于中国的传统名花。其品种丰富，花朵硕大，多姿多彩，雍容华贵。素有“国色天香”、“花中之王”之称。每年4 5月开花，朵大色艳，奇丽无比，姿丰典雅，花香袭人，深受人们的喜爱。因此，提高牡丹的研究水平，促进牡丹产业化发展具有重要意义。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记一形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴另U、基因库构建、基因克隆等方面。逆转座子在植物基因组中以高拷贝、高异质性和广泛存在等特点，在不少主要作物中已经研究开发出基于逆转座子的分子标记，并且得到广泛应用。两端含有长末端重复序列(LTRs)的Tyl-copia类逆转座子是高等植物中逆转座子的主要类型,而SSAP是Waugh等1997年在大麦上开发的一种基于逆转座子LTR序列的锚定AFLP技术(Waugh，1997)。与AFLP, RAPD等分子标记相比，SSAP标记多态性最高，并且利用SSAP方法分析得到的植物分类和进化信息结果更接近于地理和形态上的分析结果。SSAP分子标记技术目前已经成功用于葡萄、大麦、苹果等物种 的遗传多样性分析(Labra, 2004 ；Queen, 2004 ；Venturi, 2006),但至今尚无基于Tyl-copia类逆转座子的SSAP分子标记在牡丹上的应用。SSAP分子标记步骤繁多，不同物种之间的逆转座子LTR序列异质性很大。因此，解决基于牡丹LTRs引物的开发和具体PCR体系的优化，成为SSAP分子标记技术在牡丹上应用的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，不仅可以使SSAP分子标记技术直接用于牡丹种属之间多态性的分析，而且更具有高效性和实用性。本发明所提供的技术方案是:一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，包括以下步骤:
步骤一、设计引物
设计Mse I和EcoR I接头引物、预扩增PCR弓丨物、接头选择性扩增PCR引物、逆转座子PCR引物，引物序列走向为5 端到3 端:1)接头引物 Mse I接头引物
Mse 15 端接头引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接头引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接头引物
&ο7 Ι5 端接头引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC &ο7 Ι3 端接头引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC
2)预扩增引物
Mse I 预扩增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoRl 预扩增引物:Ezx00 GACTGCGTACCAATTCA
3)选择性扩增引物 接头选择扩增引物:
Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGTCCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆转座子引物:
PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT` PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步骤二、牡丹基因组DNA的提取
选取牡丹新鲜的嫩叶，捣碎，利用CTAB法提取基因组DNA:
1)将牡丹幼嫩叶片放入研钵，加入10(Tl30mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入液氮迅速研磨至粉末状，转移研磨液至预先冷却、洁净的1.5ml离心管中，备用；
2)向上述离心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在温度为65°C的条件下水浴Ih,期间，每隔5min颠倒混勻一次；` 3)待离心管冷却至室温，取出离心管，向离心管中加入等体积氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀 IOmin ；
4)将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin；
5)取上清溶液转移至另一1.5ml离心管内，再加入等体积氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀IOmin ；6)将离心管小心放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin；
7)将上清溶液转移至另一离心管中，加入离心管容积2/3的预冷无水乙醇，迅速颠倒混匀，然后放入温度为-20°C的冰箱内Ih ；
8)用枪头挑出白色絮状物转移至另一离心管中，加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin ；
9)倒掉上清溶液，再加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin；
10)倒掉上清溶液，室温下自然风干；
11)加入5(T500mlTE溶液，放入温度为_20°C的冰箱内备用；
步骤三、牡丹基因组DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A试剂盒对提取的牡丹基因组DNA进行处理:取牡丹基因组DNA原液稀释至50ng/μ I后加入I μ I RNase A混匀，瞬时离心后在温度为37°C的条件下水浴lh，之后转入温度为-20°C的条件下保存，备用；
步骤四、牡丹基因组DNA的酶切
利用Takara酶切试剂盒中的i&e I和及I限制性内切酶对步骤三中制备的牡丹基因组DNA进行酶切，20μ I的酶切反应液成分为:质量浓度为50ng/l.! I的基因组DNA5 10 μ 1，稀释 10 倍后的 NEBuffer4 2 μ 1，稀释 100 倍后的 BSA 0.2 μ I, Mse I 酶0.5 μI酶0.5 μ 1，余量为双蒸水；具体步骤为:
1)将限制性内切酶从冰箱内取出放置冰上；
2)将DNA、NEBuffer4、BSA和双蒸水按上述量混匀，在温度为4°C的条件下放置30min；
3)加入限制性内切酶，混匀，瞬时离心；
4)在温度为37°C的条件下水浴f3h，之后放入温度为4°C的冰箱内备用；
步骤五、接头的准备
1)将Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接头引物稀释到 50 mmol / I ；
2)上述四种接头引物各取25μ I两两配对混合均匀；
3)将配对混合均匀后的接头引物放到PCR中，先在温度为94°C的条件下反应lmin，然后在温度为36°C的条件下反应5min ；
4)室温下慢慢冷却，最后合成25μ M的接头引物Mse接头和EcoR接头；
步骤六、酶切产物和接头的连接
利用Takara Τ4 DNA Ligase连接试剂盒进行连接
1)在微量PCR离心管内配制25μ I PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8μ 1，步骤五中的i&e接头引物和及接头引物各2.5μ 1，T4 DNA连接酶I μ 1，稀释10倍后的Ligation Buffer2.5 μ I,余量用双蒸水补齐至25 μ I ；
2)用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保存，备用；
步骤七、连接产物的预扩增
1)将预扩增引物MzxOO和EzxOO稀释至20μ M后备用；
2)在微量PCR离心管配制25μ I PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ 1，稀释10倍后的 Buffer 2.5 μ I,Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，Μζχ00 和 EzxOO 两种预扩增引物各 0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ 1，余量用双蒸水补齐至25 μ I ;3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C变性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36个循环，72°C延伸lOmin，得到PCR产物；
4)PCR扩增产物稀释20 40倍，备用；
步骤八、选择性扩增反应
1)将选择性扩增引物和逆转座子引物稀释到20μ M后备用；
2)在200μ IPCR离心管内配制25 μ I PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5 10 μ 1，稀释10倍后的Buffer2.5 μ 1，Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，选择性扩增引物和逆转座子引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用双蒸水补齐至25 μ I ; 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5min, 94°C变性30s, 68°C退火30s,采用touchdown方法,每个循环降低0.7 V,72°C延伸Imin 12个循环，然后再94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin 23个循环，最后72°C延伸5min ；
步骤九、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
1)将电泳所使用的长、短玻璃板用水清洗后风干；
2)用双蒸水清洗后风干，重复3次，每次间隔3min；
3)用质量浓度为95%的酒精清洗后风干，重复3次，每次间隔3min；
4)取Iml反娃化液和2μ I反娃化剂均匀混合后涂在长玻璃板上,室温下放置5min后用质量浓度为95%酒精擦洗3次，每次间隔5min ；
5)取Iml剥离硅烷均匀涂于短玻璃板上，室温下放置5min后用质量浓度为95%的酒精擦洗3次,每次间隔5min ；
6)放入边条至长玻璃板两端，将两块儿玻璃板放置并用夹子固定在一起，擦洗面向内，且两玻璃板不接触，用透明胶对长玻璃板和短玻璃板封边，夹夹子，之后以10°的倾斜角放于平稳实验台面上；
7)室温下放置3 4分钟后倒入胶液，插入梳子，室温下凝胶4 6h；
8)去夹子，撕掉透明胶带，将玻璃板外部冲洗干净，拔去梳子，立即冲洗拔去梳子后的点样孔；
9)预电泳:将玻璃板固定于电泳槽上，上下槽各加入稀释I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的条件下，电泳 15 30min ；
10)在扩增产物中加入1/10体积溴酚蓝，取4μI上样，在恒定功率为80W的条件下电泳2 4h，待溴酚蓝跑至胶板高度的3/4处后停止电泳；
11)漂洗:将玻璃板放入2L双蒸水中漂洗3次；
12)固定和银染:加入染色固定液进行银染和固定20min，双蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法为:加入150ml无水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸银,双蒸水定容至1.5L ；
13)显影:加入显影液进行显影8min，用双蒸水漂洗3次。14)拍照 15)结果分析
所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA、Nacl和水组成，其中100ml CTAB溶液按体积比取IOml lmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。所述步骤二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中200mlTE溶液按体积比取 2ml 1 mol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量为水。
所述步骤九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和双蒸水组成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5 mol/1 的 EDTA 20ml，双蒸水定容至 IL0
所述步骤九中的胶液配制方法为:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀释5倍后的TBE 50ml，双蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 ill 10%水溶液的过硫酸铵和40 U I Temed。
所述显影液的配制方法为:加入20g NaOH, 4ml甲醒,双蒸水定容至1L。
所述步骤二中的氯仿异戊醇溶液为氯仿和异戊醇按体积比24:1混匀制成。
本发明的有益效果是:本发明通过设计牡丹属逆转座子LTR序列引物，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带丰富，和应用其他物种上的LTR引物相比，本引物可直接用于牡丹种属之间多态性的分析，更具有高效性和实用性，对牡丹SSAP分子标记意义重大，在本发明中选择性扩增PCR体系得到优化，更适合牡丹属SSAP分子标记的扩增，而且还改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，将银染中固定和染色步骤合二为一，既节省时间，又节约成本，进一步提高了 SSAP分子标记在牡丹属上应用的效率。
图1为SSAP分子标记技术原理路线不意图； 图2为选择性扩增琼脂糖电泳检测图； 图3为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一 一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，包括以下步骤: 步骤一、设计引物 设计Mse I和EcoR I接头引物、预扩增PCR引物、接头选择性扩增PCR引物、逆转座子PCR引物，引物序列走向为5 端到3 端: 1)接头引物 Mse I接头引物 Mse 15 端接头引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接头引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接头引物 EcoRI5 端接头引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI3 端接头引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC 2)预扩增引物 Mse I 预扩增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoR I 预扩增引物:EzxOO GACTGCGTACCAATTCA3)选择性扩增引物 接头选择扩增引物:Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGTCCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆转座子引物: PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步骤二、牡丹基因组DNA的提取 选取牡丹新鲜的嫩叶，捣碎，利用CTAB法提取基因组DNA: 1)将牡丹幼嫩叶片放入研钵内，加入115mg聚乙烯吡咯烷酮，再加入液氮迅速研磨至粉末状，转移研磨液至预先冷却、洁净的1.5ml离心管中，备用； 2)向上述离心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在温度为65°C的条件下水浴lh，水浴过程中，每隔5min颠倒混匀一次； 3)待离心管冷却至室温后，取出离心管，向离心管中加入0.75ml氯仿异戊醇溶液，颠倒混勻IOmin ； 4)将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin； 5)将离心管内的上 清溶液转移至另一1.5ml离心管内，再加入与上清溶液等体积的氯仿异戍醇溶液，颠倒混勻IO min ； 6)将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin； 7)将上清溶液转移至另一离心管中，加入离心管容积2/3的预冷无水乙醇，迅速颠倒混匀，然后放入温度为-20°C的冰箱内Ih ； 8)用枪头挑出白色絮状物转移至另一离心管中，加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin ； 9)倒掉离心管内上清溶液，再加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin； 10)倒掉上清溶液，室温下自然风干； 11)加入5(T500mlTE溶液，放入温度为_20°C的冰箱内备用； 步骤三、牡丹基因组DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A试剂盒对提取的牡丹基因组DNA进行处理:取牡丹基因组DNA原液稀释至50ng/ill后加入I ill RNase A混匀，瞬时离心后在温度为37°C的条件下水浴lh，之后转入温度为-20°C的条件下保存，备用； 步骤四、牡丹基因组DNA的酶切 利用Takara酶切试剂盒中的i&e I和及限制性内切酶对步骤三中制备的牡丹基因组DNA进行酶切，20 ill的酶切反应液成分为:质量浓度为50ng/iil的基因组DNA 7u I,稀释 10 倍后的 NEBuffer4 2 U 1，稀释 100 倍后的 BSA 0.2 u I,Mse I 酶 0.5 y !,EcoR I 酶0.5iU，余量为双蒸水；具体步骤为: 1)将限制性内切酶从冰箱内取出放置冰上； 2)将DNA、NEBuffer4、BSA和双蒸水按上述量混匀，在温度为4°C的条件下放置30min； 3)加入限制性内切酶，混匀，瞬时离心； 4)在温度为37°C的条件下水浴2h，之后放入温度为4°C的冰箱内备用； 步骤五、接头的准备 1)将Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接头引物稀释到 50mmol/l ； 2)上述四种接头引物各取25Ul两两配对混合均匀； 3)将配对混合均匀后的接头引物放到PCR中，先在温度为94°C的条件下反应lmin，然后在温度为36°C的条件下反应5min ； 4)室温下慢慢冷却，最后合成25ii M的接头引物i&e接头和接头； 步骤六、酶切产物和接头的连接 利用Takara T4 DNA Ligase连接试剂盒进行连接 1)在微量PCR离心管内配制25ill PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8iil，步骤五中的Mse接头引物和EcoR接头引物各2.5iil，T4 DNA连接酶I yl，稀释10倍后的Ligation Buffer2.5 u I,余量用双蒸水补齐至25 U I ； 2)用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保存，备用; 步骤七、连接产物的预扩增 1)将预扩增引物MzxOO和EzxOO稀释至20u M后备用； 2)在微量PCR离心管配制25ill PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 yl，稀释10倍后的 Buffer 2.5 u I,Mg2+ 1.875 u l，dNTP 0.5 u I，MzxOO 和 EzxOO 两种预扩增引物各 0.5 y 1，Taq酶0.2 iil，余量用双蒸 水补齐至25 yl ; 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C变性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36个循环，72°C延伸lOmin，得到PCR产物； 4)PCR扩增产物稀释30倍，备用； 步骤八、选择性扩增反应 1)将选择性扩增引物和逆转座子引物稀释到20y mol/1后备用； 2)在200ill的PCR离心管内配制25 ill PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液7iil，稀释10倍后的Buffer2.5iil，Mg2+ 1.875 u l,dNTP 0.5 yl，选择性扩增引物和逆转座子引物各0.5 iil，Taq酶0.2 ii I，余量用双蒸水补齐至25 yl ; 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5min, 94°C变性30s, 68°C退火30s,采用touchdown,每个循环降0.7°C, 72°C延伸lmin 12个循环，然后再94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin 23个循环，最后72°C 延伸 5min ； 步骤九、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1)将电泳所使用的长、短玻璃板用水清洗后风干； 2)用双蒸水清洗后风干，重复3次，每次间隔3min； 3)用质量浓度为95%的酒精清洗后风干，重复3次，每次间隔3min； 4)取Iml反娃化液和2ii I反娃化剂均匀混合后涂在长玻璃板上,室温下放置5min后用质量浓度为95%酒精擦洗3次，每次间隔5min ； 5)取Iml剥离硅烷均匀涂于短玻璃板上，室温下放置5min后用质量浓度为95%的酒精擦洗3次,每次间隔5min ； 6 )将两块J L玻璃板固定在一起，擦洗面向内，且两玻璃板不接触，用透明胶对长玻璃板和短玻璃板封边，夹夹子，之后以10°的倾斜角放于平稳实验台面上； 7)室温下放置4分钟后倒 入胶液，插入梳子，室温下凝胶5h； 8)去夹子，撕掉透明胶带，将玻璃板外部冲洗干净，拔去梳子，立即冲洗拔去梳子后的点样孔； 9)预电泳:将玻璃板固定于电泳槽上，上下槽各加入稀释I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的条件下，电泳 20min ； 10)在扩增产物中加入1/10体积溴酚蓝，取4iil上样，在恒定功率为80W的条件下电泳3h，待溴酚蓝跑至胶板高度的3/4处后停止电泳； 11)漂洗:将玻璃板放入2L双蒸水中漂洗3次； 12)固定和银染:加入染色固定液进行银染和固定20min，双蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法为:加入150ml无水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸银,双蒸水定容至1.5L ； 13)显影:加入显影液进行显影8min，用双蒸水漂洗3次。
所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA、Nacl和水组成，其中100ml CTAB溶液按体积比取 IOml lmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。
所述步骤二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中200mlTE溶液按体积比取 2ml I mol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量为水。
所述步骤九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和双蒸水组成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5 mol/1 的 EDTA 20ml，双蒸水定容至 IL0
所述步骤九中的胶液配制方法为:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀释5倍后的TBE 50ml，双蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 ill 10%水溶液的过硫酸铵和40 U I Temed。
所述显影液的配制方法为:加入20g NaOH, 4ml甲醒,双蒸水定容至1L。
所述步骤二中的氯仿异戊醇溶液为氯仿和异戊醇按体积比24:1混匀制成。
如图2、图3所示，通过采用本发明方法的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带丰富，将SSAP分子标记技术成功的应用在牡丹上。
权利要求
1.一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、设计引物 设计Mse I和EcoR I接头引物、预扩增PCR引物、接头选择性扩增PCR引物、逆转座子PCR引物，引物序列走向为5 端到3 端: 1)接头引物 Mse I接头引物 Mse 15 端接头引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接头引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接头引物 EcoRI5 端接头引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI3 端接头引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC 2)预扩增引物 Mse I 预扩增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoR I 预扩增引物:EzxOO GACTGCGTACCAATTCA 3)选择性扩增引物 接头选择扩增引物:Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGT CCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆转座子引物: PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步骤二、牡丹基因组DNA的提取 选取牡丹新鲜的嫩叶，捣碎，利用CTAB法提取基因组DNA: O将牡丹幼嫩叶片放入研钵内，加入10(Tl30mg聚乙烯吡咯烷酮，再加入液氮迅速研磨至粉末状，转移研磨液至预先冷却、洁净的1.5ml离心管中，备用； 2)向上述离心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在温度为65°C的条件下水浴lh，水浴过程中，每隔5min颠倒混匀一次；3)待离心管冷却至室温后，取出离心管，向离心管中加入0.75ml氯仿异戊醇溶液，颠倒混勻IOmin ； 4)将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin； 5)将离心管内的上清溶液转移至另一1.5ml离心管内，再加入与上清溶液等体积的氯仿异戍醇溶液，颠倒混勻IOmin ； 6)将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心IOmin； 7)将上清溶液转移至另一离心管中，加入离心管容积2/3的预冷无水乙醇，迅速颠倒混匀，然后放入温度为-20°C的冰箱内Ih ； 8)用枪头挑出白色絮状物转移至另一离心管中，加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin ； 9)倒掉离心管内上清溶液，再加入质量浓度为75%的乙醇浸泡IOmin； 10)倒掉上清溶液，室温下自然风干； 11)加入5(T500mlTE溶液，放入温度为_20°C的冰箱内备用； 步骤三、牡丹基因组DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A试剂盒对提取的牡丹基因组DNA进行处理:取牡丹基因组DNA原液稀释至50ng/μ I后加入I μ I RNase A混匀，瞬时离心后在温度为37°C的条件下水浴lh，之后转入温度为-20°C的条件下保存，备用； 步骤四、牡丹基因组DNA的酶切 利用Takara酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对步骤三中制备的牡丹基因组DNA进行酶切:20μ I的酶切反应液成分为:质量浓度为50ng/l.! I的基因组 DNA5 10μ 1，稀释 10 倍后的 NEBuffer4 2 μ 1，稀释 100 倍后的 BSA 0.2 μ I, Mse I 酶0.5 μ IjEcoR I酶0.5 μ 1，余量为双蒸水；具体步骤为: 1)将限制性内切酶从冰箱内取出放置冰上； 2)将DNA、NEBuffer4、BSA和双蒸水按上述量混匀，在温度为4°C的条件下放置30min； 3)加入限制性内切酶，混匀，瞬时离心； 4)在温度为37°C的条件下水浴f3h，之后放入温度为4°C的冰箱内备用； 步骤五、接头的准备 1)将Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接头引物稀释到 50mmol/l ； 2)上述四种接头引物各取25μ I两两配对混合均匀； 3)将配对混合均匀后的接头引物放到PCR中，先在温度为94°C的条件下反应lmin，然后在温度为36°C的条件下反应5min ； 4)室温下慢慢冷却，最后合成25μ M的接头引物Mse接头和EcoR接头； 步骤六、酶切产物和接头的连接 利用Takara Τ4 DNA Ligase连接试剂盒进行连接 1)在微量PCR离心管内配制25μ I PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8μ 1，步骤五中的Mse接头引物和EcoR接头引物各2.5μ 1，T4 DNA连接酶I μ 1，稀释10倍后的Ligation Buffer2.5 μ I,余量用双蒸水补齐至25 μ I ； 2)用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保存，备用; 步骤七、连接产物的预扩增1)将预扩增引物MzxOO和EzxOO稀释至20μ M后备用； 2)在微量PCR离心管配制25μ I PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ 1，稀释10倍后的 Buffer 2.5 μ I, Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，MzxOO 和 EzxOO 两种预扩增引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ 1，余量用双蒸水补齐至25 μ I ; 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C变性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36个循环，72°C延伸lOmin，得到PCR产物； 4)PCR扩增产物稀释20 40倍，备用； 步骤八、选择性扩增反应 1)将选择性扩增引物和逆转座子引物稀释到20μπιΟ1/1后备用； 2)在200μ I的PCR离心管内配制25 μ I PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5 10 μ 1，稀释10倍后的Buffer2.5μ l，Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，选择性扩增引物和逆转座子引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用双蒸水补齐至25 μ I ; 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5min, 94°C变性30s, 68°C退火30s,采用touchdown,每个循环降0.7 V, 72°C延伸Imin 12个循环，然后再94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸Imin 23个循环，最后72°C 延伸 5min ； 步骤九、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1)将电泳所使用的长、短玻璃板用水清洗后风干； 2)用双蒸水清洗后风干，重复3次，每次间隔3min； 3)用质量浓度为95%的酒精清洗后风干，重复3次，每次间隔3min； 4)取Iml反娃化液和2μ I反娃化剂均匀混合后涂在长玻璃板上,室温下放置5min后用质量浓度为95%酒精擦洗3次，每次间隔5min ； 5)取Iml剥离硅烷均匀涂于短玻璃板上，室温下放置5min后用质量浓度为95%的酒精擦洗3次,每次间隔5min ； 6)将两块J L玻璃板固定在一起，擦洗面向内，且两玻璃板不接触，用透明胶对长玻璃板和短玻璃板封边，夹夹子，之后以10°的倾斜角放于平稳实验台面上； 7)室温下放置3 4分钟后倒入胶液，插入梳子，室温下凝胶4 6h； 8)去夹子，撕掉透明胶带，将玻璃板外部冲洗干净，拔去梳子，立即冲洗拔去梳子后的点样孔； 9)预电泳:将玻璃板固定于电泳槽上，上下槽各加入稀释I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的条件下，电泳 15 30min ； 10)在扩增产物中加入1/10体积溴酚蓝，取4μI上样，在恒定功率为80W的条件下电泳2 4h，待溴酚蓝跑至胶板高度的3/4处后停止电泳； 11)漂洗:将玻璃板放入2L双蒸水中漂洗3次； 12)固定和银染:加入染色固定液进行银染和固定20min，双蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法为:加入150ml无水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸银,双蒸水定容至1.5L ； 13)显影:加入显影液进行显影8min，用双蒸水漂洗3次。
2.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，其特征在于，所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA, Nacl和水组成，其中100ml CTAB溶液按体积比取IOmllmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。
3.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法,其特征在于，所述步骤二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中200mlTE溶液按体积比取2ml Imol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法,其特征在于，所述步骤九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和双蒸水组成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸27.5g，0.5 mol/1的EDTA 20ml，双蒸水定容至IL0
5.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法,其特征在于，所述步骤九中的胶液配制方法为:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀释5倍后的TBE 50ml，双蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 μ I 10%水溶液的过硫酸铵和40 μ I Temed0
6.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，其特征在于，所述显影液的配制方法为:加入20g NaOH，4ml甲醒，双蒸水定容至1L。
7.根据权利要求1所述的一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，其特征在于，所述步骤二中的氯仿异戊醇溶液为氯仿和异戊醇按体积比24:1混匀制成。
全文摘要
一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，包括设计引物、牡丹基因组DNA的提取、牡丹基因组DNA酶切、接头的准备、酶切产物和接头的连接、连接产物的预扩增、选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等步骤。本发明通过设计牡丹属逆转座子LTR序列引物，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带丰富，和应用其他物种上的LTR引物相比，本引物可直接用于牡丹种属之间多态性的分析，更具有高效性和实用性，在本发明中选择性扩增PCR体系得到优化，更适合牡丹属SSAP分子标记的扩增，改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，将银染中固定和染色步骤合二为一，进一步提高了SSAP分子标记在牡丹属上应用的效率。
文档编号C12Q1/68GK103184290SQ201310107900
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者侯小改, 郭大龙, 张曦, 宋程威, 刘素云, 赵威, 马慧丽 申请人:河南科技大学