检测和分析艰难梭菌菌株的组合物和试剂盒及用该组合物和试剂盒检测艰难梭菌菌株的方法
【专利摘要】一种用于检测艰难梭菌(Clostridium?difficile)的组合物和试剂盒，该组合物包括用于检测艰难梭菌菌株的引物套组，和一种通过使用该组合物和试剂盒来检测艰难梭菌的方法。依照该方法，可以在短时间内以高准确度和灵敏度自样品检测出艰难梭菌菌株。
【专利说明】检测和分析艰难梭菌菌株的组合物和试剂盒及用该组合物和试剂盒检测艰难梭菌菌株的方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年6月8日提交给韩国知识产权局的韩国专利申请N0.10-2012-0061671的权益，通过引用将其公开内容完整收入本文。
【技术领域】
[0003]本公开内容涉及包括,用于检测艰难梭菌(Clostridium difficile)菌株或有毒艰难梭菌菌株的引物套组的组合物和试剂盒，及通过使用所述组合物或试剂盒来检测样品中的艰难梭菌菌株的方法。
【背景技术】
[0004]艰难梭菌是厌氧的、能形成孢子的梭菌属革兰氏阳性细菌的一个物种。
[0005]艰难梭菌是抗生素相关腹泻的最严重原因，而且能引起假膜性结肠炎和一种严重的结肠感染，常常导致抗生素对正常肠菌群的根除。在身体中天然驻留的艰难梭菌变得过度生长。该过度生长是有害的，因为该细菌释放能引起胃气胀、便秘、和腹泻(带有腹痛)的毒素。潜在的症状常常模拟一些流感样症状。停止病因性抗生素的治疗常常能治愈。
[0006]艰难梭菌感染在严重性上可以是从无症状到严重和危及生命的范围，尤其是在老年人中。人们最通常在医院、疗养院、或收容所(institutions)中被感染，不过社区中、门诊环境中的艰难梭菌感染也越来越多。获得艰难梭菌的比例在住院长至2周的患者中估计为13%，而在住院长过4周的患者中估计为50%。艰难梭菌结肠炎的频率和严重性仍然较高，而且似乎与死亡率升高有关。早期干预和攻击性管理是恢复的关键因素。
[0007]艰难梭菌的毒力因子是毒素A、毒素B、一种二元毒素、和一种高毒毒素。毒素A( —种肠毒素)由tcdA基因编码。毒素B (—种肠毒素)由tcdB基因编码。二元毒素由cdtA和cdtB基因编码，而且尚未发现它的毒力机制。高毒毒素涉及有毒NAP1/BI/027菌株，而且是由A117tcdC SNP(单核苷酸多态性)引起的。2005年报告了一种新的、高度有毒的艰难梭菌菌株的出现，它对氟喹诺酮抗生素，诸如Cipro(环丙沙星(ciprofloxacin))和Levaquin(左氧氟沙星(Ievofloxacin))有抗性,据说在北美洲引起地理性分散突发。
[0008]在将这些毒力基因用于分子诊断时，存在基因变异所致错误发生的可能性和变异所致假阳性测定的可能性。如此，需要通过利用编码在各种艰难梭菌菌株中普遍表达的蛋白质的基因来检测艰难梭菌。
[0009]另外，有毒艰难梭菌经由它的孢子来诱导传染性感染，带有有毒菌株的患者需要隔离。因此，需要通过在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株来实施准确且快速的诊断。
[0010]因此，仍然需要开发通过利用以较小变异在各种艰难梭菌菌株中普遍表达的基因来初步检测艰难梭菌的方法、在短时间内以高准确度和灵敏度自检测到的艰难梭菌菌株检测有毒艰难梭菌菌株的方法、及诊断它们的方法。
[0011]发明概述[0012]本发明提供了用于检测艰难梭菌菌株的组合物，其包括检测艰难梭菌菌株的引物套组。
[0013]本发明提供了用于检测艰难梭菌菌株的试剂盒，其包括检测艰难梭菌菌株的引物套组。
[0014]本发明提供了用于检测艰难梭菌菌株的方法，其通过使用检测艰难梭菌菌株的引物套组来进行。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]根据下面实施方案的描述，结合附图，这些和/或其它方面会变得明白和更加容易领会，在附图中:
[0016]图1图示曲线图和图像，显示依照例示性实施方案，通过使用具有序列SEQ ID NO:I至3、检测gluD基因的引物(见(a)和(c))及通过使用具有序列SEQID NO:4至6、检测gluD基因的引物(见(b)和(d))来检测艰难梭菌菌株的结果；在图1(c)中，最左栏为分子量标志，对应于IO3列的数值23.25表不该泳带的强度与相应标志带的强度相比的相对量化值；图1(d)中的数值的含义同图1(c)；
[0017]图2和3是曲线图和图像,显不依照例不性实施方案,通过使用具有序列SEQ IDNO:7至9、检测靶tcdA基因的引物(见各自(a))和通过使用具有序列SEQ ID N0:10和
11、检测参照tcdA基因的引物(见各自(b))和具有序列SEQID NO:12或13的探针来检测艰难梭菌菌株的结果；图3中的数值的含义同图1(c)；
[0018]图4和5是曲线图和图像，显示依照例示性实施方案，通过使用具有序列SEQ IDNO:14至16、检测靶tcdB基因的引物(见各自(a))和通过使用检测参照tcdB基因、具有序列SEQ ID NO: 17或18的正向引物和具有序列SEQ ID NO: 19或20的反向引物(见各自(b))，和具有序列SEQ ID NO:21的探针来检测艰难梭菌菌株的结果；图5中的数值的含义同图1(c)；
[0019]图6和7是曲线图和图像,显不依照例不性实施方案,通过使用具有序列SEQ IDNO:22至24、检测靶cdtA基因的引物(见各自(a))和通过使用具有序列SEQ ID N0:25至
27、检测靶cdtB基因的引物(见各自(b))来检测艰难梭菌菌株的结果；图7中的数值的含义同图1(c);而
[0020]图8和9是曲线图和图像，显示通过使用不含八1175册的野生型化(1(:基因(见各自(a))和通过使用用于含有Λ 117SNP的突变型tcdC基因、具有序列SEQ ID NO:28至30的引物(见各自(b))来检测艰难梭菌菌株的结果，由此确认了能特异性检测含有△ 117SNP的tcdC基因；图9中的数值的含义同图1(c)。
[0021]发明详述
[0022]现在会详细提及各实施方案，附图中图示了其实施例，其中全文中同样的基准值(reference numeral)指同样的要件(element)。在这点上,本发明实施方案可以具有不同形式，而且不应解释为限于本文所列描述。因而，下文通过提及附图来描述各实施方案仅仅是为了解释本说明书的各方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列举项的任何和所有组合。
[0023]依照本发明的一个实施方案，用于检测艰难梭菌菌株的组合物包括至少一种引物套组，其选自:包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和选自核苷酸序列SEQ ID N0:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组。该组合物可以进一步包括一种探针，该探针包括核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。例如,具有序列SEQ ID NO:1至6的靶核酸可以是gluD(谷氨酸脱氢酶；OTH)基因。由gluD基因编码的gluD蛋白(它是一种在艰难梭菌中表达的代谢酶)在无毒艰难梭菌菌株和有毒艰难梭菌菌株二者中表达。如此，可以通过检测gluD基因以高灵敏度检测各种艰难梭菌菌株，不管艰难梭菌是有毒的还是无毒的。另外，通过检测gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因变异所致的错误发生的可能性或假阳性测定的可能性。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至150bp的范围，这可以使得能够在短时间内特异性检测艰难梭菌。
[0024]该组合物可以进一步包括一种引物套组，其包括选自核苷酸序列SEQ ID N0:14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10个连续核苷酸。另外，该组合物可以进一步包括一种探针，其包括核苷酸序列SEQ ID N0:16。例如，具有序列SEQID NO: 14至16的靶核酸可以是艰难梭菌毒素B (tcdB)基因。由tcdB基因编码的tcdB蛋白诱导艰难梭菌的毒力。虽然tcdB基因在各种艰难梭菌菌株间具有较少的保守区，但是可以通过使用设计成对tcdB基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌菌株。此外,通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株。
[0025]该组合物可以进一步包括一种引物套组，其包括选自核苷酸序列SEQ ID N0:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10个连续核苷酸。另外，该组合物可以进一步包括一种探针，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:30。例如，具有序列SEQ IDNO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117单核苷酸独特型(SNP)的tcdC基因。tcdC基因第117位处的SNP是一种在高毒艰难梭菌菌株中确认的有毒基因。为了检测含有A117SNP的tcdC基因，可以使用能够在不使用别的引物或探针的情况中进行检测的等位基因特异性引物套组，由此可以以高灵敏度检`测`高`毒艰难梭菌菌株。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测高毒艰难梭菌菌株。
[0026]该组合物可以进一步包括至少一种引物套组，其选自:包括选自核苷酸序列SEQID NO:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。另外，该组合物可以进一步包括一种探针，其包括至少一种选自下组的核苷酸序列:序列SEQ ID N0:9，24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是艰难梭菌毒素A(tcdA)基因。由tcdA基因编码的tcdA蛋白诱导艰难梭菌的毒力。可以使用设计成对tcdA基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌菌株。例如，具有序列SEQ ID N0:22至24的靶核酸可以是编码一种二元毒素的cdtA基因。可以使用独特设计用于cdtA基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:25至27的靶核酸可以是cdtB基因。可以使用独特设计用于cdtB基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株。
[0027]另外，探针可以用荧光共振能量转移(FRET)对来标记。还有，例如，探针可以用至少一种选自下组的荧光标记物在其5 '端标记:FAM?，VIC?, TET，JOE?, HEX(六氯荧光素)，CY(花菁)3，CY(花菁)5，ROX?, RED610?, TEXAS RED(磺基罗丹明101磺酰氯)，RED670?，和NED?，或者探针可以用至少一种选自下组的猝灭剂在其3'端标记:6-TAMRA(6-羧基-四甲基罗丹明)，BHQ (Black Hole Quencher)-1，2，3，和结合分子沟的非突光粹灭剂(Minor Groove Binder nonf luorescent quencher, MGBNFQ)。
[0028]在检测艰难梭菌菌株时，引物套组可以利用其独特设计的序列来遏制自身二聚化，引物套组的交叉反应性可以不发生，使得检测效率和灵敏度得到改善，而且引物套组可以在多种基因的至少一种组合中检测艰难梭菌菌株以改善特异性。另外，为每一种基因生成的扩增子的尺寸等于或少于100bp，并因此，可以在短时间内特异性扩增靶基因。可以在至少一个空间中同时实时检测多种基因的至少一种组合，由此可以使检测时间最小化。
[0029]如本文中使用的，术语“核苷酸序列”指双链DNA或cDNA，或者单链DNA或RNA。除非本文中另有说明，核苷酸序列可以意图包括核苷酸类似物。核苷酸序列可以使用本领域已知的适宜方法(例如化学合成)来合成和生成。另外，可以使用商品化核苷酸序列。
[0030]在一些实施方案中，如本文中使用的，术语“核苷酸序列”可以意图指示术语“核酸序列”、“引物”、“寡核苷酸”、或“多核苷酸”。
[0031]核苷酸可以使用本领域已知的适宜方法(例如化学合成)来合成和生成。还有，可以使用商品化核苷酸。
[0032]如本文中使用的，术语 “引物”指能够在适宜条件下(例如在有聚合酶和四种不同核苷三磷酸时)在合适的缓冲液中、且在合适的温度中作为模板依赖性DNA合成的起点起作用的单链寡核苷酸。
[0033]引物的适宜长度可以依温度和引物的用途而改变，但是通常为15至35个核苷酸。相对较短的引物可能通常需要相对较低的温度来与模板形成充分稳定的杂交复合物。如本文中使用的，术语“正向引物”和“反向引物”指分别连接至模板中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的某个区域的3’端和5’端的引物。
[0034]引物可以与模板中的一个区域杂交或与其退火以形成双链结构。适合于核酸杂交以形成此类双链结构的条件是本领域公知的。
[0035]如本文中使用的，术语“探针”指天然或修饰的单体或连接体(包括脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸)的线性寡聚体，其能够与靶多核苷酸序列杂交。例如，探针可以是单链以改善杂交效率。探针可以是与作为模板的多核苷酸序列完全互补的序列。然而，在一个实施方案中，探针可以是基本上互补的序列，只要它不干扰特异性杂交。
[0036]另外，探针可以用FRET对来标记。还有，例如，探针可以用至少一种选自下组的荧光标记物在其 5’ 端标记:FAM, VIC, TET，JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED,RED670，和NED，或者探针可以用至少一种选自下组的猝灭剂在其3’端标记:6_TAMRA，BHQ-1，2，3，和 MGBNFQo[0037]如本文中使用的，术语“基本上互补的序列”指能够在本领域已知的严格条件下与作为模板的多核苷酸杂交的序列。严格条件可以通过调整温度、离子强度(缓冲剂浓度)、诸如有机溶剂等化合物的存在、等等来确定，而且可以依要杂交的序列而有不同。例如，严格条件可以是下述条件:a)于50° C并用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠清洗山)在杂交缓冲液(包括50%甲酰胺，2xSSC和10%硫酸葡聚糖)中于55° C杂交，然后用含EDTA的0.1xSSC于55° C清洗。
[0038]如本文中使用的，术语“靶DNA”、“靶RNA”、“靶核酸”、或“靶核酸序列”指作为DNA扩增靶的核酸。靶核酸序列可以在PCR或逆转录(RT)-PCR中充当扩增的模板。靶核酸序列可以包括天然分子和合成分子。例如，靶核酸可以是基因组DNA或基因组RNA。[0039]组合物可以是用于扩增靶核酸的组合物。扩增方法可以是本领域已知的用于核酸扩增的方法。扩增可以是例如DNA扩增或RNA扩增。扩增方法可以是需要热循环的扩增方法或等温扩增方法。扩增方法可以包括PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、等等。还有，扩增方法可以包括RNA扩增方法。扩增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，术语“扩增”可以意图表示增加靶核酸序列或与其互补的序列的拷贝数目的过程。如本文中使用的，术语“PCR(聚合酶链式反应)”指用聚合酶从特异性结合靶核酸的引物对扩增靶核酸的方法。
[0040]另外，组合物可以进一步包括扩增靶核酸所需的已知材料。例如，组合物可以进一步包括核酸聚合酶、酶活性所需的缓冲液、辅因子、和/或底物。核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、或其组合。如本文中使用的，术语“逆转录”指从RNA模板合成DNA链，其中DNA链与RNA的序列互补。核酸聚合酶可以具有链置换活性。例如，核酸聚合酶可以是至少一种从逆转录病毒(例如HIV、MMLVjP AMV)衍生的逆转录酶。核酸聚合酶可以没有3' ->5,外切核酸酶活性。组合物可以包括RT-PCR或PCR扩增所需的材料。
[0041]依照本发明的另一个实施方案，用于检测艰难梭菌菌株的试剂盒包括至少一种引物套组，其选自:包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组。该试剂盒可以进一步包括一种探针，其具有核苷酸序列SEQ ID N0:3或6。例如，具有序列SEQ ID N0:1至6的靶核酸可以是gluD基因。由gluD基因编码的gluD蛋白存在于艰难梭菌的细胞表面上，而且可以通过检测gluD基因以高灵敏度检测各种艰难梭菌菌株。另外，通过检测gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因变异所致的错误发生的可能性或假阳性测定的可能性。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测艰难梭菌。
[0042]该试剂盒可以进一步包括一种引物套组，其包括选自核苷酸序列SEQ ID N0:14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10个连续核苷酸。还有，该试剂盒可以进一步包括一种探针，其具有核苷酸序列SEQ ID NO: 16。例如，具有序列SEQ IDNO: 14至16的靶核酸可以是tcdB基因。由tcdB基因编码的tcdB蛋白诱导艰难梭菌的毒力。虽然tcdB基因在各种艰难梭菌菌株间不太保守，但是可以通过使用设计成对tcdB基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌菌株。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株。
[0043]该试剂盒可以进一步包括一种引物套组，其包括选自核苷酸序列SEQ ID N0:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10个连续核苷酸。另外，该试剂盒可以进一步包括一种探针，其具有核苷酸序列SEQ ID NO:30。例如，具有序列SEQ IDNO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117SNP的tcdC基因。tcdC基因第117位处的SNP是一种在高毒艰难梭菌菌株中确认的有毒基因。为了检测含有A117SNP的tcdC基因，可以使用能够在不使用别的引物或探针的情况中进行检测的等位基因特异性引物套组，由此可以以高灵敏度检测具有高毒力的艰难梭菌。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测高毒艰难梭菌菌株。
[0044]该试剂盒可以进一步包括至少一种引物套组，其选自:包括选自核苷酸序列SEQID NO:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。另外，该试剂盒可以进一步包括一种探针，其具有至少一种选自下组的核苷酸序列:序列SEQ ID NO:9，24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是tcdA基因。由tcdA基因编码的tcdA蛋白诱导艰难梭菌的毒力。可以使用设计成对tcdA基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:22至24的靶核酸可以是编码一种二元毒素的cdtA基因。可以使用独特设计用于cdtA基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。例如，具有序列SEQ ID N0:25至27的靶核酸可以是编码一种二元毒素的cdtB基因。可以使用独特设计用于cdtB基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌。
[0045]试剂盒可以是用于`扩增靶核酸的试剂盒。扩增方法可以是本领域已知的用于核酸扩增的方法。扩增可以是例如DNA扩增或RNA扩增。扩增方法可以是需要热循环的扩增方法或等温扩增方法。扩增方法可以包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCA、等等。还有，扩增方法可以包括RNA扩增方法。扩增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，术语“扩增”可以意图表示增加靶核酸序列或与其互补的序列的拷贝数目的过程。如本文中使用的，术语“PCR”指用聚合酶从特异性结合靶核酸的引物对来扩增靶核酸的方法。
[0046]另外，试剂盒可以进一步包括扩增靶核酸所需的已知材料。例如，试剂盒可以进一步包括核酸聚合酶、酶活性所需的缓冲液、辅因子、和/或底物。核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、或其组合。如本文中使用的，术语“逆转录(RT)”指从RNA模板合成DNA链，其中DNA链与RNA的序列互补。核酸聚合酶可以具有链置换活性。例如，核酸聚合酶可以是至少一种从逆转录病毒(例如HIV、MMLVjPAMV)衍生的逆转录酶。核酸聚合酶可以没有3' ->5,外切核酸酶活性。试剂盒可以包括RT-PCR或PCR扩增所需的材料。另外，试剂盒可以进一步包括用于扩增靶核酸的用法手册。
[0047]依照本发明的另一个实施方案，实时检测样品中的艰难梭菌菌株的方法包括:使自样品获得的核酸序列与至少一种引物套组杂交，该引物套组选自:包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组；扩增靶核酸序列；并检测扩增的靶核酸序列。
[0048]另外，该方法可以进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包括核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。例如，具有序列SEQ ID NO:1至6的靶核酸可以是gluD基因。gluD基因编码存在于艰难梭菌的细胞表面上的gluD蛋白，并因此，可以通过检测gluD基因以高灵敏度检测各种艰难梭菌菌株。另外，通过检测gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因变异所致的错误发生的可能性或假阳性测定的可能性。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测艰难梭菌菌株。
[0049]该方法可以进一步包括使自样品获得的核酸序列与一种引物套组杂交，该引物套组包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ IDNO:15的至少10个连续核苷酸。另外，该方法可以进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包括核苷酸序列SEQ ID NO:160例如，具有序列SEQ ID N0:14至16的靶核酸可以是tcdB基因。由tcdB基因编码的tcdB蛋白诱导艰难梭菌的毒力。虽然tcdB基因在各种艰难梭菌菌株间不太保守，但是可以通过使用设计成对tcdB基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌菌株。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株。
[0050]该方法可以进一步包括使自样品获得的核酸序列与一种引物套组杂交，该引物套组包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ IDNO:29的至少10个连续核苷 酸。另外，该方法可以进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包括核苷酸序列SEQ ID N0:30。例如，具有序列SEQ ID NO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117SNP的tcdC基因。tcdC基因第117位处的SNP是一种在高毒艰难梭菌菌株中确认的有毒基因。为了检测含有AlHSNP的tcdC基因，可以使用能够在不使用别的引物或探针的情况中进行检测的等位基因特异性引物套组，由此可以以高灵敏度检测高毒艰难梭菌。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测高毒艰难梭菌菌株。
[0051]该方法可以进一步包括使自样品获得的核酸样品与至少一种引物套组杂交，该引物套组选自:包括选自核苷酸序列SEQ ID N0:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。另外，该方法可以进一步包括使扩增的核酸序列与一种探针杂交，该探针包括至少一种选自下组的核苷酸序列:序列SEQ ID N0:9,24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是tcdA基因。由tcdA基因编码的tcdA蛋白诱导艰难梭菌的毒力。可以使用设计成对tcdA基因具有改良灵敏度的引物套组以高灵敏度检测有毒艰难梭菌菌株。例如，具有序列SEQ ID NO:22至24的靶核酸可以是编码一种二元毒素的cdtA基因。可以使用独特设计用于cdtA基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:25至27的靶核酸可以是cdtB基因。可以使用独特设计用于cdtB基因的引物套组以高灵敏度检测具有二元毒力的艰难梭菌。此外，通过所述引物套组扩增的PCR产物的尺寸在40bp至IOObp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测有毒艰难梭菌菌株。
[0052]探针可以用可检测的标记物来标记，例如FRET对。另外，例如，探针可以用至少一种选自下组的荧光标记物在其Y端标记:FAM，VIC, TET, JOE, HEX, CY3，CY5，ROX, RED610，TEXAS RED，RED670，和NED，或者用至少一种选自下组的猝灭剂在其:V端标记:6_TAMRA，BHQ-1，2，3，和 MGBNFQ。
[0053]自样品获得的核酸序列可以是从排泄物(excrement)样品提取的基因组DNA或提取并经纯化的基因组DNA、用棉拭子收集的样品、体液、或组织切片。
[0054]在杂交方法中，本文中使用的术语“杂交”也可以称作术语“退火”。杂交指一条核酸和另一条核酸经由它们之间的碱基配对相互作用形成双链体、三链体、或多体结构的过程。碱基配对相互作用可以是通过Watson/Crick发生的碱基特异性碱基配对和Hoogsteen型氢键形成。另外，碱基堆积和疏水相互作用可以有助于双链体的稳定性。
[0055]该方法包括扩增靶核酸的序列。
[0056]靶核酸序列指作为DNA扩增靶的核酸。靶核酸序列可以在PCR或RT-PCR中充当扩增的模板。靶核酸序列可以包括天然分子和合成的分子。靶核酸可以是例如基因组DNA或基因组RNA。
[0057]扩增的靶核酸序列的尺寸可以在40bp至IOObp的范围中，并因此，使扩增和检测花费的时间最小化，由此可以快速检测艰难梭菌菌株。
[0058]扩增过程可以使用用于扩增核酸的已知方法来实施。扩增可以是例如DNA扩增或RNA扩增。扩增方法可以是需要热 循环的扩增方法或等温扩增方法。扩增方法可以包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCA、等等。还有，扩增方法可以包括RNA扩增方法。扩增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，术语“扩增”可以意图表示增加靶核酸序列或与其互补的序列的拷贝数目的过程。如本文中使用的，术语“PCR”指用聚合酶从特异性结合靶核酸的引物对来扩增靶核酸的方法。PCR是本领域公知的。例如，PCR可以通过使用下述过程来实施:1)处理样品以获得提取物从而分离靶DNA分子；2)对其添加含有酶、缓冲剂、dNTP、和寡核苷酸引物的水溶液；3)使反应混合物在两至三种温度之间热循环，例如90° C至96。C、37。C至65。C、和72。C ;并4)检测扩增的DNA。PCR可以在聚丙烯管、96孔板、或基于硅的PCR微芯片中实施。另外，扩增可以是多重PCR。本文中使用的术语“多重PCR”指在同一室中同时对多种引物套组进行PCR的反应。
[0059]该方法包括检测扩增的靶核酸序列。
[0060]检测过程指通过使用检测仪检测由可检测的标记物生成的信号的过程。例如，由可检测的标记物生成的信号可以选自下组:磁信号，电信号，发光信号(诸如荧光信号和拉曼(Raman)信号)，散射光信号，和放射性信号。在检测过程中，可以检测自标记靶序列的可检测的标记物生成的信号。例如，在检测过程中，可以通过检测FRET生成的信号来检测是否存在靶核酸。
[0061]在检测过程中，可以实时检测实时扩增的核酸序列。因此，可以在短时间内检测靶核酸序列。[0062]现在会提及下述实施例来更加完整地描述本发明的一个或多个实施方案。然而，提供这些实施例只是出于例示目的，并非意图限制本发明的方面。
[0063]实施例1
[0064]选择用于检测艰难梭菌的引物和探针及PCR评估
[0065]在将致病基因用于分子诊断时，存在基因变异所致错误发生的可能性和假阳性测定的可能性。如此，需要在分子诊断中利用具有较小变异且在各种艰难梭菌菌株中普遍表达的基因。
[0066]gluD(谷氨酸脱氢酶)是一种在各种艰难梭菌菌株中普遍表达且具有较小变异的蛋白质，并因此，可以通过gluD检测各种艰难梭菌菌株，不管艰难梭菌是无毒的还是有毒的。
[0067]因此，经由NCBI网站设计两种通过特异性扩增编码gluD蛋白的gluD基因用于检测艰难梭菌菌株的引物套组和一种用于实时PCR检测的探针，并分析和验证其交互作用。
[0068]引物套组和探针如下:
[0069]正向引物:5，-GCTGCATTAGAAAACTCTATAAC-3，(SEQID NO:1),
[0070]反向引物:5’-CAGCCTCTGGAGTAGTTG-3’ (SEQ ID NO:2)，和
[0071]探针:5’-CCATTAGCAGCTCACAA-3’(标有下划线的核酸表示LNA) (SEQ ID NO:3)。
[0072]或者，引物套组和探针如下:`[0073]正向引物:5'-GCTGAATCTATAAAAGCTAAATTAG-3' (SEQ ID NO:4)，
[0074]反向引物:5'-CCTCTTTCAGCAAATACTTC-3' (SEQ ID NO:5)，和
[0075]探针:5'-TAGTTGGTCCATTAGCAGCCTCACA-3' (SEQ ID NO:6)。
[0076]艰难梭菌的实时PCR分析结果显示于图1。
[0077]通过具有序列SEQ ID NO:1和2的引物套组PCR扩增的gluD基因的尺寸为97bp，而通过具有序列SEQ ID N0:4和5的引物套组PCR扩增的gluD基因的尺寸为85bp。使用所述引物套组检测到至少I个拷贝的gluD基因。因此，可以在短时间内以高灵敏度检测艰难梭菌菌株。
[0078]实施例2
[0079]用于检测艰难梭菌菌株毒素A的引物和探针的选择及PCR评估
[0080]可以通过能诱导艰难梭菌毒力的毒素A检测有毒艰难梭菌菌株。
[0081]经由NCBI网站设计一种用于特异性扩增tcdA(它是艰难梭菌毒素A的基因)的引物套组和一种用于实时PCR检测的探针，并分析和验证其交互作用。为实时PCR检测设计的引物套组和探针具有改良灵敏度。
[0082]引物套组和探针如下:
[0083]正向引物:5'-GCGGAGTATATTTAGATGTTG-3' (SEQ ID NO:7)，
[0084]反向引物:5'-ACGGTCTAGTCCAATAGA-3' (SEQ ID NO:8)，和
[0085]探针:5'-ATGCTTCCAGGTATTCACT-3' (SEQ ID NO:9)。
[0086]使用下述引物套组扩增参照tcdA(见 J Microbiol Methods83:59-65(2010)):
[0087]正向引物:5'-TTGTATGGATAGGTGGAGAAGTCAGT-3' (SEQ ID NO: 10)，反向引物:5' -AATATTATATTCTGCATTAATATCAGCCCAT-3' (SEQ ID NO: 11)，
[0088]探针1:5' -FAM-ATATTGCTCTTGAATACATAAA-NFQ-MGB-3' (SEQ ID NO: 12)，和[0089]探针 2:5' -FAM-TATTGTTCTTGAATACATAAAAC-NFQ-MGB-3' (SEQ ID NO: 13)。
[0090]艰难梭菌的实时PCR分析结果显示于图2和3。
[0091]通过具有序列SEQ ID NO:7和8的引物套组扩增的PCR产物的尺寸为92 bp。另外，与参照tcdA相比，使用具有序列SEQ ID NO:7和8的引物套组检测到至少一个拷贝的tcdA基因。因此，通过tcdA可以在短时间内以闻灵敏度检测具有毒力的艰难梭囷囷株。
[0092]实施例3
[0093]用于检测艰难梭菌毒素B的引物和探针的选择及PCR评估
[0094]可以通过能诱导艰难梭菌毒力的毒素B检测有毒艰难梭菌。
[0095]毒素B基因tcdB在各种艰难梭菌菌株不太保守。经由NCBI网站设计一种用于特异性扩增该tcdB的引物套组和一种用于实时PCR检测的探针，并分析和验证其交互作用。
[0096]为实时PCR检测设计的引物套组和探针具有改良灵敏度。
[0097]引物套组和探针如下:
[0098]正向引物:5，-GGTGGTATGTATTTAGATGTTGA-3，(SEQID NO:14)，
[0099]反向引物:5，-TCCACTGTTACTGAACTAGG-3，(SEQID NO:15)，和
[0100]探针:5，-CCAGGAATACAACCAGACT-3，(SEQID NO:16)。
[0101]使用下述引物套组扩增参照tcdB (见 J Microbiol Methods83:59-65(2010)):
[0102]正向引物:5，-GAAACAGGATGGACACCAGGTT-3，(SEQID NO:17)或5’-AAGAGGATGGACGCCAGGTT-3’ (SEQ ID NO: 18)，
[0103]反向引物:5’-ACGGTCTAACAGTTTTGTGCCA-3’ (SEQ ID NO:19)或 5’ -CTGCCCTTCATAATGATCTCTTATACG-3’ (SEQ ID NO:20)，和
[0104]探针:5，-FAM-AAGAAGCTTAGAAAATG-NFQ-MGB-3，(SEQID NO:21)。
[0105]艰难梭菌的实时PCR分析结果显不于图4和5。
[0106]通过具有序列SEQ ID NO:14和15的引物套组扩增的PCR产物的尺寸为89bp。
[0107]与参照tcdB相比，使用具有序列SEQ ID NO:14和15的引物套组检测到至少一个拷贝的tcdB基因。因此，通过tcdB可以在短时间内以高灵敏度检测具有毒力的艰难梭菌菌株。
[0108]实施例4
[0109]用于检测艰难梭菌二元毒素的引物和探针的选择及PCR评估
[0110]可以通过能诱导艰难梭菌毒力的二元毒素检测有毒艰难梭菌。
[0111]经由NCBI网站设计一种用于特异性扩增tcdA和tcdB (它们都是二元毒素基因)的引物套组，和一种用于实时PCR检测的探针，并分析和验证其交互作用。为实时PCR检测设计的引物套组和探针具有对于每一种基因的独特设计。
[0112]通过PCR扩增的cdtA和cdtB扩增子的尺寸分别为99bp和72bp。
[0113]用于cdtA基因的引物套组和探针如下:
[0114]正向引物:5'-GCATCTGTTGTAAGTAGTCTTG-3' (SEQ ID NO:22)，
[0115]反向引物:5'-AGGTGTTAATTTATTACTCCAATCATTA-3' (SEQ ID NO:23)，和
[0116]探针:5'-AATTTGCTTTACCCCAAGAGTCCCC-3' (SEQ ID NO:24)。
[0117]用于cdtB基因的引物套组和探针如下:
[0118]正向引物:5'-ACTCCCAAACAATGGATTA-3' (SEQ ID NO:25)，[0119]反向引物:5'-GGTGCCATTAATTTTAAATCTTTA-3' (SEQ ID NO:26)，和
[0120]探针:5'-AGTGCTCATCTGTGAAATAATATCCCA-3' (SEQ ID NO:27)。
[0121]艰难梭菌的实时PCR分析结果显示于图6和7。
[0122]通过PCR扩增的cdtA和cdtB产物的尺寸分别为99bp和72bp。通过各自的引物套组检测到至少一个拷贝的cdtA或cdtB基因。因此，通过所述二元毒素可以以高灵敏度检测具有毒力的艰难梭菌菌株。
[0123]实施例5
[0124]用于检测高毒艰难梭菌的引物和探针的选择及PCR评估
[0125]艰难梭菌的具有Δ 117SNP (单核苷酸多态性)的tcdC基因存在于对氟喹诺酮抗生素,诸如环丙沙星和左氧氟沙星有抗性的高毒菌株中。如此,可以通过具有A117SNP的tcdC基因检测高毒艰难梭菌。
[0126]为了检测诱导高毒力的艰难梭菌，经由NCBI网站设计一种用于特异性扩增含有Δ 117SNP的tcdC基因的引物套组和一种用于实时PCR检测的探针，并分析和验证其交互作用。
[0127]用于实时PCR检测的引物套组和探针是等位基因特异性设计的，使得可以在不使用别的引物和探针的情况中使用具有等位基因特异性序列的引物套组检测高毒艰难梭菌。
[0128]引物套组和探针如下:
[0129]正向引物:5'-GCACAAAGGATATTGCTCTA-3' (SEQ ID NO:28)，
[0130]反向引物:5'-CCTCATGGTCTTCAGAAC-3' (SEQ ID NO:29)，和
[0131]探针:5'-TGGCATTTATTTTGGTGTGTTTTTTG-3' (SEQ ID NO:30)。
[0132]高毒艰难梭菌的实时PCR分析结果显示于图8和9。
[0133]通过PCR扩增的含有Λ 117SNP的tcdC扩增子的尺寸为86bp。与不含Λ 117SNP的野生型tcdC相比，使用具有序列SEQ ID NO:28和29的引物套组可以特异性检测到至少一个拷贝的含有八1175册的化(1(:。因此，可以在短时间内以高灵敏度检测高毒艰难梭菌菌株。
[0134]实施例6
[0135]用于检测艰难梭菌的多重PCR实施
[0136]通过用至少一种引物套组检测至少一种靶核酸序列，按照下表1所示的组合来实施多重PCR。
[0137]〈表1>
[0138]
【权利要求】
1.一种用于检测艰难梭菌(Clostridium difficile)菌株的组合物,该组合物包含至少一种引物套组，其选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID N0:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组。
2.权利要求1的组合物，进一步包含一种引物套组，其包含选自核苷酸序列SEQIDNO:14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10个连续核苷酸。
3.权利要求1的组合物，进一步包含一种引物套组，其包含选自核苷酸序列SEQIDNO:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10个连续核苷酸。
4.权利要求1的组合物，进一步包含至少一种引物套组，其选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQ IDNO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。
5.权利要求1的组合物，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID NO:3或6。
6.权利要求2的组合物，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID NO:160
7.权利要求3的组合物，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID NO:30o
8.权利要求4的组合物，进一步包含一种探针，其包含至少一种选自下组的核苷酸序列:序歹Ij SEQ ID NO:9，24，和 27。`
9.一种用于检测艰难梭菌菌株的试剂盒，该试剂盒包含至少一种引物套组，其选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组。
10.权利要求9的试剂盒，进一步包含一种引物套组，其包含选自核苷酸序列SEQIDNO:14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10个连续核苷酸。
11.权利要求9的试剂盒，进一步包含一种引物套组，其包含选自核苷酸序列SEQIDNO:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10个连续核苷酸。
12.权利要求9的试剂盒，进一步包含至少一种引物套组，其选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包括选自核苷酸序列SEQID NO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。
13.权利要求9的试剂盒，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID N0:3或6。
14.权利要求10的试剂盒，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID NO:160
15.权利要求11的试剂盒，进一步包含一种探针，其包含核苷酸序列SEQID NO:30o
16.权利要求12的试剂盒，进一步包含一种探针，其包含至少一种选自下组的核苷酸序列:序列 SEQ ID NO:9，24，和 27。
17.一种检测样品中的艰难梭菌菌株的方法，该方法包括: 使自样品获得的核酸序列与至少一种引物套组杂交，该引物套组选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的引物套组； 扩增靶核酸序列；并 检测扩增的靶核酸序列。
18.权利要求17的方法，进一步包括使自样品获得的核酸序列与一种引物套组杂交，该引物套组包含选自核苷酸序列SEQ ID NO: 14的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10个连续核苷酸。
19.权利要求17的方法，进一步包括使自样品获得的核酸序列与一种引物套组杂交，该引物套组包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:28的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10个连续核苷酸。
20.权利要求17的方法，进一步包括使自样品获得的核酸序列与至少一种引物套组杂交，该引物套组选自:包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10个连续核苷酸的引物套组；包含选自核苷酸序列SEQ IDNO:22的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10个连续核苷酸的引物套组；和包含选自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10个连续核苷酸和选自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10个连续核苷酸的引物套组。
21.权利要求17的方法，进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。
22.权利要求18的方法，进一`步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包含核苷酸序列SEQ ID NO:16o
23.权利要求19的方法，进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包含核苷酸序列SEQ ID NO:30ο
24.权利要求20的方法，进一步包括使扩增的靶核酸序列与一种探针杂交，该探针包含至少一种选自下组的核苷酸序列:序列SEQ ID NO:9，24，和27。
25.权利要求17的方法，其中所述样品包括粪便样品、用棉拭子收集的样品、体液、或组织切片。
26.权利要求17的方法，其中通过多重PCR来实施扩增。
27.权利要求17的方法，其中通过该引物套组扩增的靶核酸序列的尺寸为40bp至IOObp的范围。
28.权利要求17的方法，其中实时实施检测。
【文档编号】C12N15/11GK103484532SQ201310108285
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】郑善玉, 金俊镐, 李树官, 黄奎渊, 严泰喜 申请人:三星电子株式会社