专利名称：一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种多能性干细胞的诱导方法，具体地说是利用大型实验动物克隆化细胞为靶细胞进行多能性干细胞的诱导、体外培养条件优化及功能验证，最终获得高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞，属于动物资源学和细胞生物学交叉学科和领域。
背景技术：
随着医学生物科学的突飞猛进发展，认识到公害问题不仅已成为粮食、人口、老年人等的重大社会问题，而且还涉及到地球上生活着的动物生存问题，例如产业公害、食品公害、药品毒性等，均直接影响人体健康，对这些问题的研究，最终必然要通过动物实验(包括动物疾病模型的开发等)来阐明解决。因此，实验动物科学，特别是实验动物的重要性愈来愈被人们所认识，它已被认为是动物追求幸福生活的支柱，故实验动物科学亦被称之为生命科学。为此，先进国家对实验动物科学的发展，均给给予高度的重视，其投入的经济物资和技术力量，几乎可同发展原子能科学相提并论，其重要意义可想而知。动物细胞在体外的生存周期是有限的，正常组织来源的体细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂，但经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡。这无疑又局限了其在生物技术和临床研究方面的应用。在实际操作中对于相同样本反复采集也是不可能的，一次性大量取样则更不人道。但是，在传统的方法中，研究的接力式进行和标本的暂时性的采集中存在的矛盾很难调和，所以建立和保存实验动物的多能性干细胞，可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究。多能性干细胞具有稳定的增殖特性和功能状态，能为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，已应用于生命科学研究的多个领域。在众多转化体外细胞使其永生化的方法技术中，我们常以采集样本方便，病毒转化永生化细胞率高，操作周期短的EB病`毒转化外周血B淋巴细胞建立永生细胞系，为保存实验动物基因，研究影响动物疾病基因的最合适方法。EB病毒转化实验动物外周血B淋巴细胞建立的永生细胞株让原本有一定寿命的动物细胞能够不间断地繁殖下去，使各个领域实验动物的基因得以永久的保存。永生细胞株在转化前后其细胞和分子遗传学是稳定的，但细胞株在长期传代的过程中遗传特征是否发生改变，是一个关系着科学研究中实验结果准确性的重要问题，也是我们继续研究的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:采用高活性、高纯度的大型实验动物克隆化细胞为靶细胞，该细胞具有以下特征:生长速度快，活率高，凋亡率低。大型实验动物多能性干细胞的诱导方法包括下述步骤:
(I)克隆化细胞培养:以悬浮细胞培养法为基础，转化与24孔板少量培养时采用全 RPM11640 培养基 A:78 % 基础 RPMI1640+20 % FBS(GIBC0 特级)+1 % 双抗 +1 %L-Giutamine+0.2%H印es (调节pH至7.0);永生细胞转入中瓶后使用全RPMI1640。培养基 B:73%基础 RPMI1640+15% FBS (BIOCHROM AG 优级)+1 %双抗+1 % L-Giutamine+0.2%Hepes (调解pH至7.0)。37.5°C、5% CO2培养体系对永生化细胞进行转化与培养。(2)多能性干细胞的诱导:三因子无饲养层体系诱导大型实验动物多能性干细胞。(3)多能性干细胞的培养体系优化:在培养体系中添加LIF和bFGF等因子及采用STO饲养层等对多能干细胞的培养体系进行优化。(4)多能性干细胞的鉴定:采用形态学观察、体外增值能力测定、碱性磷酸酶染色和免疫荧光鉴定大型实验动物多能干细胞。本发明的优点与效益:本 发明对传统的四因子诱导多能干细胞方法及培养液成分进行调整与改进，可以高效诱导出大型实验动物多能性干细胞，细胞质量与现有技术相比有大幅提高；改进培养条件后，大型实验动物多能性干细胞形态和生长速度没有发生变化，细胞质量稳定，且细胞传代生长稳定，与现有培养技术相比有显著提高，适合大规模培养。诱导方法的调整及培养方法的改进，大幅降低了成本。本发明在方法等各方面弥补了现有多能干细胞技术的不足，大型实验动物多能性干细胞的细胞活率及纯度的提升也使实验动物的基因得以永久的保存。由于大型实验动物为有别于其他动物的一类特殊群体，他们所特有的基因成了及其珍贵的遗传资源，使得人们在各领域内对大型实验动物的研究极少。本发明所述的高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究，为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，用于生命科学研究的多个领域，对我国生命科学的研究具有深远意义。下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
图1为0CT4慢病毒载体转染293T细胞；图2为S0X2慢病毒载体转染293T细胞；图3为C-MYC慢病毒载体转染293T细胞；图4为KLF4慢病毒载体转染293T细胞；图5为RTTA慢病毒载体转染293T细胞；图6为0CT4慢病毒滴度测定；图7为S0X2慢病毒滴度测定；图8为C-MYC慢病毒滴度测定；图9为KLF4慢病毒滴度测定；图10为RTTA慢病毒滴度测定；
图11为大型实验动物克隆化细胞；图12为诱导的大型实验动物多能干细胞；图13为大型实验动物多能干细胞碱性磷酸酶染色；图14为大型实验动物多能干细胞oct4免疫荧光鉴定图15为大型实验动物多能干细胞SOX2免疫荧光鉴定图16为大型实验动物多能干细胞nanog免疫荧光鉴定图17为大型实验动物多能干细胞SSEAl免疫荧光鉴定
具体实施例方式实施例中所用的主要仪器及试剂来源:大型实验动物主要是牛、羊的克隆化细胞来源:本实验室保存。(一 )主要仪器设备1、激光扫描共聚焦显微镜:尼康TE-2000-E ；2、细胞融合 仪:美国BTX ECM-20013、显微操作仪:日本尼康NT-88-V34、浮雕相差显微镜，Olympus IX-71 ;生物显微镜，Olympus CX31 ;倒置相差荧光显微镜:01ympus IX-71 ；5、_70°C超低温冰箱:美国 kelvinator ；6、电动移液器:德国Accu-jet ；7、颇尔超纯水器:Pall-pruelab_plus ；8、CO2 培养箱:Heraeus BB16UV ；9、液氮贮存器:四川东亚YES-50B-125F ；10、电泳仪:北京六一厂DYY-6C;11、电泳槽:北京六一厂DYC-24A:12、高性能无菌实验台:哈尔滨DL-CJ-2N ；13、低速离心机:CENTERIGUGETDL-40B ；( 二)主要试剂1、DMEM(Dulbecco， s modified eagle medium):2、载体 pEGEP_N3:Clontech ；3、膜蛋白酶(Trypsinl:250),吉姆萨(Giemsa): Amresco ；4、特级胎牛血清(Defined FBS):Hyclone ；5、台盼蓝(Trypan Blue), DMS0,秋水仙素(Colchicine), EDTA, Triton (曲拉通)X-100 >99%,TEMED，Bis (甲叉双丙烯酰胺)98%，过硫酸铵(Ammonium Persulfate)，PMS,NAD,喔唑蓝(Thiazolyl Blue),细胞松她素 B, Hoechst33342,离子霉素,6-DMAP:Sigma ；6、甘油分析纯华绿渊；7、Tris:Promega ；8、丙烯酰胺> 99% (Acr)，甘氨酸> 99% (Clycine) =NOVON ；9、脂质体 Lipofectin:Gibco 公司；成纤维细胞培养所用液体配制:
10、DMEM培养液:DMEM9.6g,溶于超纯水中，用NaHCO3约3.2g调节pH至7.2
7.4，加水定容至1L，用磁力搅拌器搅拌混匀，0.22 um滤膜过滤除菌，500ml/瓶分装，贮存
于 4。。。11、培养液:DMEM培养液中加入终浓度为10% (体积比)的FBS，0.22 u m滤膜过滤500ml/瓶分装，4 °C贮存。12、双抗贮存液:100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。13、I XPBS 缓冲液:NaC14.00g,KC10.10g，Na2HPO4 12H201.45g，KH2PO40.10g，加超纯水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4°C贮存。14,0.25% (质量体积比)胰蛋白酶溶液:1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml, pH为7.2 7.4，0.22 滤膜过滤分装，_20°C贮存。15、0.9% (质量比)生理盐水:0.45g NaCl溶于500ml超纯水，高压灭菌30min。16、细胞冻存液:将50ml DMSO加入450ml全培养液(含体积比15% FBS的全培养液)中，用0.22 ii m滤膜过滤IOOml/瓶分装，贮存于_20°C冰箱。微生物检测所用试剂:17、大豆胰蛋白胨:3g大豆胰蛋白胨，加IOOml超纯水，调pH至7.3，高压灭菌15 20min，分装到15 X 150mm的玻璃管中。18、麦芽汁:2g麦芽汁加IOOml超纯水,调pH至3 4,高压灭菌15 20min,分装到15X 150mm的玻璃管中。19、DAPI染液:超纯水配制lmg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5 lmg/ml。20、封片液:22.2ml0.1M 的柠檬酸，27.8ml0.2M 的 Na2HPO4 溶于 50ml 甘油中，NaOH调节pH至5.5，贮存于4°C。21、固定液:冰醋酸与甲醇以体积比1: 3的比例(现用现配)。染色体标本制备所用试剂:22、秋水仙素忙存液:10mg秋水仙素溶于IOml超纯水中。23、稀释液:超纯水将贮存液稀释10倍至终浓度为100 u g/ml。24、低渗KCl溶液:0.5g的KCl溶于IOOml超纯水。25、固定液:冰醋酸与甲醇按体积比1: 3的比例配制。26、Giemsa 染色液原液:将Ig Giemsa染粉倒入研钵,加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止,然后加甘油至33ml，放在56°C保温箱2h后，加入45ml甲醇搅拌均匀，棕色瓶中贮存备用。工作液:磷酸缓冲液将Giemsa原液稀释10倍至终浓度为IOml。27、磷酸缓冲液的配制:KH2P040.34g加入IOOml去离子水(用NaOH调pH6.8)脂质体转染 细胞所用试剂:28、质粒 DNA (DsRed 和 EGFP-N3)，脂质体 Lipofectamine，不含血清的 DMEM 培养液，含血清的DMEM培养液，pH7.4的PBS。同工酶分析所用试剂:29,0.9% (质量比)NaCl-0.06mmol EDTA 溶液:分别称取 0.9g NaCl 和 0.0223gEDTA溶于IOOml超纯水中即可。
30、DAPI染液:超纯水配制lmg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5 lmg/ml。实施例1大型实验动物克隆化细胞的培养(I)初代培养:以悬浮细胞培养法为基础，转化与24孔板少量培养时采用全 RPMI1640 培养基 A:78 % 基础 RPMI1640+20 % FBS(GIBC0 特级)+1 % 双抗 +1 %L-Giutamine+0.2 % Hepes (调节PH至7.0)；永生细胞转入中瓶后使用全RPMI1640培养基 B:73%基础 RPMI1640+15% FBS (BIOCHROM AG 优级)+1 %双抗+1 % L-Giutamine+0.2%Hepes (调解PH至7.0)。37.5°C、5% C02培养体系对永生化细胞进行转化与培养。(2)传代培养:弃除步骤(I)培养瓶内的培养液，用预热至37°C的PBS小心洗涤培养瓶内残留物2次，以去除残余的血清、脱落的组织块及死细胞。用胰蛋白酶消化后加入培养液6 IOml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37°C，5% CO2的培养箱中继续培养。(3)细胞冻存:A、换液:冻存前24h，弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6 10ml，继续培养24h ；B、消化:用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入培养液6 IOml终止反应；C、计数:用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集:IOOOrpm离心8min，去上清液，加入4°C预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬，用吸管轻轻吹打使细胞重悬，并尽量缩短冻存液与细胞在室中的存放时间(冻存液成分:10% DMS0+50%胎牛血清+40% DMEM)；E、分装:将细 胞分装入灭菌的冻存管中封口，标明日期、品种、细胞名称、培养代数；F、预冻:将冻存管装入程序降温盒中，放于4°C 20 30min，使DMSO充分渗透到细胞内，达到内外平衡，然后置于_70°C冰箱中预冻4h以上。G、冻存:提出冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。(4)细胞复苏:将冻存管从液氮中取出后迅速置入42°C水浴中，快速晃动Imin左右，将细胞移入加有培养液的培养瓶中吹打均匀，放置含37°C 5% CO2的培养箱中继续培养。实施例2大型实验动物多能性干细胞的诱导:采用三因子无饲养层体系对实施例1培养的大型实验动物克隆化细胞进行多能性干细胞的诱导，方法及结论如下。一、三因子慢病毒的制备方法:将含有三因子的慢病毒载体转染293T细胞，制备慢病毒。结论:如图1-5所示，三因子的转染效率均在50%以上，如图所示，慢病毒的滴度均在IO8以上，证明制备的三因子慢病毒均符合本实验要求。二、三因子慢病毒浸染大型实验动物克隆化细胞方法:将三因子慢病毒按10: I的比例浸染大型实验动物克隆化细胞48h，换多能干细胞培养液继续培养。设对照为:A.阳性对照:将四因子慢病毒按10: I的比例浸染大型实验动物克隆化细胞48h，换多能干细胞培养液继续培养。B.阴性对照:将不含因子慢病毒按10: I的比例浸染大型实验动物克隆化细胞48h，换多能干细胞培养液继续培养。结论:三因子可将大型实验动物克隆化细胞诱导为多能干细胞。实施例3大型实验动物多能性干细胞的培养体系优化:方法:在培养体系中添加LIF和bFGF等因子及采用STO饲养层等对多能干细胞的培养体系进行优化。结论:在培养体系中添加LIF和bFGF等因子可促进大型实验动物多能性干细胞的增值，采用STO饲养层可起到同样效果。实施例4大型实验动物多能性干细胞的鉴定:方法:采用形态学观察、体外增值能力测定、碱性磷酸酶染色和免疫荧光鉴定大型实验动物多能干细胞。结论:大型实验动物多能性干细胞体外增值能力强，碱性磷酸酶染色为阳性，多能性标记物免疫荧光鉴 定均为阳性。
权利要求
1.一种大型实验动物克隆化细胞诱导为多能性干细胞的方法。
2.如权利要求1所述方法，其主要特征是采用三因子无饲养层体系诱导大型实验动物多能性干细胞。本发明对传统的四因子诱导多能干细胞方法及培养液成分进行调整与改进，采用S0X2、C-MYC和KLF4慢病毒可以高效诱导出大型实验动物多能性干细胞，细胞质量与现有技术相比有大幅提闻。
3.如权利要求1所述方法，主要采用STO饲养层培养体系培养大型实验动物多能性干细胞。本发明利用小鼠STO细胞作为饲养层后，大型实验动物多能性干细胞形态和生长速度没有发生变化，细胞质 量稳定，且细胞传代生长稳定，与现有培养技术相比有显著提高，适合大规模培养，大幅降低了成本。
全文摘要
本发明利用大型实验动物克隆化细胞为靶细胞进行多能性干细胞的诱导、体外培养条件优化及功能验证，最终获得高增值力、高分化潜能的大型实验动物多能性干细胞，属于动物资源学和细胞生物学交叉学科和领域。本发明培养出的多能性干细胞无污染，细胞纯度高；细胞质量稳定，传代生长稳定，适合大规模培养。本发明涉及的大型实验动物多能性干细胞可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究，为生命科学研究提供性状恒定的研究对象，可作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，用于生命科学研究的多个领域，对我国生命科学的研究具有深远意义。
文档编号C12N15/867GK103160540SQ20131010891
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者胡鹏飞, 白春雨, 李向臣, 姜龙江, 李万哲, 刘春华, 关伟军 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 哈尔滨体育学院