一种高效快速测定bac末端序列的方法
【专利摘要】本发明提供了一种高效快速测定BAC末端序列的方法，所述方法包括如下步骤：（1）以超级池为单位，富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，制备成适合新一代测序平台所需的文库；（2）在新一代测序平台上进行测序；（3）通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆：利用序列比对，确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每个克隆的BAC末端序列。本发明所述方法不仅能快速得到全BAC文库中所有单个克隆的BAC末端序列，而且极大程度降低了BAC末端测序的成本和时间。
【专利说明】—种高效快速测定BAC末端序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种高效快速测定BAC末端序列的方法。
【背景技术】
[0002]基因组BAC (Bacterial Artificial Chromosome,细菌人工染色体)文库是含有某种生物体基因组随机片段的重组DNA克隆群体，它在构建物理图谱、基因图位克隆、基因结构分析等研究中具有重要作用。目前许多生物都有高覆盖度的BAC文库。为了方便管理，BAC文库被划分为多个超级池来储存，每个超级池由一定数目的96孔或384孔板组成；在每个超级池中，再将行向、列向和板面的BAC克隆混合，即得到行池、列池和板池。筛选克隆常用3D-PCR筛选系统，第一步是对超级池的DNA进行PCR扩增，找出含有阳性克隆的超级池；接下来对行池、列池和板池的DNA进行PCR扩增，得到克隆所在的行、列、板三个方向信息。由此，两步PCR就可以找到含有目的片段的BAC克隆。
[0003]BAC末端序列是指BAC克隆中插入片段的两端序列，能够迅速而精确的定位BAC在基因组上位置。BAC末端测序技术在全基因组测序中有着举足轻重的作用，它能够迅速而精确地进行序列拼装，也可以用来确定基因组序列结构的多态性，如倒置和易位。在许多基于新一代测序的动植物de novo基因组拼接中利用了 BAC末端序列的长程(约100_150kb)的位置关系，辅助基因组的拼接。在白菜基因组的de novo测序中，研究者利用BAC末端序列的信息将Scaffold N50从500kb提高到2Mb，显示了这一应用的潜力。
[0004]目前BAC末端测序都是基于Sanger技术的，与质粒或PCR产物的测序步骤相近，但成功率却比它们低得多 ，主要是由于难以获得大量高纯度的BAC DNA(500ng以上)，而且操作复杂、通量低、成本高。若以一个含10万个克隆的大基因组的BAC文库计算，每对BAC末端测序需要50元，则测出所有BAC末端序列需要10万X 50元/克隆=500万元，更别说所需要的时间。因此，发明一种快速低成本地测序BAC文库中所有BAC末端序列的方法是非常有必要的和有市场前景的。
[0005]除此之外，高效快速测定BAC末端序列的方法可以用于全基因组测序的组装工作中。近些年来，基于各种新一代测序平台的denovo基因组测序为我们提供了成千上万个物种的参考基因组序列，但短的序列读长增加了 de novo数据的组装难度，拼接后的contigN50 一般在15-40kb。为此，开发一种高效利用已有BAC文库中所有BAC末端序列来辅助基因组组装的方法，是非常有意义的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种高效快速测定BAC末端序列的方法，所述方法通过新一代测序平台大规模平行测定BAC文库中行池、列池和板池中所有的BAC末端序列，再通过生物信息学的方法将BAC末端序列回归到单个克隆。
[0007]本发明所述的高效快速测定BAC末端序列的方法包括如下步骤:
[0008](I)以超级池为单位，富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，制备成适合新一代测序平台所需的文库；
[0009](2)在新一代测序平台上进行测序；
[0010](3)通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆:利用序列比对，确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每个克隆的BAC末端序列。
[0011]其中，步骤(1)的方法为:用Covaris S220超声破碎系统将超级池的行池、列池和板池中BAC DNA分别打断成400-500bp，经过末端修复后，在DNA两端连接上特定接头，再通过特异的PCR引物扩增含BAC末端序列的区域，纯化并胶回收300-350bp扩增产物，即制成含所有BAC末端序列的测序文库。
[0012]具体地，步骤(1)中制备上述含所有BAC末端序列的测序文库的方法包括如下步骤:
[0013](Al)将BAC DNA打断:在1.5ml离心管中加入5 μ g BACDNA，用TE溶液稀释将其体积补充至130 μ L,把稀释好的DNA缓慢注入Covaris microTube,注意不要引入气泡；设置 Covaris S220 参数，将 DNA 打断成 400_500bp ；
[0014](A2)末端修复:配制末端修复反应的体系,混匀,室温放置20min，反应结束后，用1.8 X AMPure XP Beads 纯化，50 μ L TE 溶液洗脱；
[0015](A3)连接接头:配制连接接头反应的体系，混匀，室温放置30min ;反应结束后，用1.8 X AMPure XP Beads 纯化，30 μ L TE 溶液洗脱；
[0016](Α4)特异性PCR富集BAC末端序列:配制PCR反应的体系，设置好程序进行PCR扩增反应；反应结束后，用1.5 X AMPure XPBeads纯化，30ul TE溶液洗脱，胶回收300_350bp扩增产物。
[0017]优选地，步骤(Al)中设置的Covaris S220参数为:
[0018]
【权利要求】
1.一种测定BAC末端序列的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: Cl)以超级池为单位，富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，制备成适合新一代测序平台所需的文库； (2)在新一代测序平台上进行测序； (3)通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆:利用序列比对，确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每个克隆的BAC末端序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的方法为:用CovarisS220超声破碎系统将超级池的行池、列池和板池中BAC DNA分别打断成400-500bp，经过末端修复后，在DNA两端连接上特定接头，再通过特异的PCR引物扩增含BAC末端序列的区域，纯化并胶回收300-350bp扩增产物，即制成含所有BAC末端序列的测序文库。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中制备上述含所有BAC末端序列的测序文库的方法包括如下步骤: (Al)将BAC DNA打断:在1.5ml离心管中加入5 μ g BACDNA，用TE溶液稀释将其体积补充至130 μ L,把稀释好的DNA注入Covaris microTube,设置Covaris S220参数,将DNA打断成 400-500bp ； (A2)末端修复:配制末端修复反应的体系，混匀，室温放置20min，反应结束后，用1.8 X AMPure XP Bea ds 纯化，50 μ L TE 溶液洗脱； (A3)连接接头:配制连接接头反应的体系，混匀，室温放置30min ;反应结束后，用1.8 X AMPure XP Beads 纯化，30 μ L TE 溶液洗脱； (Α4)特异性PCR富集BAC末端序列:配制PCR反应的体系，设置好程序进行PCR扩增反应；反应结束后，用1.5 X AMPure XPBeads纯化，30ul TE溶液洗脱，胶回收300_350bp扩增产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(Al)中设置的CovarisS220参数为: 负载比5°/u 水浴温度5-15°C 峰值入射功率105瓦特 每秒爆破数200 时间40秒 循环数2。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(A2)中配制的末端修复反应体系如下:打断的DNA130 pL水48 μL
1x末端修复缓冲液20 μΕ
末端修复酶混合物2μΙ^
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(A3)中配制的连接接头反应体系如下:末端修复的DNA50 pL5xDNA连接缓冲液20 pL接头25 μL,连接酶5 pL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(A3)中所述接头为:核苷酸序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条序列，将它们等摩尔混合，退火形成双链，即制成接头。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(A4)中配制的PCR反应体系如下:
连有接头的DNA10 μL PCR反应混合物50 pL
引物 I0.5 μ?,
引物 20.5 μL; 引物I的核苷酸序列如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示；引物2的核苷酸序列如SEQID N0.5 所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(Α4)中PCR反应程序如下:先95°C预变性 5min ;然后 95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；再 72°C延伸 1min ;4°C保存。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述新一代测序平台为1nTorrent PGM 测序仪、1n Torren Proton 测序仪、Illumina 公司的 HiSeq、GA、MiSeq 测序仪或Roche公司的454测序仪中的一种。
【文档编号】C12Q1/68GK104073549SQ201310108959
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】胡晓湘, 谈成, 李宁 申请人:中国农业大学