专利名称：固定化乙醛脱氢酶及其制备方法
固定化乙醛脱氢酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及固定化乙醛脱氢酶及其制备方法。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)是从奸、蟹等甲壳类动物的外壳中提取的一种氨基多糖,其来源丰富，应用十分广泛。壳聚糖分子中游离氨基较多且无毒、生物相容性好。壳聚糖作为固定化酶载体还具有机械性能好，化学性质稳定，耐热性好以及使酶免受金属离子抑制等优点。双功能试剂如戊二醛等与壳聚糖及酶蛋白上的氨基均能发生Schiff反应，因此可用来作为固定化酶的交联剂。目前国内外已有不少研究者将壳聚糖作为酶固定化的载体，其开发应用前景十分广泛。乙醒脱氢酶(EC1.2.1.10, Acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)属于氧化还原酶类，广泛存在于真核生物和原核生物中，在辅酶I存在的条件下，它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛、酮的脱氢反应。在人类和其他许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时乙醛脱氢酶在分子生物学及相关疾病的检测方面也有很多应用。因此，乙醛脱氢酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。目前，有关乙醛脱氢酶固定化的报道相对较少，本文以壳聚糖作为载体，采用吸附交联法固定乙醛脱氢酶，确定了酶固定化的最佳条件，并对固定化乙醛脱氢酶的部分性质进行了探讨。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种固定化乙醛脱氢酶的制备方法，其简便易行、成本较低。
上述技术问题通过以下技术方案实现:一种固定化乙醛脱氢酶的制备方法，其特征在于包括:I):乙醛脱氢酶溶液的制备:称取2g的粗酶粉，先加入20ml_40ml的浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液进行研磨,然后用浓度为5mmol/L NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min离心5min-10min,取上清液于4 下保存备用；2):将壳聚糖载体用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得预处理的壳聚糖载体；3):在所述预处理的壳聚糖载体中加入所述乙醛脱氢酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的壳聚糖载体，其中，所述预处理的壳聚糖载体的质量g与所述乙醛脱氢酶溶液的体积mL之比为1: 2;4):用浓度为的5mmol/L的NaHCO3溶液反复冲洗所述初步吸附的壳聚糖载体至洗脱液在A28tl处无光吸收后，抽干，得吸附处理的壳聚糖载体；5):在所述吸附处理的壳聚糖载体中加入体积浓度为2%的戊二醛在4°C下交联2h，得吸附交联的壳聚糖载体，其中，所述吸附处理的壳聚糖载体的质量g与所述戊二醛的体积mL之比为=1: 4 ；
6):用浓度为的5mmol/L的NaHCO3溶液冲洗所述吸附交联的壳聚糖载体以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即为固定化乙醛脱氢酶。由上述方案可知，本发明以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，用吸附交联法固定乙醛脱氢酶，本发明提供的制备方法简便易行，成本较低，为乙醛脱氢酶的应用提供了良好前
旦
-5^ O本发明同时还提供由上述方法制备得到的固定化乙醛脱氢酶。
图1为加酶量对固定化酶活力的影响的测试结果图；图2为吸附时间对固定化酶活力的影响的测试结果图；图3为戊二醛浓度对固定化酶活力的影响的测试结果图；图4为交联时间对固定化酶活力的影响的测试结果图；图5为溶液酶和固定化酶的最适pH的测试结果·
图6为溶液酶和固定化酶的最适反应温度的测试结果图；图7为溶液酶和固定化酶的pH稳定性的测试结果图；图8为溶液酶和固定化酶的热稳定性的测试结果图。
具体实施方式实施例一本实施例提供的固定化乙醛脱氢酶的制备方法，具体包括:I):乙醛脱氢酶溶液的制备:称取2g的粗酶粉，先加入20ml_40ml的浓度为5mmol/L NaHCO3溶液进行研磨,然后用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min离心5min-10min,取上清液于4 下保存备用；经检测，此乙醛脱氢酶溶液的酶活力为4.64u/g粗酶，比活力为0.21u/mg蛋白质；乙醛脱氢酶溶液的酶活测定:2.9mL酶活性测定体系中含1.95mL 0.05mol/LTris-HCl 溶液(ρΗ7.5) ,0.25mL 0.14mol/L 4-MP溶液(用上述 Tris-HCl 溶液配制)，0.2mL
0.015mol/LNAD+溶液，0.25mL乙醛和酶溶液；加入酶之前先将反应体系于25°C水浴中保温，然后加入同样温浴的酶液0.25mL,混匀并立即计时，在340nm波长下测光吸收值，每30s读一次，共读3min。酶活力单位定义为在上述条件下每分钟产生I μ mo I的NADH的酶量为I个酶活力单位。蛋白质含量的测定采用Bradford(1976)方法，并以牛血清蛋白为标准蛋白质。2):将壳聚糖载体用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得预处理的壳聚糖载体；3):在所述预处理的壳聚糖载体中加入所述乙醛脱氢酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的壳聚糖载体，其中，所述预处理的壳聚糖载体的质量g与所述乙醛脱氢酶溶液的体积mL之比为1: 2;4):用浓度为的5mmol/L的NaHCO3溶液反复冲洗所述初步吸附的壳聚糖载体至洗脱液在A280处无光吸收后，抽干，得吸附处理的壳聚糖载体；所有洗脱液合并为残留酶溶液，为计算偶联效率使用；5):在所述吸附处理的壳聚糖载体中加入体积浓度为2%的戊二醛在4°C下交联2h，得吸附交联的壳聚糖载体，其中，所述吸附处理的壳聚糖载体的质量g与所述戊二醛的体积mL之比为=1 4 ；6):用浓度为的5mmol/L的NaHCO3溶液冲洗所述吸附交联的壳聚糖载体以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即为固定化乙醛脱氢酶。取O. 030g固定化酶，参照乙醛脱氢酶溶液的酶活测定及公式(I)、公式(2)，经测定，酶活力回收达49. 8 %，偶联效率为45. 4 %。
权利要求
1.一种固定化乙醛脱氢酶的制备方法，其特征在于包括 1)乙醛脱氢酶溶液的制备称取2g的粗酶粉，先加入20ml-40ml的浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液进行研磨，然后用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min离心5min-10min,取上清液于4°C下保存备用； 2):将壳聚糖载体用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得预处理的壳聚糖载体； 3):在所述预处理的壳聚糖载体中加入所述乙醛脱氢酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的壳聚糖载体，其中，所述预处理的壳聚糖载体的质量g与所述乙醛脱氢酶溶液的体积mL之比为I : 2; 4):用浓度为的5mmol/LNaHCO3溶液反复冲洗所述初步吸附的壳聚糖载体至洗脱液在A280处无光吸收后，抽干，得吸附处理的壳聚糖载体； 5):在所述吸附处理的壳聚糖载体中加入体积浓度为2%的戊二醛在4°C下交联2h，得吸附交联的壳聚糖载体，其中，所述吸附处理的壳聚糖载体的质量g与所述戊二醛的体积mL之比为=1:4; 6):用浓度为5mmol/L的NaHCO3溶液冲洗所述吸附交联的壳聚糖载体以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即为固定化乙醛脱氢酶。
2.权利要求I所述方法制备 得到的固定化乙醛脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及一种固定化乙醛脱氢酶及其制备方法，其中，制备方法包括1)乙醛脱氢酶溶液的制备；2)将壳聚糖载体用NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得预处理的壳聚糖载体；3)在所述预处理的壳聚糖载体中加入所述乙醛脱氢酶溶液，在4℃下吸附固定6h，得初步吸附的壳聚糖载体；4)用NaHCO3溶液反复冲洗初步吸附的壳聚糖载体至洗脱液在A280处无光吸收后，抽干，得吸附处理的壳聚糖载体；5)在吸附处理的壳聚糖载体中加入体积浓度为2％的戊二醛在4℃下交联2h，得吸附交联的壳聚糖载体；6)用NaHCO3溶液冲洗吸附交联的壳聚糖载体，抽干，得到即为固定化乙醛脱氢酶。本发明简便易行、成本较低。
文档编号C12N11/10GK103224927SQ20131012441
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年3月25日 公开号201310124414.0
发明者马义福, 万艳娟, 胡永刚, 徐凤彩 申请人:珠海市御品堂生物科技有限公司