对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法
【专利摘要】本发明涉及分离自海洋微生物的对各种环氧化物底物具有高对映选择性的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，以及通过采用所示环氧化物水解酶制备具有高对映纯度的环氧化物的方法。本发明的对映选择性水解蛋白可用于以较高的产率制备具有高度生物活性的对映纯环氧化物。
【专利说明】对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法
[0001]本申请是2006年10月4日提交的题为“对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法”的国家申请号为200680046194.2 (PCT/KR2006/004003)的发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及对映选择性环氧化物水解酶和用对映选择性环氧化物水解酶水解各种环氧化物底物从而制备具有对映纯活性的环氧化物的方法。
[0003]发明背景
[0004]很多生物活性物质如药物以不同的对映体形式存在，只有特定的对映体才具有所需功效，其余的对映体会导致严重的不良反应。在安全性和生物活性方面，必须得到单一对映体，因此，可对合成对映纯生物活性物质进行许多研究。
[0005]对映纯环氧化物和邻二醇为制备对映纯生物活性化合物如药用化合物、肽类和功能性食品的通用合成中间体(Grogan, et al., FEMS Microbiol.Lett.，141:239-243,1996 ；Arahira, et al.，Eur.J.Biochem.，267:2649-2657,2000)，因为这些化合物具有优良的反应性并可诱导各种反应。
[0006]特别地，可用手性化学催化剂和酶制备对映纯环氧化物，只有单一对映体是通过用环氧化物水解酶进行选择性水解得到外消旋底物中的各个对映体来制备的。在不久的将来，该方法可被用于商业，因为其可将廉价的外消旋底物变为具有高附加值的对映纯环氧化物。环氧化物水解酶只对映选择性地将外消旋环氧化物底物中的(R)或(S)-对映体水解为二醇而剩下其他类型的对映体，从而得到对映纯环氧化物。此外，环氧化物水解酶对(R)或(S)-对映体的对映选择性取决于微生物和底物结构。
[0007]环氧化物水解酶(EHase ；EC3.3.2.3)为常见的酶，已从各种来源如细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和哺乳动物中分离(Weijers, et al.，J.Mol.Catal.B Enzym.,6:199-214,1999 ；Archelas, &Furstoss, Curr.0pin.Chem.Biol.,5:112-119, 2001)。由于在通过对映选择性EHase的动力学拆分来制备对映纯环氧化物中的潜在应用，已对几种EHase进行研发(Tokunaga, et al.，Science,277:936-938,1997)。
[0008] 但是,对映选择性EHases的数量有限,这需要研究开发新型对映选择性EHases用于在药学工业中制备对映纯环氧化物。
[0009]大多数EHases为α/β水解酶家族成员，该家族包括蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脱卤素酶和过氧化物酶(Nardini, &Di jkstra, Curr.0pin.Struct.Biol.,9:732-737,1999 ；Rick, et al,.J.Am.Chem.Soc.,121:7417-7418,1999)。α/β 区域由被 α 螺旋环绕的核心一平行或混合β层构成。这些酶的特征为采用两步机理，其中酶的催化亲核部分先进攻共价中间体的极性亲电底物，然后再将其水解(Yamada，et al.，J.Biol.Chem.，275:23082-23088，2000)。α/β水解酶折叠酶的保守催化三元体(triad)由亲核残基(Asp或Ser)、酸性残基(Asp或Glu)和保守组氨酸残基构成。亲核基团适合保守的氨基酸序列基序，Sm-X-Nu-Sm (Sm =小残基，X =任何残基，Nu =亲核基团)。其它保守的氨基酸序列为包含酶的含氧的阴离子洞(oxyanion hole)的 HGXP 基序(Ollis, et al.，Protein Eng.，5:197-211,1992)。
[0010]但是，EHases中一级序列的保守性仅限制在关键区域的2或3个氨基酸，这使得通过同源检索进行筛选比较困难。
[0011]发明简述
[0012]本发明的
【发明者】通过筛选来自各种海洋环境的赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.),分析它们基因组的ORF序列确定候选基因，并表达候选基因发现了具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。
[0013]本发明的目的为提供来自海洋环境的可产生高对映纯环氧化物的对映选择性环氧化物水解酶蛋白。
[0014]本发明的另外的目的为提供通过采用对各种环氧化物底物具有高对映选择性的环氧化物水解酶蛋白制备对映纯环氧化物的方法。
[0015]本发明的另一目的为提供来自各种海洋环境的具有对映选择性水解酶活性的赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)及筛选它们的方法。
[0016]为了这些目的,本发明提供了分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为30-45kDa ；2)最适pH为6.5-8.0 ;和3)最适温度为40_60°C。优选地，所述蛋白包含SEQID NO:13所示的氨基酸序列、 SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或SEQ ID N0:17所示的氨基酸序列。更优选地，SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码，SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列编码，SEQ IDNO: 17所示的氨基酸序列由SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列编码。
[0017]此外,本发明提供了分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为45-50kDa ；
2)最适pH7.0-8.0 ;和3)最适温度为30-40°C。优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列编码。
[0018]在另一方面，本发明提供了分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为40-45kDa ；2)最适pH为7.0-8.0 ;和3)最适温度为30_40°C。优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID N0:31所示的核苷酸序列编码。
[0019]在另外的方法,本发明提供了分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为35-40kDa ；2)最适pH为7.0-8.0 ;和3)最适温度为30_40°C。优选地，所述蛋白具有SEQID NO:32所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列编码。
[0020]在又一方面，本发明提供了通过采用对映选择性环氧化物水解酶蛋白制备对映纯环氧化物的方法。[0021]附图简述
[0022]通过参考以下详述并结合附图，可以更深入地理解本发明，从而明白无误地领会本发明的整体意义及其许多相关优点。
[0023]图1A所示为各种环氧化物底物类型，其中A、B、C、D分别表示苯乙烯氧化物(SO)、缩水甘油基苯基醚(GPE)、1，2-环氧己烷(EX)和I，2-环氧丁烷(EB)。
[0024]图1B所示为赤细菌(Erythrobacter spp.) JCS358对外消旋SO底物的水解活性的气相色谱分析，其中A和B分别表示(S)-苯乙烯氧化物和(R)-苯乙烯氧化物。
[0025]图2所示为赤细菌(Erythrobacter spp.) JCS358对外消旋SO底物的动力学拆分率，其中〇、.和□分别表示(R)-苯乙烯氧化物面积、(S)-苯乙烯氧化物面积和对映体过量(％ )。
[0026]图3A-3C所示为纯化的EEHl蛋白的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列间的序列比对。
[0027]图4A和4B所示为从EEHl和EEH2中纯化的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列间的序列比对。
[0028]图5所示为环氧化物水解酶(EHase)的系统发生分析。
[0029]图6 所不为用 SDS-PAGE 从海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594 中分离的三种EHase的纯度，其中图A表示纯化的EH11，图B表示纯化的EEH2和EEH3。
[0030]图7A和7B所示为pH和温度对纯化的rEEHl、rEEH2和rEEH3对活性的影响，其中
O、?和▼分别表示EEHl、E EH2和EEH3。
[0031 ] 图8所示为对映选择性EHases (EEHUEEH2和EH13)对外消旋SO底物的水解活性的气相色谱分析。
[0032]图9所示为用SDS-PAGE从食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)分离的 EHase 的纯度。
[0033]发明详述和优选实施方案
[0034]现在将更详细地解释本发明。
[0035]本发明提供了得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、鞘氨醇细菌(SPhingophyxis alaskensis)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)和红细菌的纯化对映选择性环氧化物水解酶蛋白。
[0036]赤细菌(Erythrobactersp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)通过筛选选择，然后排列它们基因组中的ORF序列以选择候选基因。对各种底物具有高对映选择性的对映选择性水解酶蛋白从候选基因的表达产物中分离和纯化。更具体而言，具有高对映选择性的对映选择性水解酶通过采用下面的筛选方法从微生物中分离，所述微生物包括赤细菌(Erythrobactersp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)，它们得自于各种海洋环境。所述筛选方法包括以下步骤:
[0037]I)从各种海洋环境中制备感兴趣的样品；
[0038]2)通过在滋养培养基中培养样品来选择阳性株；
[0039]3)通过分析所述株基因组中的ORF核苷酸序列确定候选基因，将所得的核苷酸序列与已知环氧化物水解酶核苷酸序列进行序列比对；和[0040]4)通过将候选基因导入表达载体并培养该载体来从候选基因检测具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。
[0041]筛选方法步骤I中的感兴趣的样品不特别限定，但可为得自各种海洋环境的海洋沉积物、海绵和海藻，所述海洋环境如韩国Gangwon-Do的Hoogin、Ulleungdo (岛)、Dokdo (岛)、Busan 的 Taejongdae 和 Gyeongg1-do 的 Sihwa 以及日本的 Kagoshima。可直接从收集的海洋沉积物中或在滋养培养基中培养后来分离所述株。
[0042]筛选方法步骤2中的滋养培养基不特别限定，优选为Iwt %苯乙烯氧化物(SO)或烷烃混合物(nC8、CIO、nC12、nC13、nC14、nC15、nC16、C17、nC18 和环己烷(Sigma, MO, USA)在IL海水的矿物盐培养基(MM2)中混合。
[0043]在筛选方法中，步骤3中的细菌选自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、赤细菌 2216.25.25、赤细菌(Erythrobacter aquimaris) SW-110、赤细菌(Erythrobactergaetabuli)、Alterierythrobacter epoxidivorans、赤细菌(Erythrobacter luteolus)SW-109、赤细菌MBIC3031和长赤细菌(Erythrobacter longus)。所述微生物可为选自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594、赤细菌 AKS329、赤细菌(Erythrobacteraquimaris) JCS325、赤细菌(Erythrobacter gaetbuli) JCS340JCS325、赤细菌 JCS340、赤细菌 JCS350、赤细菌 JCS358、Alterierythrobacter sp.JCS350、赤细菌(Erythrobacteraquimaris sp.)JCS360> 赤细菌(Erythrobacter aquimaris sp.)JCS364、赤细菌(Erythrobacter luteolus sp.) JCS368、赤细菌 HJ239、长赤细菌(Erythrobacter longussp.)DokDol5、海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)DMS8509 和赤细菌(Erythrobactergeatbuli) KCTC12227 (表2)的赤细菌，但并不限于此。
[0044]可通过Ensoltek (www.ensoltek.com)生产的 ProteinFinder 和 BLAST 程序来进行开放阅读框架分析，但并不限于此。此外，保守环氧化物水解酶氨基酸序列的分析方法以及本发明的新型环氧化物水解酶可通过采用CLUSTAL W程序来进行(Thompson, et al.,Nucleic.Acids.22:4673-4680,1994)，但并不限于此。
[0045]步骤3)中的候选基因包括得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的由SEQ ID NO:13表示的EEHl基因、由SEQ ID NO: 16表示的EEH2基因和由SEQ ID NO:18表示的EEH3基因，得自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的由SEQ ID NO:29表示的sEE:H基因，得自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的由SEQ ID NO:31表示的nEHl基因和得自红细菌的由SEQ ID NO:33表示的rEHl基因，但并不限于此。此外，候选基因可为完全开放阅读框或其衍生自该基因的片段。
[0046]在筛选方法的步骤4中，表达载体可为先有技术中采用的任何表达载体，如pET_24a(+)。
[0047]在步骤4中，对各种环氧化物底物的水解活性分析通过基于提取自反应混合物的环氧化物的分光光度法分析和非提取的二醇的分光光度法定量或气相色谱来进行。
[0048]当四(4)种候选株从海洋环境种筛选出以后，从候选株中分离并纯化对各种环氧化物底物具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。通过本领域常用的通用分离和纯化方法分离并纯化环氧化物水解酶。例如，在富集有卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中进行接种培养后，向主培养基中加入I %培养株，培养3小时，向其中加入IPTG至终浓度为ImM。为了纯化表达基因产物，要将His-Tag加入候选基因，然后用Talon树脂(Clontech、C0.)分裂。
[0049]此外，通过分析基因组DNA中的ORF序列来分析纯化的环氧化物水解酶蛋白的编码基因，从海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594中分离出1.122bp基因(EEH1,SEQ ID NO: 14)、870bp 基因(EEH2,SEQ ID NO:16)和 888bp 基因(EEH3,SEQ ID NO:18)。
[0050]銷氛醇细菌(Sphingophyxisalaskensis)的 sEElH 基因(SEQ ID NO:29)、食芳香物新鞘氨醇杆菌 Novosphingobium aromaticivorans)的 ηΕΕ? 基因(SEQ ID NO:31)和红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654 的 rEEH 基因(SEQ ID NO:33)分别被分离。此外，每个基因被导入表达载体pET_24a (+),转化BL21-CodonPlus (DE3)-RP (Novagen),然后进行SDS-PAGE电泳。因此,所述水解酶为分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594 的 41kDa-大小的蛋白(rEEHU SEQ ID NO:13)、33.4kDa_ 大小的蛋白(rEEH2、SEQ ID NO:15)和34.5kDa_大小的蛋白(rEH13，SEQ ID NO:17)，分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的 49kDa_大小的蛋白(sEEH, SEQ ID NO:28),分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的 43kDa_ 大小的蛋白(nEEH, SEQID NO:30)和分离自銷氛醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的 36kDa、43kDa_ 大小的(rEEH, SEQ ID NO:32)分离自红细菌(Rohdobacterium sp.) HTCC2654 (图 9)。
[0051]本发明提供了分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:
[0052]I)通过SDS-PAGE 方法测定，分子量为30_45kDa ；
[0053]2)最适 pH 为 6.5-8.0 ;和
[0054]3)最适温度为 40_60°C。
[0055]优选地，分离自海滨赤细菌(Erythrobacterlitoralis)的rEE；Hl、rEEH2和rEE；H3水解酶分子量分别为41kDa(SEQ ID NO:13所示的多肽)、33.4kDa(SEQ ID NO:15所示的多肽)和34.5kDa(SEQ ID NO: 17所示的多肽)(图6A和图6B)，最适pH分别为6.5 (rEEHl)、7.5 (rEEH2)和 8.0 (rEEH3)(图 7A)，最适温度分别为 50 V (rEEHl)、55 V (rEEH2)和45 0C (rEEH3)(图 7B)。
[0056]本发明提供了分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:
[0057]I)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为45_50kDa ；
[0058]2)最适 pH 为 7.0-8.0 ;和
[0059]3)最适温度为 30_40°C。
[0060]优选地，rEEH水解酶的分子量为49kDa(SEQ ID NO:28所示的多肽)(见Fig.9)，最适pH为约7,最适温度为30-40°C。
[0061]本发明提供了分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:
[0062]I)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为40_45kDa ；
[0063]2)最适 pH 为 7.0-8.0 ;和
[0064]3)最适温度为 30_40°C。[0065]优选地，rEEH水解酶的分子量为43kDa(SEQ ID NO:30所示的多肽)(见Fig.9)，最适pH为7.0-8.0，最适温度为30-40°C。
[0066]本发明提供了分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征:
[0067]I)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为35_40kDa ；
[0068]2)最适 pH 为 7.0-8.0 ;和
[0069]3)最适温度为 30_40°C。
[0070]优选地，rEEH水解酶的分子量为36kDa(SEQ ID NO:32所示的多肽)(见图9)、最适pH为7.0-8.0 ;最适温度为30-400C。
[0071]在本发明的另一方面，提供了通过采用对各种环氧化物底物具有高对映选择性的对映选择性环氧化物水解酶蛋白制备高对映纯环氧化物的方法。
[0072]在一个实施方案中，可将2-100mM的外消旋苯乙烯氧化物与纯化的酶如EEH1、EEH2, EEH3, sEEH、nEHl和rEEH、重组E.coli或野生型株在各自的最适条件下反应(由气相色谱确定)，然后应用所产生的环氧化物。
[0073]在本发明中，对映选择性环氧化物水解酶的底物没有特别限定，其实例为苯乙烯氧化物(SO)、缩水甘油基苯基醚(GPE)、环氧氯丙烷(ECH)、环氧氟丙烷(EF)、1，2_环氧丁烷(EB)和I，2-环氧己烷(EX)。
[0074]具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列、SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或SEQID NO:17所示的氨基酸序列的 水解酶，可在pH6.5-8.0和40_60°C的温度下进行制备。
[0075]具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或SEQID NO:32所示的氨基酸序列的水解酶，可在pH7.0-8.0和30_40°C的温度下进行制备。
[0076]下面的实施例中示例了本发明实际的和目前优选的实施方案。但是，本领域熟练技术人员应了解，可在本发明的精神和范围内对本公开进行修正和改进。
[0077]<实施例1>
[0078]筛选对映选择性环氧化物水解酶(EHase)-产生微生物
[0079]〈1-1>材料和试剂
[0080]图1中显示了本发明所用的环氧化物，其中外消旋苯乙烯氧化物购自FlukaC0.，纯(R)-苯乙烯氧化物、纯(S)-苯乙烯氧化物和所有其它外消旋环氧化物均分别购自Aldrich C0.。Chiraldex Y -三氟乙酰基环糊精(G-TA)毛细管GC柱购自AstecC0.(ffhippany, NJ)，其它培养基组分购自Merck和Difco Co。
[0081]〈1-2>样品制备
[0082]海洋沉积物、海绵和海藻样品收集自Hujin(深~20m;37o51，N，129o45，E)、Ulleungdo (深~758.7m ;38o00，N, 131o27，E)、Dokdo (深~620m ;37ol4，N, 131o45，E)、Taejongda(深~20m ;35ol4，N、129o45，E)、Sihwa(Yellow sea、Korea)和 Kagoshima 湾(深100~200m;31o90’N，130o48’E)。其中，采用各种方法如抓取(grab)、中心采样(coresampler)和配套水下呼吸器潜水(scuba diving)来收集沉积物样品。采样后,立即将0.3g冷冻的沉积物在研钵中研磨，然后在富含营养物的培养基中孵育。样品在与所有法定团体的正式合约下采集。
[0083]〈1-3> 株分离[0084]将I % 的 SO 底物、环氧氯丙烷或烷烃混合物(nC8、nC1(l、nC12、nC13、nC14、nC15、nC16、nC17、nC18 和环己烷，Sigma Chemical C0.、St Louis、MO、USA)与 IL 矿物盐培养基的海水(MM2)混合(Ferrara-Guerrero et al., Handbook of methods in microbial ecology.Lewis Publishers, Florida and p9_19,1993)来制备富含营养物的培养基。在25°C下培养7天后，分离克隆物。通过在25°C下在ZoBell琼脂中连续接种和孵育来纯化分离物。分离的株用于下面的筛选步骤。
[0085]〈1_4> 株培养
[0086]海滨赤细菌(Erythrobacterlitoralis)HTCC2594 在含 0.5 % 蛋白腺、0.1 %酵母提取物和 75% 海水(pH7.5)的 ZoBell2216E 肉汤(Oppenheimer&Zobell, 1952)培养基中在30°C下培养I天。鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)和食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)在含0.5 %蛋白腺和0.3 %酵母提取物的营养培养基中在30°C下培养。红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654在海产物肉汤(marine broth) 2216 (Difco)培养基中在25 °C下培养。将细菌细胞悬浮于含20 %丙三醇的ZoBell2216E肉汤培养基中，在-80°C下保存备用。大肠杆菌DH5a和大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3) -RIL 细胞(Stratagene，Lajolla，CA)分另用于质粒持续培养和基因表达。所述细胞在含适当抗生素的Luria-Bertani (LB)肉汤培养基中在37°C下培养。
[0087]<l-5>EHase产生株的鉴定
[0088]用如上所述的方法，本发明的一个实施方案共从海洋环境中分离出181株。在这181株中，通过分光光度法测定显示31株可水解SO底物(表1)。用气相色谱法(GC)分析了这些株的对映选择性EHase的水解活性之后，最终显示有I株，JCS358，可优先水解SO的(R)-环氧化物(表1和图1B)。
[0089][表 I]
[0090]产生对映 选择性EHase的海洋微生物的筛选以及对得自微生物的16S rRNA基因
的序列分析
[0091]
【权利要求】
1.一种对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其分离自红细菌(Rhodobacterium sp.)HTCC2654以及由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成。
2.一种制备对映纯苯乙烯氧化物的方法，所述方法为将由SEQ ID N0:32氨基酸组成的蛋白与苯乙烯氧化物的底物反应，以对映选择性地水解该苯乙烯氧化物。
3.权利要求1的方法，其中所述蛋白由SEQID NO:33的核苷酸序列编码。
4.权利要求2的方法，其中所述蛋白的最适pH为7.0-8.0，最适温度为30-40°C。
【文档编号】C12P17/02GK103468658SQ201310125460
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2006年10月4日 优先权日:2005年10月7日
【发明者】金尚珍, 姜成均, 黄英玉, 禹正熙, 曺章天, 姜智贤, 权改劲 申请人:韩国海洋研究及发展院