专利名称：乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。特别是一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
氮的利用在农作物生产中占非常重要的地位，植物氮代谢及其调控一直备受全世界关注，氮肥利用率低及过量施用氮肥造成水环境污染的问题也是世界性难题。随着对植物氮同化过程中关键酶生理功能的研究日益深入，通过基因工程的方法来提高植物氮素利用率将成为必然的趋势，这对挖掘作物自身潜力以及高效利用土壤氮素养分资源，实现现代农业持续发展具有重要意义。生物体的生长和发育过程中，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是生物体内氮同化路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α-酮戊二酸上，从而生成两分子的谷氨酸。谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。构建基因工程氮高效利用植物，优良的备选基因是关键的材料储备之一。细菌的谷氨酰胺合成酶涵盖了目前所发现的三大类谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有种类多和容易克隆的优越性。乳球菌(L3Ci0C0CCMsp.)是一种常见的革兰氏阳性土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能分析对新氮高效基因的鉴定并应用于改善逆境下农作物的生理性状有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种谷氨酰胺合成酶基因。本发明的目的之二在于提供了该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。为达到以上目的，本发明通过下述方案实现:
一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID N0.1所示的碱基序列。—种根据上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的序列为SEQ ID N0.2所不的氨基酸序列。一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。
一种克隆上述的乳球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:参考NCBI数据库中的乳球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增得到不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物为:LactocF: 5，-ATGACAATCACAGCAGCAGA-3，和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’。上述的PCR扩增的条件为:94°C 5分钟；94°C 50秒，45°C 50秒，72°C I分30秒，25个循环；72°C 8分钟。本发明的互补实验验证了谷氨酰胺合成酶基因L3CiW所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。
图1和2为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大；
图3为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族；
图4为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互补分析图。培养基中添加谷氨酰胺，转入和未转入的菌株均可以正常生长；
图5为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互补分析图。培养基中未添加谷氨酰胺，只有转入的菌株可以正常生长。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述`本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一 -.Lactol基因全长编码区的克隆与分析:
通过参考NCBI数据库中的乳球菌属(ZaciococcM spp.)细菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，该引物为:LactocF: 5’ -ATGACAATCACAGCAGCAGA-3’ 和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增出了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为Lac tol。将该基因插入克隆载体pMD 18-T，挑选相应的阳性克隆，对该基因进行了全长DNA测序，获得了含有该基因完整ORF的DNA序列。测序结果表明'Lactol的ORF全长1341bp。DNAstar软件的分析结果显示:该基因编码一个含446个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为50kDa，等电点为4.96。利用Cell-PLoc网站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry网站的ProtComp Version 9.0软件对基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在细胞质的可能性很大，参见图1和2，这与其它物种中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。进化分析表明，L3CiW基因编码的蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族，参见图3。实施例二 -.Lactol在大肠杆菌突变体中的功能分析通过DNA测序分析，挑选Zac ο7基因ORF转录方向与载体pMD 18-Τ上乳糖启动子转录方向一致的克隆,抽提该克隆的质粒,并转入大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。请参见文献:Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriolj 1992，174(2):650-654.。该突变体由于缺失编码谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培养基中无法正常生长。该菌株购买于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由图4和图5说明Lactol能够互补大肠杆菌突变体ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。Lactol的表达，使得大肠杆菌突变体ET6017在不添加谷氨酰胺的培养条件下生长。该互补实验在大肠杆菌中验证了基因L3CiW所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，证明该基因能够恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID N0.1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的序列为SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
3.—种重组表达载体，该重组载体含有根据权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞,该宿主细胞含有根据权利要求3所述的重组载体。
5.一种克隆根据权利要求1所述的乳球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:参考NCBI数据库中的乳球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增得到不枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物为=LactocF: 5，-ATGACAATCACAGCAGCAGA-3，和 LactocR:5’ -TTARTAAAGTTCTAARTART-3’。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增的条件为:94°C5分钟；94°C 50 秒，45°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 个循环；72°C 8 分钟。
全文摘要
本发明涉及一种乳球菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。本发明的基因来源于乳球菌属细菌，为SEQIDNO1所示的碱基序列。该基因编码谷氨酰胺合成酶，能够显著提高模式生物大肠杆菌合成谷氨酰胺的能力。这预示了所公开的全长基因及氨基酸序列，在提高生物体的氮利用效率和增加生物体氮元素含量的基因工程方面具有应用价值。
文档编号C12N1/21GK103205441SQ20131013049
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者朱晨光, 沈春磊, 王伟, 邢莹莹, 徐腾蛟, 唐远平, 梅冰, 宋任涛 申请人:上海大学