专利名称:用于检测clcn1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物的制作方法
技术领域:
本发明涉及用于检测CLCNl基因突变的方法、试剂盒及特异性引物。具体而言,本发明涉及用于非诊断目的检测CLCNl基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法、试剂盒及特异性引物。
背景技术:
真核生物基因由编码蛋白质的外显子(exon)和不编码蛋白质的间插序列内含子(intixm)组成。外显子是真核生物基因的一部分,它在剪接后仍会被保存下来,并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列,是既存在于最初的转录产物中,也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。通过PCR方法对基因组DNA进行扩增,将得到的目的片段进行测序,并与正常序列进行对比,可以获得基因突变的信息。在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。Sanger于1977年建立了双脱氧核糖核酸链末端终止法测序。Sanger高通量测序可以半小时完成96个样本的测序,随着测序成本的降低,这种方法越来越适合做大规模检测,既省时又高效。氯离子通道基因CLCNl (Chloride Channell)的核苷酸序列是已知的(GenbankAccession N0.NG_009815.1)。根据HGMD等数据库提供的信息,CLCNl的突变主要分布在外显子及剪切位点侧翼区,包括100余个点突变。详细目录见表I。
表ICLCNl突变位点
权利要求
1.一种非诊断目的检测CLCNl基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法,其包括以下步骤: (1)使用特异性扩增引物对通过PCR扩增待测样本的CLCNl基因,从而获得PCR扩增产物; (2)采用所述特异性扩增引物对中的正向引物将步骤(I)中的扩增产物进行测序扩增,从而获得测序扩增产物; (3)对步骤(2)中获得的测序扩增产物进行测序,并将测序峰图与数据库中的CLCNl基因参考序列进行对比,从而确定基因的突变位点。
2.权利要求1的方法,其中在步骤(I)和步骤(2)之间包括纯化PCR扩增产物的步骤,优选地,所述纯化方法为通过凝胶电泳和millipore纯化板进行纯化。
3.权利要求1的方法,其中在步骤(2)和步骤(3)之间还包括纯化所述测序扩增产物的步骤,优选地,所述纯化方法为通过EDTA和无水乙醇进行纯化。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中在所述步骤(3)中测序方法为Sanger法或第二代测序法。
5.权利要求1-3任一项的方法,其中所述PCR扩增引物对的核苷酸序列是SEQID NO:1和 16、SEQ ID NO:2 和 17、SEQ ID NO:3 和 18、SEQ ID NO:4 和 19、SEQ ID NO:5 和 20、SEQID 勵:6和21、5£0 ID N0WP22、SEQ ID 勵:8和23、5£0 ID 勵:9和24、5£0 ID NO: 10和 25、SEQ ID 勵:11和26、5£0 ID 勵:12和27、5£0 ID 勵:13和28、5£0 ID NO: 14 和 29、SEQ ID NO: 15和30中的一对或多对,并且/或者所述测序扩增引物的核苷酸序列是SEQ IDNO: 1-15中的一个或多个。
6.权利要求1-3任一项的方法,其中所述样品是血样,优选是分离自哺乳动物,特别是人的血样。
7.用于扩增CLCNl基因的特异性引物,其序列是SEQID NO: 1_30中的任选一项。
8.权利要求7的特异性引物用于非诊断目的检测CLCNl基因突变位点的用途。
9.用于检测CLCNl基因突变位点的试剂盒,其包含用于扩增CLCNl基因的扩增引物,其核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 和 16, SEQ ID N0:2 和 17、SEQ ID NO:3 18, SEQ ID NO:419,SEQ ID N0:5 和 20、SEQ ID N0:6 和 21、SEQ ID N0:7 和 22、SEQ ID N0:8 和 23、SEQ ID勵:9和24、5£0 ID NO: 10 和 25、SEQ ID NO: 11 和 26、SEQ ID NO: 12 和 27、SEQ ID NO: 13和28、SEQ ID勵:14和29、5£0 ID NO: 15和30中的一对或多对;和/或用于测序扩增的引物,其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-15中的一个或多个,任选地,所述试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂,和/或用于测序扩增反应的酶和试剂,和/或用于提取血液DNA的试剂。
10.权利要求9的试剂盒用于非诊断目的检测CLCNl基因突变的用途。
全文摘要
本发明涉及用于检测CLCN1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物。具体而言,本发明涉及用于检测CLCN1基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法、试剂盒及特异性引物。
文档编号C12Q1/68GK103205503SQ20131014849
公开日2013年7月17日 申请日期2011年5月19日 优先权日2010年12月28日
发明者魏晓明, 王金明 申请人:深圳华大基因科技有限公司