专利名称：一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法
技术领域：
本发明属于降解菌剂的制备领域，特别涉及一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法。
背景技术：
随着新型环境分析工具的快速发展和应用，以及人们环境意识的不断增强，世界各国的环境工作者对环境污染和人类健康领域中的关注焦点已逐渐从传统典型的污染物延伸到环境中存在的新兴痕量污染物，如抗生素药物等。近年来，在污水、地表水、地下水，甚至是饮用水中都检测出不同浓度水平的抗生素药物。有研究表明，长期暴露在环境浓度水平的抗生素药物环境下会对生物造成慢性毒性、内分泌干扰、抗药性演变等严重危害。红霉素(分子结构式如图1)是一种大环内脂类抗生素药物，被广泛地应用于人体呼吸道感染等疾病的治疗。通常情况下，红霉素药物进入人体后只能被部分分别代谢吸收，未被吸收的母体及其代谢产物大部分被排入城市污水处理厂进行处理，但是现有的污水处理工艺对其只能部分降解去除，从而导致仍有相当数量的红霉素药物进入水源水中。目前，我国颁布执行的生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)并未规定需对相关抗生素药物进行检测和控制。美国环境保护署于2009年首次将红霉素药物列为饮用水标准需要优先检测和控制的候选污染物之一。现阶段，对水中存在的微量红霉素药物的处理方法主要有二氧化氯氧化法、膜过滤法、砂滤-臭氧氧化法、生物降解法等。尽管如此，化学氧化法和高级氧化法虽然可以部分甚至完全氧化降解红霉素药物，但往往达不到矿化的效果，所产生的氧化副产物对生物体产生的毒性可能更强。膜过滤法虽然可以较为高效的去除水中的红霉素药物，但存在能耗大，投资高的缺点，此外所产生的浓缩液的处理仍然是一个问题。生物降解法是一种价格低廉而有效的处理方法，但传统的污水处理工艺对红霉素处理效果往往差强人意。研究表明，红霉素药物去除与 降解微生物的菌种密切相关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，该方法简单易行、安全性高、成本低；所得的红霉素降解菌剂使用方便，能够高效降解抗生素药物红霉素，而且菌株易于灭活，能够应用于水处理中红霉素的有效去除。本发明中的一种用于增强去除污水和水源水中红霉素能力的高效降解菌株，是一种革兰氏染色反应阴性菌株，经鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),主要生物学特性为G_，菌体呈短杆状，菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，边缘整齐，表面光滑，微凸，菌体大小为0.4 0.6 ii mX 1.0 1.5 ii m。葡萄糖发酵试验、甲基红试验、产硫化氢试验、朽1檬酸盐试验、明胶试验、葡萄糖产气试验、V-P试验呈阴性；淀粉水解试验、尿素酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验呈阳性；该菌株16S rDNA的长度为1388bp，基因序列在GenBank中的登录号为JN226401。
本发明的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，包括:(I)将活性污泥按7%_15%的接种量接入培养基中，以梯度压力式驯化法进行驯化，红霉素投加浓度为10 100mg/L，驯化后，静置，取上层水样，经梯度稀释后采用涂布分离法和平板划线法分离，然后接种于富集培养基上，培养温度为25-35°C，培养时间为48-72h，纯化，将分离出的菌种接种到牛肉膏和蛋白胨培养基中，振荡培养至菌种处于对数生长期；(2)将上述培养好的菌种按1%_3%的接种量接入无机培养基中培养，即得抗生素药物红霉素降解菌剂，其中培养过程，搅拌速度为140 180r/min，培养温度为25_35°C，培养时间为48 72h，红霉素浓度为20-50mg/L。所述步骤(I)中培养基配方为:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg，MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 7H200.0lg, CaCl2 2H200.03g，蒸馏水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。所述步骤(I)中驯化条件为:搅拌速度140 180r/min，培养温度为25 35°C，驯化时间为2 3个月。所述步骤(I)中富集培养基的配方为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，琼脂糖17g，蒸馏水 IOOOmL, pH=7.1 7.3。所述步骤(I)中牛肉膏和蛋白胨培养基为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，蒸馏水IOOOmL, pH=7.2 7.5。所述步骤(I)中红霉素梯度投加浓度依次为10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L。所述步骤(2)中无机 培养基为K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸馏水 IOOOmL, pH6.8 7.0，红霉素 20 50mg/Lo所述步骤(2)所得的降解菌剂可应用于污水处理和水源水处理领域。本发明借助于生物强化技术的思想，从城市污水处理厂二次沉淀池的活性污泥中经驯化、富集、分离、纯化后，得到一株对抗生素药物红霉素具有高效降解作用的菌株。该菌株来源于污水处理系统，能够适应复杂的实际水质条件以加速处理系统启动，而且可以提高水处理系统承受水力和有机负荷能力，优化处理系统内降解菌群落结构，在含红霉素污水和水源水生物处理系统中具有非常广阔的应用前景。有益.效果(I)本发明制备方法简单易行、安全性高、成本低；所得的红霉素降解菌剂使用方便，能够高效降解抗生素药物红霉素，而且菌株易于灭活，保证其使用的生态安全性，能够应用于水处理中红霉素的有效去除；本发明对于污水和水源水中微量抗生素药物的高效生物降解去除具有重要的借鉴意义和使用价值；(2)水源水预处理工艺中试装置(曝气生物滤池)试验结果表明，使用本发明所得的降解菌剂不仅可以加快处理系统的成功启动，而且显著提高对水源水中红霉素药物的去除效率。
图1为红霉素的分子结构式；
图2为红霉素高效降解菌剂的电镜扫描图；图3为曝气生物滤池实验装置图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.菌株的分离和鉴定(I)将活性污泥按10%的接种量接入培养基中，以梯度压力式驯化法进行驯化，红霉素投加浓度依次为10、20、40、60、80、100mg/L，在培养温度为30 °C和搅拌速度为160r/min条件下，250mL锥形瓶中装填量IOOmL进行驯化培养，总驯化时间约为3个月。无机盐培养基配方为:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g,FeSO4.7H200.0lg, CaCl2.2H200.03g,蒸馏水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。(2)取ImL上述驯化后的培养液，使用灭菌的生理盐水作KT1 10_6梯度稀释，用涂布棒均匀涂布在固体培养基上，然后将培养基置于30°C光照培养箱中培养48h。挑取形态清晰的单一菌落，并进行编号，然后反复纯化。将分离出的菌株接种到斜面培养基上，于4°C冰箱中保存，每隔3个月移植培养一次，待后续进行降解实验。其中富集培养基配方为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，琼脂糖17g，蒸馏水IOOOmL, pH=7.2。(3)分别挑取经分离纯化后的单一菌落以2%的接种量于各自的无机盐培养基中，向无机盐培养基中投加红霉素药物，投加浓度分别为20mg/L和50mg/L。在培养温度为30°C和搅拌速度为160r/min条件下，250mL锥形瓶中装填量IOOmL的条件下避光振荡培养，培养时间为5d。培养后测定溶液中红霉素药物的剩余浓度，选取并确定对红霉素药物降解效率最高的菌株Ery-E ；所述的无机盐培养基配方为:Κ2ΗΡ044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸馏水 IOOOmL, pH6.8 7.0，红霉素 20 50mg/Lo(4)经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析和同源性比较，菌株Ery-E被初步鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),主要生物学特性为G 菌体呈短杆状,菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，边缘整齐、表面光滑、微凸，菌株大小为0.4 0.6 μ mX 1.0
1.5 μ m。葡萄糖发酵试验、甲基红试验、产硫化氢试验、柠檬酸盐试验、明胶试验、葡萄糖产气试验、V-P试验呈阴性；淀粉水解试验、尿素酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验呈阳性。该菌株16SrDNA的长度为1388bp，在GenBank中的登录号为JN226401。2.实验室锥形瓶红霉素药物的降解试验本发明所提供的红霉素高效降解菌剂在pH为7.0 7.5，培养温度为30°C，振荡速率为160r/min，250mL锥形瓶中装填量IOOmL的条件下，菌株接种量为2%，红霉素初始浓度为30mg/L，培养5d后，可得红霉素药 物的降解效率达76%以上。3.水源水预处理工艺中试装置(曝气生物滤池)的生物强化试验
将本发明提供的红霉素高效降解菌剂按3%的比例，在进水温度为15 20°C，pH为6.5 7.8条件下，维持气水比约为4:1，水力停留时间为4h，红霉素药物投加浓度为50y g/L，结果表明，投加了降解菌剂的曝气生物滤池中红霉素药物的平均去除率为61% 70%，而没有投加降解菌剂的曝 气生物滤池中红霉素药物的平均去除率为27% 29%。
权利要求
1.一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，包括: (1)将活性污泥按7%-15%的接种量接入培养基中，以梯度压力式驯化法进行驯化，红霉素投加浓度为10 100mg/L，驯化后，静置，取上层水样，经梯度稀释后采用涂布分离法和平板划线法分离，然后接种于富集培养基上，培养温度为25-35°C，培养时间为48-72h，纯化，将分离出的菌种接种到牛肉膏和蛋白胨培养基中，振荡培养至菌种处于对数生长期； (2)将上述培养好的菌种按1%_3%的接种量接入无机培养基中培养，即得抗生素药物红霉素降解菌剂，其中培养过程，搅拌速度为140 180r/min，培养温度为25_35°C，培养时间为48 72h，红霉素浓度为20-50mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中培养基配方为:K2HP044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg，MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4.7H200.0lg, CaCl2.2H200.03g，蒸馏水 IOOOmL, pH=6.8 7.0。
3.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中驯化条件为:搅拌速度140 180r/min，培养温度为25 35°C，驯化时间为2 3个月。
4.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中富集培养基的配方为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，琼脂糖17g，蒸馏水 IOOOmL, pH=7.1 7.3。
5.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中牛肉膏和蛋白胨培养基为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，蒸馏水IOOOmL, pH=7.2 7.5。
6.根据权利要求1所述的一种抗生素药`物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中红霉素梯度投加浓度依次为10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中无机培养基为 Κ2ΗΡ044.35g，KH2PO4L 7g，NH4C12.lg, MgSO40.2g，MnSO40.05g, FeSO4 *7H200.0lgjCaCl2 *2H200.03g，蒸馏水 IOOOmL, pH6.8 7.0，红霉素 20 50mg/Lo
8.根据权利要求1所述的一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)所得的降解菌剂可应用于污水处理和水源水处理领域。
全文摘要
本发明涉及一种抗生素药物红霉素高效降解菌剂的制备方法，包括(1)活性污泥接入培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；驯化后，静置，取上层水样，梯度稀释后采用涂布分离法和平板划线法分离，然后再进行培养、纯化，将分离出的菌株接种至牛肉膏和蛋白胨培养基中，振荡培养至其处于对数生长期；(2)将上述培养所得的菌株接入培养基中培养，即得。本发明的制备方法简单易行、安全性高、成本低；所得的红霉素降解菌剂使用方便，能够高效降解抗生素药物红霉素，而且菌株易于灭活，能够应用于水处理中红霉素的有效去除。
文档编号C12R1/40GK103224899SQ20131014881
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月25日 优先权日2013年4月25日
发明者高品, 黄圣琳, 何梦琦, 李侃竹, 王宇晖, 薛罡, 刘亚男, 刘振鸿, 张慧芬, 刘畅, 吴立乐, 刘路, 石为民 申请人:东华大学, 上海三伊环境科技有限公司