专利名称：利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是高磷吸收效率小麦植株的培育方法。
背景技术：
小麦作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人口以其为主食。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高小麦单位面积产量仍是人们面临的挑战。磷是作物生长发育所必需三大营养元素之一，是继氮之后为植物体所吸收的第二大营养元素，它不仅涉及到生物膜及核酸的合成，同时在能量代谢和酶的调控上扮演重要的角色。但由于土壤中的磷大部分被其中的镁、铁、铝氢氧化物及钙盐所固定或被土壤胶体吸附而成为无效态(难溶性)，以及磷有机复合体的形成，使得世界上30% -40%耕地的有效磷含量不能满足植物体正常生长发育的需要。即使施以磷肥，磷肥的当季利用率也只有10% 25%。因此，磷缺乏成为限制作物产量重要的因素之一。大量施用磷肥是解决土壤缺磷问题、维持和提高产量的传统途径，然而却造成了资源浪费、环境污染、农业生产成本增加等系列问题。更为严峻的是，磷肥的主要来源磷矿石，是一种不可再生资源。据估计我国高品质磷矿资源可用年度不足10年。因此，改造植物基因型是提高植物吸收利用磷效率的一条行之有效途径。发掘作物自身磷高效利用的潜力、选育磷高效作物品种、提高磷肥利用率，是改善作物磷素营养状况、减少磷肥施用、生物修复土壤污染、提高作物产量的更为经济、环保、长远的途径。植物对磷吸收利用是一个复杂的过程，为了提高植物对土壤中磷的利用效率，植物在进化过程中形成了许多适应机制:如扩大根系面积来增加对土壤磷的利用；通过和菌根形成共生关系获取磷元素；植物还通过调节新陈代谢来保持磷的动态平衡；同时植物为了适应低磷条件还通过调控基因的表达水平，包括上调磷饥饿诱导基因以及下调新陈代谢相关的基因，如一些光合作用相关基因来维持生长发育；植物甚至通过分泌磷酸酶、核酸酶以及有机酸促进吸收 土壤中的磷。光合作用产生的糖物质类是植物能量代谢和复杂碳水化合物生物合成的底物。近年来的研究表明蔗糖和葡萄糖等作为重要的信号分子，在植物响应生物和非生物胁迫中具有重要的调控作用(Rolland etal.，2006)。在多种植物(如拟南芥，大麦，菠菜和大豆)中研究表明，磷饥饿条件下，会增加叶片中蔗糖的生物合成，增加蔗糖浓度是植物对低磷胁迫的早期响应(HammondandWhite, 2008)。增加鹿糖向韧皮部的装载不仅有利于碳源向根部再分配，促进形成大根系，而且还可能激发糖信号转导，调控参与根系磷吸收和转运相关基因的表达。研究表明，植物生长在黑暗无外源蔗糖的条件下，严重降低了 PSI(Pistarvation-1nduced)基因的表达,但在暗生长条件下补充外源鹿糖,PSI基因能维持较高的表达水平。这些研究结果揭示，蔗糖在植物响应低磷胁迫中可能担当着重要的信号分子作用。植物体内蔗糖的转运是有蔗糖转运蛋白来完成的，蔗糖转运蛋白基因是否参与调控植物对磷的吸收和利用，目前在国内外尚未有研究结果报道。有关蔗糖转运蛋白基因已有很多报道，但其研究重点尚停留在其表达模式和基因参与糖的吸收和运输功能方面，并无关于TaSUT2在小麦整株中表达提高小麦植株对根际有限的土壤中有效态无机磷的吸收的技术方案的相关技术报道。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，通过超量表达TaSUT2基因，使转基因小麦出现提高磷吸收效率和增强低磷响应的表型，发掘该基因的新功能应用，应用于小麦磷高效育种中，减少磷肥施用，降低农业生产成本，提高作物产量，有利于生态保护环境。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其步骤包括:
A、TaSUT2基因全长cDNA的克隆
A-1、小麦cDNA的获取:提取小麦苗期的叶片总RNA，以2 ii g总RNA为模板，采用M-MLV逆转录酶以OligodT引物进行逆转录获得cDNA ；
A-2、使用水稻和玉米的蔗糖转运蛋白基因氨基酸序列在小麦EST数据库中进行小麦SUT基因电子克隆的同源检索，将检索到的与之有高度同源性的EST序列用Bioedit中的CAP程序进行第一次电子延伸，得到第一个重叠群；以此序列为探针再进行NCBI的BLASTn检索，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出，重叠群不能延伸为止；利用ORFfinder程序预测拼接序列的开放阅读框0RF，在预测的ORF两侧设计特异引物，上游:SEQIDN0:2，TCCCCCGGGGGAGACGCGCCGTAGAGTTGATAG.下游:SEQIDN0:3，CGAGCTCGTCAC-AACCCAAAGACGACACC, h游和下游分别添加Smal、SacI酶切位点和保护碱基;
A-3、以反转录合成的cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增，扩增出TaSUT2基因的编码区；取5 y LRT-PCR产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；将胶回收的DNA片段连接到pMD19-TVeCtor上，转化大肠杆菌JM109菌株，AMP抗性筛选，筛选阳性克隆，酶切鉴定片段大小后测序，测序结果如序列表中SEQIDN0:1所示的TaSUT2基因的cDNA序列，获得正确的克隆片段；
B、超表达载体的构建
B-1、用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体PAHC25，电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除⑶S基因的pAHC25载体；`
B-2、将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到pAHC25载体上；
B-3、将连接体系转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞中，选取阳性克隆重组转化子，提取纯化质粒，进行SmaI和SacI双酶切重组质粒，37°C酶切3h后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到片段的大小，初步判断是否得到了重组质粒，同时经胶回收进一步测序验证，以鉴定构建的转基因表达载体pAHC25-TaSUT2的正确性；该载体中TaSUT2基因表达受Ubiqutin启动子控制，另外还具有I个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒,可作为抗除草剂双丙氨磷的筛选标记；
C、转基因小麦的获得
将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株；D、转基因小麦后代鉴定转化小麦品种得到转基因单株TO代植株，用PCR检测获得阳性转基因小麦，用荧光定量PCR检测目的基因在植株体内的表达量，得到超表达的植株，并且进行自交繁种，每代都进行PCR追踪检测，确保目的基因的稳定遗传，得到T3和T4代稳定转基因株系。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A-3中PCR反应条件为:95°C 2min,98°C 10s，54°C 30s, 72°C 2min，反应 30 个循环，72°C延伸 lOmin。作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-2中采用的连接体系为:ddH201.7yL，10XT41igasebufferl μ L, TaSUTl 酶切产物 4 μ L，pAHCVector2.5 μ L, T41igase0.8 μ L,23°C 连接 2-4h。作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-3中双酶切时采用的酶切体系为:10Xbuffer42 μ L, ddH208 μ L,质粒 8 μ L，BamHIHF0.9 μ L, KpnIhf0.9 μ L，BSA0.2 μ L,Totalvolume20μ L0作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中基因枪介导的小麦遗传转化步骤包括:将正确连接目的基因的质粒和带有Bar基因的pAHC25载体用基因枪轰击的方法转化小麦的幼胚，同时设置转入PAHC25空载体为对照，经过幼胚诱导、高渗培养、打枪和恢复培养等过程，将转化后的小麦幼胚愈伤置于含有双丙氨磷的筛选培养基上进行分化筛选，具有除草剂抗性的幼芽伸长、生根、练苗移栽，得到TO代转基因植株。作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中采小麦品种科农199进行转化，具体操作步骤为:取小麦品种科农199开花后12-14d的未成熟种子，用10%次氯酸钠消毒处理15min后，清水洗净，在无菌条件下剥出幼胚，盾片组织向上置诱导培养基上，每个培养皿接种约60-80个幼胚，置2 2°C、黑暗条件下预培养3-4d后，转到高渗培养基上培养4_6h后，进行基因枪轰击，16-18h后转到恢复培养基上培养2-3周；再转到5mg/LPPT选择压力下的分化培养基上培养6-8周，幼芽生长到至少2-4cm长时进行生根培养，当茎长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，用自来水冲洗根部以去除培养基；将苗移植到一个装有基质的盆中，苗在培养箱中生长2-3周，24°C，18/6hr光照强度，每周浇Hoagland营养液一次，然后将苗转移到温室培养至结实成熟。作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，转基因植株PCR检测的上游引物为:SEQIDN0:4，GATCTCCAAGCGCCAGTTC,下游引物为:SEQIDN0:5，TATATGATAATCATCGCAAGACC,反应条件为 940C 5min，94°C 50s, 53°C 40s, 72°C 35s，32 个循环，72°C延伸 7min。采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明通过超量表达TaSUT2基因，使转基因小麦出现提高磷吸收效率和增强低磷响应的表型，证实了该基因一个新的功能应用；本基因的克隆和转基因运用，有望应用于小麦磷高效育种中，减少磷肥施用、降低农业生产成本，提高作物产量，还有利于生态环境的保护。本发明有益效果试验验证参见实施例的步骤6部分。
图1:实施例步骤4中，TO代TaSUT2转基因植物的PCR检测(I为空白对照，2为阴性对照，3为阳性对照，4-8为转基因样品，4为0ESUT-1，5为0ESUT_2，6为0ESUT_3，M为Marker)。图2:实施例步骤4中，T3代TaSUT2转基因后代的PCR检测(I为空白对照，2_11为0ESUT-2-2-16后代全部单株，12为阳性对照，13为阴性对照，M为Maker)。图3:实施例步骤5中，定量RealtimePCR分析低磷胁迫下T2代转基因系中TaSUT2的表达量。图4:实施例步骤6 (I)中，T4代转基因株系在不同磷水平处理5d叶片的光合速率。图5:实施例步骤6 (I)中，T4代转基因株系在不同磷水平处理5d叶片和根系中蔗糖的含量(A为正常供磷水平，B为低磷水平)。图6:实施例步骤6 (3)中，不同供磷水平下转基因小麦植株磷吸收量。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。·本发明中培养基及所用到的试剂为常规市售产品，具体配方如下:1) MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照20X浓缩液配制):硝酸铵(NH4N03) 33.0 克硝酸钾(KN03) 38.0 克磷酸二氢钾(KH2P04) 3.4 克硫酸镁(MgS04.7H20) 7.4 克氯化钙(CaCl2.2H20) 8.8 克将上述试剂在20 25°C温度下用适量蒸馏水溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。2) 1/2MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照20X浓缩液配制):硝酸铵(NH4N03)16.5 克硝酸钾(KN03)19.0 克磷酸二氢钾(KH2P04) I.7 克硫酸镁(MgS04.7H20) 3.7 克氯化钙(CaCl2.2H20) 4.4 克将上述试剂在20 25°C温度下用适量蒸馏水溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。3) MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照200X浓缩液配制):硫酸锰(MnS04.4H20) 4.46 克硫酸锌(ZnS04.7H20) L 72 克硼酸(H3B03)1.24 克碘化钾(KI)0.166 克钥酸钠(Na2Mo04.2H20) 0.05 克硫酸铜(CuS04.5H20) 0.005 克氯化钴(CoCl2.6H20) 0.005 克将上述试剂在20 25°C温度下用适量蒸馏水溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。4)铁盐(Fe2+EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制):将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA.2H20)和2.78克FeS04.7H20分别用蒸馏水溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，置70°C温水浴2小时，4°C保存备用。5)主要激素、氨基酸和筛选剂配方:lmg/mL 吲哚乙酸 IAA 贮备液:0.0125 克 IAA + 0.25mLlNNa0H + 12.25mL 双蒸水，过滤灭菌，4 °C保存；0.5mg/mLNAA 忙备液:0.005 克 NAA + 0.2mLNa0H + 9.8mL 双蒸水，过滤灭菌，4°C
保存；lmg/mL玉米素核苷贮备液:10毫克玉米素+ IOmL双蒸水，过滤灭菌，一 20°C保存；lmg/mL 除草剂I&备液:0.025 克 Bialaphos (PPT) + 25mL 双蒸水，过滤灭菌，4°C
保存；2mg/L2，4-D贮备液:20毫克2，4-D粉末+ 1OmL双蒸水，过滤灭菌，一 20°C保存。6)诱导和恢复培养基:MS母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)50毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升2，4_D贮存液1毫升蔗糖30克Phytagel3 克加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.8，高压灭菌，1211:下灭菌20分钟，下述的培养基灭菌方法与本实施例相同。7)高渗培养基:MS母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)50毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升2，4_D贮存液1毫升蔗糖30克甘露醇91.1克Phytagel3 克加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到5.9，高压灭菌，1211:下灭菌20分钟，下述的培养基灭菌方法与本实施例相同。8)分化筛选培养基:1/2MS母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)50毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升ZT贮存液1毫升IAA贮存液1毫升PPT贮存液5毫升蔗糖30克Phytage 13 克加蒸馏水至1000毫升，1N氢氧化钠调节pH值到6.0，高压灭菌，121°C下灭菌20分钟，下述的培养基灭菌方法与本实施例相同。9)生根培养基:
1/2MS母液(取已经制备好的20X浓缩液，下同)50毫升Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升NAA贮存液I毫升PPT贮存液4毫升蔗糖30克PhytageI3 克加蒸馏水至1000毫升，IN氢氧化钠调节pH值到6.0,高压灭菌，121°C下灭菌20分钟。实施例1 1、TaSUT2基因全长cDNA的克隆小麦cDNA的获取:提取小麦石家庄8号苗期的叶片总RNA，以2 μ g总RNA为模板，按M-MLV逆转录酶说明书,使用Oligo (dT)引物进行逆转录获得cDNA。使用水稻和玉米的蔗糖转运蛋白基因氨基酸序列在小麦EST数据库中进行小麦SUT基因电子克隆的同源检索，将检索到的与之有高度同源性的EST序列用Bioedit中的CAP(COntigaSSemblyprogram)程序进行第一次电子延伸，得到第一个重叠群。以此序列为探针再进行NCBI的BLASTn检索，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出，重叠群不能延伸为止。并利用ORFfinder程序预测拼接序列的开放阅读框(ORF)，在预测的ORF两侧设计特异引物，上游:SEQIDN0:2，TCCCCCGGGGGAGACGCGCCGTAGAGTTGATAG.下游:SEQIDN0:3，CGAGCTCGTCAC-AACCCAAAGACGACACC, h游和下游分别添加Smal、SacI酶切位点和保护碱基。以反转录合成的cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司，编号R010Q)进行PCR扩增，扩增出TaSUT2基因的编码区，PCR 反应条件为:95°C 2min,98°C 10s, 54 °C 30s, 72 °C 2min,反应 30 个循环，72 °C 延伸IOmin ;取5 μ LRT-PCR产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将胶回收的DNA片段连接到pMD19-TVector (购买于宝生物工程(大连)有限公司，产品序列号D102A)上，转化大肠杆菌JM109菌株，AMP抗性筛选，筛选阳性克隆，酶切鉴定片段大小后测序，测序结果如序列表中SEQIDN0:1所示的TaSUT2基因的cDNA序列，获得正确的克隆片段。2、超表达载体的构建用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体PAHC25，PAHC25载体由中国科学院遗传与发育生物学研究所王道文博士提供。(参考文献:RitaAbranches, Ana P.Santos, EvaffegeI, Sarahffi11iams, AlexandraCastilho, PauI Christou, PeterShaw, EvaStoger.Widelyseparatedmultiple transgeneintegrationsitesinwheatchromosomesarebrought togetheratinterphase.ThePlantJournal (2000)24(6)，713-723。)电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除⑶S基因的pAHC25载体，将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到PAHC25载体上，连接体系为:ddH201.7 μ L，10XT41igasebufferl μ L, TaSUTl 酶切产物 4 μ L，pAHCVector2.5 μ L, T41igase0.8 μ L,23°C连接3h左右。将连接体系转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，选取阳性克隆重组转化子，提取纯化质粒，进行SmaI和Sac I双酶切重组质粒，酶切体系:10XbufTer42 μ L，ddH208 y L，质粒 8μ L，BamHIHF0.9μ L，KpnIHF0.9μ L，BSA0.2μ L，Total volume20y L0 37°C酶切3h后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到片段的大小，初步判断是否得到了重组质粒，同时经胶回收进一步测序验证，以鉴定构建的转基因表达载体pAHC25-TaSUT2的正确性。该载体中TaSUT2基因表达受Ubiqutin启动子控制，另外还具有I个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，可作为抗除草剂双丙氨磷(Bialaphos，PPT)的筛选标记。3、转基因小麦的获得将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株。其中:基因枪介导的小麦遗传转化步骤为:将正确连接目的基因的质粒和带有Bar基因的pAHC25载体用基因枪轰击的方法转化小麦品种科农199的幼胚，同时设置转入PAHC25空载体为对照，经过幼胚诱导、高渗培养、打枪和恢复培养等过程，将转化后的小麦幼胚愈伤置于含有双丙氨磷的筛选培养基上进行分化筛选，具有除草剂抗性的幼芽伸长、生根、练苗移栽，得到TO代转基因植株。更具体的试验操作方法为:取科农199开花后12-14d的未成熟种子，用10%次氯酸钠消毒处理15min后，清水洗净，在无菌条件下剥出幼胚，盾片组织向上置诱导培养基上，每个培养皿接种约60-80个幼胚，置22°C、黑暗条件下预培养3-4d后，转到高渗培养基上培养4-6h后,进行基因枪轰击，16-18h后转到恢复培养基上培养2_3周；再转到5mg/LPPT选择压力下的分化培养基上培养6-8周，幼芽生长到至少2-4cm长时进行生根培养，当茎长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，用自来水冲洗根部以去除培养基。将苗移植到一个装有基质的盆(直径19cm)中，苗在培养箱中生长2-3周(24°C，18/6hr光照强度)，每周浇Hoagland营养液一次，然后将苗转移到温室培养至结实成熟。4.转基因小麦后代鉴定转化小麦品种科农199，得到转基因单株TO代植株，用PCR检测获得阳性转基因小麦，用荧光定量PCR检测目的基因在植株体内的表达量，得到超表达的植株，并且进行自交繁种每代都进行PCR追踪 检测，确保目的基因的稳定遗传，得到T3和T4代稳定转基因株系O转基因植株PCR检测上游引物:SEQIDN0:4，GATCTCCAAGCGCCAGTTC,下游引物:SEQIDNO:5, TATATGAT AATCATCGCAAGACC,反应条件为 94 °C 5min，94 °C 50s, 53 °C 40s,72°C 35s, 32 个循环，72°C延伸 7min。结果参看附图1、2 ;验证获得了稳定的转基因植株。5.在低磷胁迫24h后，TaSUT2在对照和不同转基因株系的根叶组织中的表达量试验。应用primerexpress3.0软件设计特异性的引物，β-actin上游引物SEQIDN0:6，TTGTGCTCGACTCTGGTGATG，下游引物 SEQIDN0:7，CAAGGTCCAAACGAAGGATAGC ;TaSUT2上游引物 SEQIDN0:8，GCGTTGGGCTCTACAGTGACA,下游引物 SEQIDN0:9，CACGACAGCAATGCAGATGAG ;利用美国Bio-RadIcycleriQ5进行实时定量PCR分析，PCR的温度循环设计为:5(TC 2min — 95°C 2min — 95°C 15s,60°C 30s,45 个循环。试验结果参见附图3，验证低磷胁迫下T2代转基因系中TaSUT2的高表达特性。6、超表达TaSUT2的转基因植株的功能鉴定将T4代转基因小麦和野生型对照小麦种子用蒸馏水萌发后，在人工气候箱里，用l/2Hoagland营养液培养到两片叶展开，然后将不同小麦苗分为两半，一半进行正常供磷处理，一半用蒸馏水冲洗根系后进行低磷处理。测定小麦稳定转基因株系叶片的光合作用、叶片和根系中蔗糖的含量、生物量、磷吸收量以及总根长和侧根数，发现转基因植株和对照小麦植株相比，表现出期望的表型变化，即转基因株系明显提高光合作用(图4)，增加了光合产物蔗糖的积累和向根系的转运分配(图5)，总根长和根表面积显著高于对照(表1)，生物量和磷吸收量也高于对照(图6)。证明了这个基因可以通过本发明遗传转化方法实现改变根系形态构型来提高小麦植株对介质中磷的吸收效率，这与其他研究者之前研究该基因的作用机理显著不同，本发明所述基因是通过促进根系生长，增加根系接触到的土壤面积，从而增加根系吸收的土壤中有效态无机磷的量。(I)光合作用和根、叶组织蔗糖含量的测定用L1-Cor6400X便携式光合仪(美国，基因公司)测定不同磷水平处理5d的野生型对照和转基因系新展开叶的光合速率，每处理重复测定10片叶子。采集测过光合作用的叶片，称鲜重后，用液氮研磨，然后加入80%的乙醇在80°C下浸提40min，离心取上清为糖份粗提取液，将此糖份粗提取液在沸水浴下蒸干，再用蒸馏水溶解，按照蔗糖试剂盒(Biosentec, France)说明测定鹿糖含量。试验结果参见附图4、5。(2)总根长测定在不同磷水平下处理15d后，将整个根系从营养液中取出，洗净后，用台式扫描仪扫描二维根系，经WinRhizo软件分别计算总根长、根表面积等形 态参数。试验结果参见表I。表1T4代稳定转基因小麦系在不同磷水平下的生物量和根系生长表现结果
权利要求
1.利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征步骤包括: A、TaSUT2基因全长cDNA的克隆 A-1、小麦cDNA的获取:提取小麦苗期的叶片总RNA，以2 μ g总RNA为模板，采用M-MLV逆转录酶以OligodT引物进行逆转录获得cDNA ； A-2、使用水稻和玉米的蔗糖转运蛋白基因氨基酸序列在小麦EST数据库中进行小麦SUT基因电子克隆的同源检索，将检索到的与之有高度同源性的EST序列用Bioedit中的CAP程序进行第一次电子延伸，得到第一个重叠群；以此序列为探针再进行NCBI的BLASTn检索，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出，重叠群不能延伸为止；利用ORFfinder程序预测拼接序列的开放阅读框0RF，在预测的ORF两侧设计特异引物，上游:SEQIDN0:2，TCCCCCGGGGGAGACGCGCCGTAGAGTTGATAG.下游:SEQIDN0:3，CGAGCTCGTCAC-AACCCAAAGACGACACC, h游和下游分别添加Smal、SacI酶切位点和保护碱基; A-3、以反转录合成的cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增，扩增出TaSUT2基因的编码区；取5 μ LRT-PCR产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；将胶回收的DNA片段连接到pMD19-TVeCtor上，转化大肠杆菌JM109菌株，AMP抗性筛选，筛选阳性克隆，酶切鉴定片段大小后测序，测序结果如序列表中SEQIDN0:1所示的TaSUT2基因的cDNA序列，获得正确的克隆片段； B、超表达载体的构建 B-1、用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体pAHC25，电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除⑶S基因的pAHC25载体； B-2、将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到pAHC25载体上； B-3、将连接体系转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞中，选取阳性克隆重组转化子，提取纯化质粒，进行SmaI和SacI双酶切重组质粒，37°C酶切3h后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到片段的大小，初步判断是否得到了重组质粒，同时经胶回收进一步测序验证，以鉴定构建的转基因表达载体pAHC25-TaSUT2的正确性；该载体中TaSUT2基因表达受Ubiqutin启动子控制，另外还具有I个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒,可作为抗除草剂双丙氨磷的筛选标记； C、转基因小麦的获得 将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株。
2.根据权利要求1所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:获得转基因小麦之后继续如下后续操作: D、转基因小麦后代鉴定 转化小麦品种得到转基因单株TO代植株，用PCR检测获得阳性转基因小麦，用荧光定量PCR检测目的基因在植株体内的表达量，得到超表达的植株，并且进行自交繁种，每代都进行PCR追踪检测，确保目的基因的稳定遗传，得到T3和T4代稳定转基因株系。
3.根据权利要求1所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤 A-3 中 PCR 反应条件为:95°C 2min,98°C 10s，54°C 30s, 72°C 2min，反应 30个循环，72°C延伸IOmin。
4.根据权利要求1所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤B-2中采用的连接体系为:ddH201.7iiL，10XT41igasebufferliiL，TaSUTl酶切产物 4u L, pAHC Vector2.5 u L, T41igase0.8 u L, 23。。连接 2_4h。
5.根据权利要求1所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤B-3中双酶切时采用的酶切体系为:10Xbuffer42iiL，ddH208 iiL，质粒8 u L, BamHIHF0.9 y L, KpnIHF0.9 y L, BSA0.2 y L, Totalvolume20 u L。
6.根据权利要求1所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤C中基因枪介导的小麦遗传转化步骤包括:将正确连接目的基因的质粒和带有Bar基因的pAHC25载体用基因枪轰击的方法转化小麦的幼胚，同时设置转入pAHC25空载体为对照，经过幼胚诱导、高渗培养、打枪和恢复培养等过程，将转化后的小麦幼胚愈伤置于含有双丙氨磷的筛选培养基上进行分化筛选，具有除草剂抗性的幼芽伸长、生根、练苗移栽，得到TO代转基因植株。
7.根据权利要求6所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤C中采小麦品种科农199进行转化，具体操作步骤为:取小麦品种科农199开花后12-14d的未成熟种子，用10%次氯酸钠消毒处理15min后，清水洗净，在无菌条件下剥出幼胚，盾片组织向上置诱导培养基上，每个培养皿接种约60-80个幼胚，置22°C、黑暗条件下预培养3-4d后，转到高渗培养基上培养4-6h后，进行基因枪轰击，16-18h后转到恢复培养基上培养2-3周；再转到5mg/LPPT选择压力下的分化培养基上培养6_8周，幼芽生长到至少2-4cm长时进行生根培养，当茎长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，用自来水冲洗根部以去除培养基；将苗移植到一个装有基质的盆中，苗在培养箱中生长2-3周，24°C，18/6hr光照强度，每周浇Hoagland营养液一次，然后将苗转移到温室培养至结实成熟。
8.根据权利要求2所述的利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征在于:步骤D中，转基因植株PCR检测的上游引物为:SEQIDN0:4，GATCTCCAAGCGCCAGTTC,下游引物为:SEQID NO:5, TATATGATAATCATCGCAAGACC，反应条件为94°C 5min，94°C 50s, 5 3°C 40s, 72°C 35s, 32 个循环，72°C延伸 7min。
全文摘要
本发明公开了一种利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其步骤包括A、TaSUT2基因全长cDNA的克隆；B、超表达载体的构建B-1、用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体pAHC25，电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除GUS基因的pAHC25载体；B-2、将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到pAHC25载体上；B-3、将连接体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；C、转基因小麦的获得将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株。本发明通过超量表达TaSUT2基因，使转基因小麦出现提高磷吸收效率和增强低磷响应的表型，发掘了该基因的新功能应用方向。
文档编号C12Q1/68GK103194458SQ20131014901
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者胡梦芸, 李辉, 庞建周, 李倩影, 张颖君, 刘茜 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所