一种高效水解大豆异黄酮糖苷的β-葡萄糖苷酶基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型β-葡萄糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。它的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明还公开了含上述新型β-葡萄糖苷酶的表达载体，及重组β-葡萄糖苷酶及其在高效水解大豆异黄酮糖苷中的应用。该新型重组β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，该酶的最适反应温度和最适pH分别为45℃和pH6.0，具有良好的热稳定性和较宽的pH酶解范围。同时该酶对大豆苷、染料木苷具有高效的水解作用，水解效率为100%。
【专利说明】—种高效水解大豆异黄酮糖苷的葡萄糖苷酶基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种3 -葡萄糖苷酶新基因，尤其涉及一种高效水解大豆异黄酮糖苷的@ -葡萄糖苷酶基因及其重组酶和重组酶的应用，属于基因工程领域。
【背景技术】 [0002]P -葡萄糖苷酶(P -glucosidase)属于糖苷水解酶家族,又称P -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(3-D-glucoside glucohydrolase ；EC3.2.1.21), 一方面,该酶可以催化水解
糖苷键，释放出葡萄糖和相应的糖苷配基。另一方面，该酶还能催化转糖苷缩合反应，合成低聚糖。研究发现，游离型的大豆异黄酮糖苷才能发挥其生物活性，3 -葡萄糖苷酶在催化水解结合型糖苷产生游离型糖苷方面具有重要作用，显著提高异黄酮糖苷的水解效率，从而为工业上大批量生产高活性大豆异黄酮苷元产品提供捷径。在纤维素降解过程中，葡萄糖苷酶可以与其他几种纤维素降解酶协同作用，将纤维素降解为葡萄糖，后者经微生物发酵作用即可产生燃料乙醇等能源物质。在食品行业中，该酶能够利用3 -葡萄糖苷酶水解风味前体物质3 -糖苷以释放出风味活性物质糖苷配基，从而增强葡萄酒、果汁和茶叶等产品的香气。另外，在医药领域中，可通过检测人体血清中(6-葡萄糖苷酶活性的高低来判断是否患有乳腺癌。因此，3 -葡萄糖苷酶在生产有活性大豆异黄酮苷元、能源、食品及医药等领域具有重要应用价值。
[0003]大豆异黄酮主要有12种化学成分，大豆苷元、染料木素和黄豆黄素3种游离型异黄酮苷元以及它们和丙二酰基葡糖糖、乙酰基葡萄糖、葡萄糖以3 -葡萄糖苷键的方式结合成的9种异黄酮糖苷组成。大豆异黄酮具有抗肿瘤、扩张血管和抗氧化等作用，同时还可预防骨质疏松症和妇女更年期综合症等疾病，因此，受到越来越多国内外消费者的青睐。研究表明，大豆苷元、染料木素和黄豆黄素3种游离型异黄酮苷元是大豆异黄酮发挥生物活性功能的主体，而占大豆异黄酮总量80%~99%的9种结合型糖苷则无生物活性。这些异黄酮糖苷只有被水解为游离型的苷元后才能被小肠壁吸收，发挥其生物活性作用，但大豆自身含有的内源性P -葡萄糖苷酶的酶活性很低，只能水解22%~29%的异黄酮糖苷，因此，在豆制品中添加高活性的3-葡萄糖苷酶以提高异黄酮糖苷水解效率在食品工业中具有重要意义。
[0004]目前，已经从不同微生物中分离出来多种(6-葡萄糖苷酶，主要包括里氏木霉(Trichoderma Reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、斜臣卜青霉(Penincilliumdecumbens)、土曲霉(Aspergillus terreu)、多粘性芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)、链霉菌(Streptomyces)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等。鉴于传统的微生物分离培养技术分离出的3-葡萄糖苷酶在酶的活性、稳定性、底物特异性等方面存在各式各样的差异，以及环境中99%的微生物是不可培养的，所以，为了适应不断发展的、不同领域的工业应用，迫切需要从自然界中挖掘和鉴定具有新特性的(6-葡萄糖苷酶。
[0005]宏基因组学(Metagenomics)是一种不依赖于微生物的分离培养,直接以特定生态环境中微生物群体基因组总和作为研究对象，同时利用序列分析和功能筛选作为研究手段，构建宏基因组文库从而筛选出新的基因及生理活性物质。宏基因组技术作为一种新兴学科领域，在很大程度上促进了环境微生物资源的利用，特别是未培养微生物资源的开发利用。因此该方法为发现更多的新型(6-葡萄糖苷酶提供了有效途径。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中获得具有高效水解大豆异黄酮糖苷性质的新型葡萄糖苷酶的研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于提供一种(6-葡萄糖苷酶的新基因。
[0007]本发明的第二个目的在于提供上述(6-葡萄糖苷酶的宏基因组学克隆方法。
[0008]本发明的第三个目的在于提供上述新型(6-葡萄糖苷酶的DNA表达载体。
[0009]本发明的第四个目的在于提供一种由上述表达载体转化细胞而获得的基因工程菌。
[0010]本发明的第五个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组(6-葡萄糖苷酶及其制备方法。
[0011]本发明的最后一个目的在于提供利用上述重组(6-葡萄糖苷酶在高效水解大豆异黄酮糖苷中的应用。
[0012]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种新型(6-葡萄糖苷酶的DNA，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]本发明提供的上述新型P -葡萄糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0014]本发明的第二个目的是通`过如下技术方案来实现的:一种新型(6-葡萄糖苷酶的宏基因组学克隆方法，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经Hind III酶切，连接到克隆载体PUC118上，电击转化大肠杆菌DH5 a高效感受态建立宏基因组文库，通过涂布含七叶苷和柠檬酸铁铵的LB平板显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。
[0015]本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的:一种含有上述新型(6-葡萄糖苷酶的DNA的表达载体。
[0016]本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的:一种基因工程菌，通过如权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞而得。优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
[0017]本发明的第五个目的是通过如下技术方案来实现的:一种重组(6-葡萄糖苷酶的制备方法，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组
葡萄糖苷酶。
[0018]上述重组(6-葡萄糖苷酶的制备方法中，寄主细胞是大肠杆菌。
[0019]上述重组(6-葡萄糖苷酶的制备方法，其具体过程为:包括用上述表达载体的目的片段经Bam H1.Hind III双酶切，与pET_28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。
[0020]所述的IPTG终浓度为0.1-1.3mM,诱导温度为18_37°C。
[0021]本发明提供的重组(6-葡萄糖苷酶，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组3 -葡萄糖苷酶的方法和步骤。[0022]本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的:本发明所述重组(6-葡萄糖苷酶在高效水解异黄酮糖苷中的应用。
[0023]本发明的有益效果是:
[0024]①.本发明从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的P -葡萄糖苷酶的DNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳,得到一条单一的蛋白条带,减去融合蛋白的大小,初步确定该^ -葡萄糖苷酶的分子量约为52kDa。
[0025]②.本发明将SEQ ID N0.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下:
[0026](I)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达；
[0027](2)以对硝基苯-0 -D-吡喃葡萄糖苷(P NPG)为底物，测得该重组P -葡萄糖苷酶的最适反应温度为45°C，该酶在温度低于60°C时非常稳定，60°C保温Ih后，相对酶活保持在80%以上，70°C保温IOmin后仍有50%以上的相对酶活。表明该酶具有良好的热稳定性；该酶的最适反应PH为6.0，在pH5.5-8.5的范围内，能够保持80%以上的相对酶活，说明其具有较宽的PH酶解范围；测定金属离子和生化试剂对酶活力影响时发现，ImM Al3+与IOmM Triton X-100对重组P -葡萄糖苷酶的酶活有明显的促进作用；相反的，当反应体系中含有ImM Cu2+UOmM Tween-80时，该酶酶活受到强烈的抑制；当含稀释酶液的反应体系中分别含有 IOmM EDTAUmM FeCl3、lmM CaCl2UmM MgSO4UmM Al2 (SO4) 3、ImM MnCl2UmMZnSO4时，该P -葡萄糖苷酶的活性没有显著改变。
[0028]③.本发明在研究重组(6-葡萄糖苷酶Bgll-1l水解大豆异黄酮糖苷反应时发现，在分别含有0.5mg / mL大豆苷和染料木苷的反应体系中进行水解反应lh，经高效液相色谱(HPLC)分析，结果表明其水解速率为100%。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为实施例1中重组P -葡萄糖苷酶的SDS-PAGE电泳图；
[0030]其中，M为标准蛋白分子量maker, Linel为重组蛋白全细胞粗提物，Line2为重组蛋白上清粗提物，Line3为纯化的重组蛋白；
[0031]图2为实施例3中重组蛋白水解底物P NPG的最适温度结果折线图；
[0032]图3为实施例3中重组蛋白水解底物P NPG的热稳定性结果折线图，其中不同符号代表不同温度，5(TC (_)，55°C ( ? ),60°C ( A ) ,65°C(^) and70°C (?);
[0033]图4为实施例3中重组蛋白水解底物P NPG的最适pH结果折线图；
[0034]图5为实施例3中重组蛋白水解底物P NPG的pH稳定性结果折线图；
[0035]图6为重组蛋白水解大豆苷(daidzin)和染料木苷(genistin)的高效液相色谱(HPLC)分析结果图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
[0037]实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达
[0038]1、总DNA的提取:[0039]称取5g 样品，加入 13.5mL DNA 提取缓冲液(0.1M Tris,0.1M EDTA-Na,0.1MNa3PO4,1.5M NaCl, I % CTAB, pH 值 8.0)，剧烈震荡 3_5min，加入 200 y L 溶菌酶(IOOmg /ml)，反复颠倒5-6次，37°C水浴30min，加入1.5mL20% SDS，65°C水浴Ih (期间每隔15min上下颠倒几次)，8000r / min离心5min,取上清液,用等体积氯仿抽提2次，16000r / min离心IOmin,取上清,加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h, 20000r / min离心20min,弃上清，沉淀加5mL预冷的70%乙醇,20000r / min离心IOmin,收集DNA沉淀,风干,用适量TE缓冲液溶解。
[0040]2、试剂盒法纯化DNA:按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行。
[0041]3、宏基因组电泳检测:用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量。
[0042]4、酶切总DNA:用限制性内切酶Hind III部分酶切总DNA，回收2_10kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。
[0043]5、酶切片段的电泳检测:方法同宏基因组电泳检测。
[0044]6、酶切片段的连接:将回收得到的酶切片段和pUC118 / Bam HI (BAP)载体连接过夜，向连接产物中加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1.5h，14000r / min离心20min，弃上清并向沉淀中加入70%无水乙醇洗涤2次，风干并加入适量dd H2O重溶。
[0045]7、连接产物的转化:
[0046]吸取5iiL的连接产物加入IOOiiL的大肠杆菌DH5a高效感受态中，2500V/cm(Eppdorf2510 电击仪)电击 I 次，46°C热激 6min，37°C，180rpm 摇床培养 45_60min，吸取30-40 u L涂布于含有氨苄青霉素(100 u g / mL)、七叶苷(I U g / mL)、柠檬酸铁铵(2 y g /mL)和IPTG(ImM)的LB琼脂平板，37°C培养过夜。由此构建了一个库容量达40000个转化
子，多样性好的宏基因组文库。
[0047]8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定:将涂布后的平板至于37°C培养24_48h，由于^ -葡萄糖苷酶可以将七叶苷水解生产七叶亭，其与铁离子反应生成黑褐色沉淀，因而显黑色的菌落即为阳性克隆子。通过筛选得到一株阳性克隆子。
[0048]从平板将阳性克隆子挑出并接种至IOmL含氨苄青霉素(100 U g / mL)的LB液体培养基中，37°C、220r / min摇床培养过夜，取2mL菌体进行质粒提取，对插入片段测序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由1245个碱基组成，将其命名为Bgl 1-11，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该DNA编码的多肽，含414个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。其中SEQ ID N0.2为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3的对照图。
[0049]9、基因片段的克隆:根据测序结果设计一对引物；F1和F2，引物两端插入能插入pET-28a(+)载体的Bam HI和HindIII酶切位点，引物序列如下:
[0050]Fl 5' -TTATGGATCCATGACGGAGACGCGGGTGCCTG
[0051]F25' -TCA GAAGCTTGGTCGAGAGCGGGAGCGACGC
[0052]利用两条引物，以质粒pUC118-Bgll_ll为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如表1所示:
[0053]表1.PCT 体系
【权利要求】
1.一种(6-葡萄糖苷酶DNA，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种新型(6-葡萄糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.一种包含权利I所述的P -葡萄糖苷酶DNA的表达载体。
4.一种基因工程菌，其特征在于通过如权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞而得。
5.一种重组3 -葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是:用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组3 -葡萄糖苷酶。
6.根据权利要求5所述的重组(6-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于:将如权利要求3所述的表达载体的目的片段经及? m、Hind III双酶切，与pET-28a (+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，得到高效可溶性表达。
7.根据权利要求6所述的重组P-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是IPTG终浓度为0.1-1.3 mM，诱导温度为 18-37°C。
8.如权利要求1所述的新型(6-葡萄糖苷酶的宏基因组学克隆方法，其特征是:提取环境中的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA kAHind III酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5 a高效感受态建立宏基因组文库，通过涂布含七叶苷和柠檬酸铁铵的LB平板显色法得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。
9.权利要求2所述的重组(6-葡萄糖苷酶在水解大豆异黄酮糖苷中的应用。
10.如权利要求9所述的`应用，其特征在于所述的应用条件为pH5.5-8.5。
【文档编号】C12N15/56GK103789331SQ201310149771
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】刘玉焕, 童铃, 曹立创, 李良, 郭耿珊, 汪思迪 申请人:中山大学