专利名称：一种转基因生物培育用磁性纳米基因载体的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因生物培育用磁性纳米基因载体的制备方法和应用，该载体能介导外源基因转化动、植物细胞，可应用于转基因种质制备与新品种培育。
背景技术：
纳米粒子由于其独特的理化性质已经被广泛地应用于生物学领域。纳米材料作为基因载体有以下优点:能包裹、浓缩和保护核酸免受核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性；具有可控降解性，可以实现基因的可控释放，有效地延长作用时间；避免了使用常规病毒载体可能导致的潜在危险。纳米Fe3O4除了具备纳米材料的普遍优势外，还具有超顺磁性，在外加磁场的驱动下，使载体材料向目的细胞富集，显著地提高其作为基因载体的效率，在医学、靶向药物、基因治疗、免疫检测、固定化酶等领域已经得到广泛的研究。近年来，转基因技术在培育动植物新品种、基因诊断与治疗等方面取得了显著成果，已经引起了医学、农业以及环境等众多领域科研工作者的关注。良好的基因载体材料是成功实现转基因技术的关键性环节。目前，非病毒基因载体因低毒性、低免疫原性和操作简便等优点，克服了病毒基因载体的免疫原性等局限，成为转基因领域的研究热点。阳离子脂质体作为非病毒基因载体已经被广泛应用，但是由于其具有一定的细胞特异性，容易被血清蛋白抑制失活等原因，也限制了其应用范围。目前关于纳米Fe3O4的制备主要有共沉淀法、高温分解法、微乳液法和水热法等。目前虽然已经有很多文献报道了高质量、分散性好的Fe3O4纳米粒子的制备方法，但是这类材料大多都不能直接应用于动物细胞基因转化，因为这些Fe3O4的磁性纳米粒子普遍存在生物兼容性不好、载体容量低、磁性不稳定等问题，因而导致转化效率低。徐宇虹在专利申请CN101748150A中报道了 “直接复合PEI的基因载体的制备方法”，其利用Fe304/PEI为载体、携带pGL_3control质·粒转化C0S-7细胞。本发明提供了一种新型基因载体的制备方法及其应用，该基因载体能介导外源基因转化动、植物细胞。
发明内容
本发明首先提供一种转基因生物培育用磁性纳米基因载体的制备方法，包括，步骤A，制备纳米Fe3O4溶胶:按物质的量之比为I 3:1称取铁盐和亚铁盐并加入稀酸溶液中，溶解搅拌后向其中加入弱碱溶液使得溶液PH值呈碱性，继续搅拌至反应结束，用酸中和溶液pH值至6 8 ;前述制备过程在氮气或氩气保护下进行；将反应体系固液分离，反复清洗固体以除去稀酸中带入的阴离子；所得固体中加入去离子水或乙醇，充分搅拌至均匀分散，然后加入H2O2并加热至70 100°C反应2 24h，得到棕色透明状溶液，即为纳米Fe3O4溶胶；步骤B，配制PE1-CH2Cl2溶液:取PEI和十二烷基硫酸钠加入到CH2Cl2溶液中，配成PE1-CH2Cl2溶液；步骤C，复合:将上述纳米Fe3O4溶胶加入PE1-CH2Cl2溶液中，进行复合反应；步骤D，清洗和干燥:步骤C得到的复合溶液固液分离后，固相中加入乙醇或去离子水洗涤以除去磁性纳米Fe304/PEI表面残留的CH2Cl2和PEI，回收沉淀物并冷冻干燥，得到PEI包膜的纳米Fe304/PEI粒子即所述磁性纳米基因载体。在本发明方法中，步骤C中复合反应例如为在常温下反应0.3 3h。本发明所述方法制备得到的磁性纳米基因载体具有顺磁性，在磁场的驱动下，能携带外源目的基因进行定向驱动。与传统转基因载体相比，本发明能实现大片段DNA的定向传输，缩短转化时间，大大提高转化效率。在上述制备方法中，优选所述步骤D中还包括在洗净纳米粒子表面残留的CH2Cl2和PEI后，将纳米Fe304/PEI粒子重新分散于乙醇或去离子水中，向其中加入荧光物质，充分反应后在粒子表面形成荧光物质层，冷冻干燥后得到带荧光层的磁性纳米基因载体。载体上荧光层的存在，使得外源基因中不必携带荧光蛋白的表达基因，仍然能使得外源基因在动物细胞中转化效果和效率的检测能方便地进行。所述荧光物质例如为选自红色荧光蛋白RFP、绿色荧光蛋白GFP、荧光色素、荧光量子点中的一种或多种；更优选所述荧光物质为RFP 和 / 或 GFP。本发明还提供一种按照上述方法制备得到的磁性纳米基因载体在动物细胞或植物细胞转化中的应用。例如，所述动物细胞包括动物成纤维细胞、胚胎干细胞和精子细胞；所述植物细胞包括原生质体、体细胞和花粉。在上述应用中，优选的是，所述磁性纳米基因载体与外源基因相连后、在0.1
0.6T的外源磁场驱动下转化动物细胞或植物细胞，优选所述磁性纳米基因载体通过静电相互作用或化学偶联作用与外源基因相连。其中，更优选的是，载体粒子通过静电相互作用与外源基因相连；静电相互作用的连接更有利于在细胞内外源基因转化后载体的解离。在上述应用中，优选所述外源基因中含荧光蛋白基因，能实现荧光蛋白的表达；如此外源基因在转化检测时并不需要其载体具有荧光物质层。本发明应用中，具体地，所述磁性纳米基因载体具有超顺磁性，且其粒径为10 500nm ;所述外源基因为DNA或RNA，所述外源基因为单基因或多基因。在本发明中，更为优选的是，所述磁性纳米基因载体与外源基因的质量比为2:1 1:2，最优选1:1。本发明还提供一种转基因生物培育用磁性纳米基因载体在转化动物细胞或植物细胞中的应用，其中，所述磁性纳米基因载体为Fe304/PEI粒子，所述磁性纳米基因载体与外源基因相连后、在0.1 0.6T的外源磁场驱动下转化动物细胞或植物细胞。优选的是，所述磁性纳米基因载体为在Fe304/PEI粒子表面形成有荧光物质层的粒子。在上述进入动物细胞的方法中，优选所述动物细胞为猪胎儿成纤维细胞或精子细胞，优选所述外源基因为pEGFP-Nl质粒DNA，所述方法包括如下步骤，制备纳米Fe304/PEI/pEGFP-Nl复合体:分别将pEGFP-Nl质粒DNA和载体Fe304/PEI粒子稀释于培养液中，轻轻混匀；转化:将纳米Fe304/PEI/pEGFP_Nl复合体加入到所需转化的动物细胞中，置于磁场下驱动，室温孵育5 50min，转化2 20h后更换 培养液继续培养10 50h ;检测:检测转化情况和/或转化效率。更优选的是，在上述方法中，所述转化步骤中需转化的动物细胞为经过夜培养、其细胞贴壁率为70 80%的动物细胞，所述磁场的磁场强度为0.2 0.6T ;所述检测步骤中检测转化情况通过倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达来实现，检测转化效率通过流式细胞仪、免疫组化检测或实时定量PCR法来实现。在上述进入植物细胞的方法中，优选所述植物细胞为植物原生质体细胞或植物花粉细胞中。在上述进入植物原生质体细胞的方法中，优选所述植物原生质体细胞为烟草原生质体细胞或拟南芥原生质体细胞，优选所述外源基因为PCM1205-GFP质粒DNA，所述方法包括如下步骤，制备纳米Fe304/PEI/pCM1205-GFP复合体:分别将pCM1205_GFP质粒DNA和载体Fe304/PEI粒子稀释于培养液中，轻轻混匀；转化:将纳米Fe304/PEI/pCM1205-GFP复合体加入到所需转化的植物原生质体细胞中，置于磁场下驱动，室温孵育5 50min，转化24h后继续培养；检测:检测转化情况和/或转化效率。更优选的是，在上述方法中，所述转化步骤中需转化的植物原生质细胞为用W5溶液将密度调整到(I 5) X IO5细胞/ml的纯净原生质体；所述检测步骤中检测转化情况通过倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达来实现，检测转化效率通过流式细胞仪、免疫组化检测或实时定量PCR法来实现。在上述进入植物花粉的方法中，优选所述植物花粉为棉花花粉，优选所述外源基因为抗虫棉质粒pGBIGhSNRK，其含转化Bt抗虫基因和棉花发育相关基因植物表达载体，所述方法包括如下步骤，制备纳米Fe304/PEI/pGBIGhSNRK复合体:分别将pGBIGhSNRK质粒DNA和载体Fe304/PEI 粒子稀释于溶液中，轻轻混匀；转化:将棉花花药浸泡于纳米Fe3O4/PEI/pGBIGhSNRK复合体溶液中，置于磁场下驱动，15 30min后晾晒搜集花粉，人工授粉；检测:检测转化情况和/或转化效率。更优选的是，在上述方法中，所述转化步骤中需转化的棉花花药为当天新鲜未开放花朵的花药，所述人工授粉受体材料为发育正常、去雄套袋隔离的花；所述检测步骤中检测转化情况通过卡那霉素的筛选来实现，检测转化效率通过PCR法来实现。本发明的优点为:首先，本发明制备方法和转化方法操作简单，易于掌握，便于推广。其次，本发明的转化方法不受动、植物种类限制，不要求有受体细胞特异性，可广泛应用于动、植物转基因技术。再次，在本发明转化方法中，用磁性纳米基因粒子作基因输送载体，在磁场的介导下，外源目的基因与转化细胞悬浮培养，整合到细胞基因组，显著提高了基因的转化效率。最后，本发明通过控制与磁性纳米基因载体结合的外源基因的量，可有效地控制转入的外源基因的拷贝数。
图1中a和b为实施例1制备得到的纳米Fe304/PEI和其相应的Fe304/PEI/DNA复合物的扫描电镜图；图2中a和b为实施例1制备得到的纳米Fe304/PEI的不同放大倍数的透射电镜图；图3为实施例1中制备得到的Fe304/PEI/DNA复合物的透射电镜图；图4中a和b为实施例1制备得到的纳米Fe304/PEI的AFM图(高度图和相图)；图5中a和b为实施例2和对比例2中磁性纳米基因载体转化猪胎儿成纤维细胞，分别在有磁场和无磁场的条件下的表达效果图。
具体实施例方式实施例1磁性纳米基因载体制备；(I)制备纳米Fe3O4溶胶:准确称取0.2mOlFeCl3^P
0.1molFeCl2,加入到1L0.lmol/L的HCl溶液中，充分溶解后搅拌均匀。以10ml/min的流速，向上述溶液中缓慢加入1.4L1.5mol/L的氨水溶液，滴加结束后继续搅拌反应30min。然后向反应体系中缓慢加入0.lmol/L的HCl溶液，调节体系的pH值至7.0,继续搅拌反应30min。整个反应过程在N2保护下进行。取出反应体系，离心过滤，弃上清液，回收沉淀，反复清洗几遍，除去残留的离子，以检测不到Cl—为止。将反应所得固体转移至烧瓶中，加入
0.8L去离子水，充分搅拌，均匀分散，然后加入0.2L30%H202，加热至95°C，解胶反应8h，得到纳米Fe3O4溶胶，其粒径在10 500nm之间。(2)配制PE1-CH2Cl2溶液:在IOml CH2Cl2溶液中加入Ig聚醚酰亚胺(PEI )，调节温度为35°C，加入0.1g十二烷基硫酸钠，配置PE1-CH2Cl2溶液。(3)复合:取纳米Fe3O4溶胶，逐滴滴加到PE1-CH2Cl2溶液中，35°C度下复合反应lh，使纳米Fe3O4表面包裹一层PEI薄膜。(4)清洗,干燥:IOOOOrpm, 4°C离心20min,弃上清液；加入IOml去离子水，将沉淀于离心管的纳米Fe304/PEI重新分散，再次离心，弃上清液；反复操作3次，洗净纳米Fe304/PEI表面上残留的游离CH2Cl2和PEI，离心，回收沉淀物，4°C下冷冻干燥lh，得到PEI包膜的磁性纳米Fe3O4载体粒子(纳米Fe304/PEI )，该载体粒径在20 520nm之间，其中磁性纳米Fe3O4核心直径在10 500nm之间，PEI薄膜厚度在5 20nm之间。图1中a和b分别为本实施例制备得到的纳米Fe304/PEI的扫描电镜图和本实施例中Fe304/PEI连接DNA后的Fe304/PEI/DNA的扫描电镜图。从图中可见，纳米Fe304/PEI和Fe304/PEI/DNA复合体呈球形，在分散液中分散均匀，粒径均一。图2中a和b为实施例1制备得到的纳米Fe304/PEI的不同放大倍数的透射电镜图。由图2也可看到制备得到的磁性纳米基因载体Fe304/PEI为球形结构，且分散性较好，图2 (b)可以看到磁性纳米Fe3O4粒子为核心，外面包裹了一层PEI薄膜。图3为实施例1中制备得到的Fe304/PEI/DNA复合物的透射电镜图，可以看到在纳米Fe304/PEI的周围结合了大量的网状的DNA链，说明制备的纳米Fe304/PEI和DNA有较强的结合能力。图4中a和b为实施例1制备得到的纳米Fe3O4/PEI的AFM图(高度图和相图)，可以直观的看到制备得到的纳米Fe304/PEI的形貌。对比例I按CN101748150A中公布的方法制备磁性纳米基因载体:取5.6mmol FeCljP
2.8mmolFeCl2溶解在7ml脱气水中，冰水中调节温度在2_4°C，加入N2搅拌，逐滴滴加5M的NaOH，调节pH至11，冰水浴中反应30min ;然后调节水浴温度至80°C，加热lh。反应结束后，90000rpm,4°C离心IOmin,弃上清液,收集沉淀物,得到纳米Fe3O4粒子。将该粒子用7ml去离子水重悬，然后取200ul重悬后的Fe3O4溶液，逐滴滴加到200ul0.075g/ml的PEI25000的PBS溶液中(磷酸盐缓冲液PBS的配置方法如下:称取8g NaCU0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml去离子水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)，室温下搅拌反应3h，然后置于透析袋中透析4h，得到磁性纳米基因载体Fe304/PEI。表I比较了实施例1和 对比例I中所得磁性纳米基因载体的粒径数据和表面Zeta电位数值。
表I
权利要求
1.一种转基因生物培育用磁性纳米基因载体的制备方法，包括如下步骤， 步骤A，制备纳米Fe3O4溶胶:按物质的量之比为I 3:1称取铁盐和亚铁盐并加入稀酸溶液中，溶解搅拌后向其中加入弱碱溶液使得溶液PH值呈碱性，继续搅拌至反应结束，用酸中和溶液PH值至6 8 ;前述制备过程在氮气或氩气保护下进行；将反应体系固液分离，反复清洗固体以除去稀酸中带入的阴离子；所得固体中加入去离子水或乙醇，充分搅拌至均匀分散，然后加入H2O2并加热至70 100°C反应2 24h，得到棕色透明状溶液，即为纳米Fe3O4溶胶； 步骤B，配制PE1-CH2Cl2溶液:取PEI和十二烷基硫酸钠加入到CH2Cl2溶液中，配成PE1-CH2Cl2 溶液； 步骤C，复合:将上述纳米Fe3O4溶胶加入PE1-CH2Cl2溶液中，进行复合反应； 步骤D，清洗和干燥:步骤C得到的复合溶液固液分离后，固相中加入乙醇或去离子水洗涤以除去磁性纳米Fe304/PEI表面残留的CH2Cl2和PEI，回收沉淀物并冷冻干燥，得到PEI包膜的纳米Fe304/PEI粒子即所述磁性纳米基因载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D中还包括在洗净纳米粒子表面残留的CH2Cl2和PEI后，将纳米Fe304/PEI粒子重新分散于乙醇或去离子水中，并向其中加入荧光物质，充分反应后在粒子表面形成荧光物质层，冷冻干燥后得到带荧光层的磁性纳米基因载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光物质为选自红色荧光蛋白RFP、绿色荧光蛋白GFP、荧光色素、荧光量子点中的一种或多种。
4.一种按照权利要求1 3中任意一项所述方法制备得到的磁性纳米基因载体在动物细胞或植物细胞转化中的应用；优选所述动物细胞为猪胎儿成纤维细胞或猪精子细胞，优选所述植物细胞为烟 草原生质体细胞、拟南芥原生质体细胞、或棉花花粉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述磁性纳米基因载体与外源基因相连后、在0.1 0.6T的外源磁场驱动下转化动物细胞或植物细胞，优选所述磁性纳米基因载体通过静电相互作用或化学偶联作用与外源基因相连。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外源基因中含荧光蛋白基因，能实现荧光蛋白的表达。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述磁性纳米基因载体具有超顺磁性，且其粒径为10 500nm ;所述外源基因为DNA或RNA，所述外源基因为单基因或多基因。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述磁性纳米基因载体与外源基因的质量比为2:1 1:2，最优选1:1。
9.一种磁性纳米基因载体在转化动物细胞或植物细胞中的应用，其中，所述磁性纳米基因载体为Fe304/PEI粒子，所述磁性纳米基因载体与外源基因相连后、在0.1 0.6T的外源磁场驱动下转化动物细胞或植物细胞；优选所述动物细胞为猪胎儿成纤维细胞或精子细胞，优选所述植物细胞为烟草原生质体细胞、拟南芥原生质体细胞、或棉花花粉。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述磁性纳米基因载体为在Fe304/PEI粒子表面形成有荧光物质层的粒子。
全文摘要
本发明涉及一种基因输送磁性纳米基因载体及其制备工艺和应用，本发明还提供一种磁性纳米基因载体负载外源基因转化动、植物细胞的方法。在本发明中，所述磁性纳米基因载体为纳米Fe3O4/PEI粒子，在外源磁场的驱动下，其携带外源基因进入动、植物体细胞和/或生殖细胞，实现遗传转化与表达，获得性能优良的转基因培育新品种。本发明制备方法和转化方法操作简单，易于掌握，便于推广；本发明的转化方法不受物种种类限制，不要求有受体细胞特异性，可广泛应用于动、植物转基因技术；在本发明转化方法中，可显著提高基因的转化效率；本发明通过控制与磁性纳米基因载体结合的外源基因的量，可有效地控制转入的外源基因的拷贝数。
文档编号C12N15/82GK103233042SQ20131015367
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2012年4月28日
发明者崔海信, 王琰, 孙长娇, 孟志刚, 孙金海, 李奎, 姜建芳, 赵翔 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所