专利名称：一种禽白血病p27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物疫病血清学诊断技术领域，涉及一种禽白血病P27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术：
禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的一种禽类多种肿瘤性疾病的统称。禽白血病病毒己分类至10个亚群，分别命名为A亚群至J亚群。A D亚群是外源性ALV，E亚群是内源性ALV ;A、B亚群曾被认为是商业产蛋鸡群中(尤其来航鸡)的最普遍的外源性病毒亚群，C亚群和D亚群感染的报告极罕见，而E亚群病毒则包括了极普遍的低致病性内源性白血病病毒；F亚群分离自环颈雉，G亚群分离于金黄雉，此外还有匈牙利鸡的H亚群和网比亚鹌鹑的I亚群J亚群是20世纪90年代初分离于肉鸡的一种新病毒；E亚群无处不在，但主要以内源性的前病毒型存在。在过去的30多年中由于应用了一些根除ALV的方法，由白血病病毒或肉瘤病毒以及它们相关病毒引起的肿瘤发病率一般都很低，病毒表现出遗传上的相对稳定性。本病呈世界性分布，感染率高，能引起鸡的死亡、消瘦，降低鸡群的生产能力，是严重危害养禽业发展的主要疾病之一。预防本病的主要方法是培育出具有遗传性抵抗力的新品种，淘汰阳性鸡，净化种群，经过几代选育净化出无白血病鸡群。因此建立一种有效而敏感的禽白血病检测方法对禽白血病的预防与监控有着极其重要的作用。
禽白血病病毒gag基因核苷酸高度保守，A、B、C、D亚群和新近发现的J亚群同源性在96%以上，gag基因编码群特异性抗原(gsa)。P27蛋白是gag基因编码的群特异性抗原(gsa)中一种重要的蛋白，其含量高，占病毒总蛋白成分的30%以上，是制备检测抗体的首选抗原。申请号为200310113280.9中国发明专利公开了一种P27蛋白检测试剂盒，但其特异性和敏感性欠佳。禽白血病P27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。禽白血病P27蛋白是ALV核心衣壳蛋白的主要成分，是一种高度保守的非糖基化蛋白，有许多病毒抗原点，是制备检测抗体的首选抗原。然而，现有技术中却没有方法能表达出禽白血病抗原特异性很强的P27蛋白，因此用现有技术方法所得的禽白血病抗原P27蛋白检测抗体的特异性和准确性都不是很高。自1868年，Roloff报道禽白血病以来，研究工作者就对其进行了长期的研究，并在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了相当大的成就。国内外建立了很多禽白血病检测诊断方法，例如病毒中和试验，琼脂扩散试验，补体结合试验，ELISA，放射免疫，免疫荧光技术等。但这些方法多是用于实验室研究，很少能进入临床应用阶段。最早可以进行临床检测的方法是琼扩试验，但其敏感性较差，并有一定的假阳性出现，因此，人们将目光转向更加敏感、特异、操作方便的ELISA检测方法。而可以同时检测所有亚群的禽白血病抗原并且具有高效、敏感、特异的酶联免疫检测试剂盒依赖于针对禽白血病P27单克隆抗体的研制。
但目前为止，尚未有见灵敏度好、特异性强、效价高的禽白血病P27单克隆抗体的报道。
发明内容
根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种禽白血病P27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。本发明发明人经过大量研究表达出禽白血病抗原特异性很强的P27蛋白，利用P27基因在禽白血病病毒不同亚群之间高度保守，含量高的特性，为禽白血病阳性鸡群的淘汰、净化，培育具有遗传性抵抗力的新品种提供了一种高效、敏感的检测方式，其成本低，操作简便，适于畜牧业生产的推广与应用。本发明的技术方案如下:一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC N0.7456，所述杂交瘤细胞株的获得是通过将禽白血病病毒P27基因的重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达并纯化，然后用纯化后的禽白血病P27抗原对BALB/c小鼠进行皮下注射免疫小鼠后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，后对上述细胞进行培养，进一步亚克隆，筛选出一株针对禽白血病病毒P27的单克隆抗体，及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，纯化并保藏。一种禽白血病P27单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌而得。上述的单克隆抗体在检测禽白血病P27中的应用。上述应用指在特异性检测反应中作为包被原。所述包被原是在检测禽白血病P27的试剂盒中作为反应载体的包被原。禽白血病抗原P27蛋白的表达方法，其特征在于，步骤按顺序如下:(I)将含有禽白血病病毒P27基`因的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中；(2)再接种于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中，37°C过夜培养，所述LB固体培养基按如下配制:将胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,NaCllOg溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0定容至IL而成；(3)取3 4个步骤(2)所得单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，370C振荡250rpm培养至0D600=0.6 ;所述LB液体培养基按如下配制:将5g酵母膏，IOg蛋白胨和IOg NaCl加至容器，加蒸馏水至1000ml，用NaOH和HCl调节pH7.0 7.2，分装灭菌。(4)再加入诱导剂异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，用量为使诱导剂浓度达到lmmol/1，37°C继续培养3小时，获得表达蛋白。由上述的方法所得禽白血病抗原P27蛋白。一种禽白血病P27多克隆抗体，是用上述的抗原P27蛋白免疫家兔所得的。禽白血病病毒P27酶联免疫试剂盒，包括上述禽白血病P27多克隆抗体包被的96孔酶标板，碱性磷酸酶标记的上述P27单克隆抗体，阳性对照，所述阳性对照是上述的禽白血病病毒P27表达纯化的抗原。所述禽白血病P27多克隆抗体包被的酶标板的包被浓度为1.2 1.5ug/ml，本发明发明人采用方阵试验确定包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度:纵向用P27多克隆抗体，按10.0、5.0、2.0、1.5、1.0、0.5ug/ml的系列稀释度包被96孔板，横向按1:200、1:400、1:800,1:1000、1:2000将酶标单克隆抗体进行稀释，450nm测定OD值，接近1.0的孔所对应的包被浓度和稀释度为最佳。所述酶标板包被时采用0.05mol/l,pH值为9.5的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。碱性磷酸酶标记的P27单克隆抗体是采用戊二醛一步法交联碱性磷酸酶和P27单克隆抗体所得。所述的试剂盒还包括阴性对照、底物溶液、终止液和洗涤液，所述的阴性对照为未感染过禽白血病的健康鸡只的阴性血清，所述底物溶液为对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny一phosate, pNPP)，所述洗漆液为含 0.05%Tween_20 的 PBS 缓冲液。所述终止液由二乙醇胺、氯化钠、EDTA和氢氧化钠制备而得，将氯化钠9.0g，二乙醇胺105g，氢氧化钠80g，EDTA0.37g加去离子水至I升而得。上述试剂盒的制备方法，其步骤按顺序是:取出用P27多克隆抗体包被的酶标板，加50 ill样品到酶标板孔中；在A12和B12 (96孔包被板中加样位置)中加入50 U I的阴性对照，在C12和D12(96孔包被板中加样位置)中加入50 ii I的阳性对照；盖住酶标板，于22-27 °C下孵育60分钟；吸出或倒出酶标板孔中的内容物，用洗涤液洗5次，400iU/孔，于吸水纸上轻轻拍打；加50 ill酶标P27单克隆抗体到各孔中，盖住反应板，于22_27°C下孵育30分钟；重复洗板，吸 出或倒出酶标板孔中的内容物,用洗涤液洗5次，400 U I/孔，于吸水纸上轻轻拍打；加50 ii I底物容溶液到各孔中，盖住反应板,于22_27°C温度下孵育15分钟；加50 ill终止液到各孔中，终止反应；以空气调零，以450nm的波长于酶标仪测定对照和样品的吸光度。Al、B1、Cl和Dl均是本发明试剂盒96孔包被板中加样位置标志。禽白血病P27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，是易于检测的病毒抗原，是制备群特异性抗体以及单抗的首选抗原。本发明利用禽白血病P27基因在禽白血病病毒不同亚群之间高度保守，含量高的特性，为禽白血病阳性鸡群的淘汰、净化，培育具有遗传性抵抗力的新品种提供了一种高效、敏感的ELISA检测试剂盒，其成本低，操作简便，适于畜牧业生产的推广与应用。本发明对现有技术中表达蛋白的条件进行优化，深入分析研究，筛选出最佳菌种，最佳培养温度、诱导剂浓度、诱导试剂以及培养时间，同时也依据这些表达条件之间相互配合，相辅相成，本发明方法表达出的禽白血病P27蛋白表达量、纯度均较高。本发明禽白血病病毒(P27)ELISA检测试剂盒，采用夹心ELISA的原理用禽白血病P27多克隆抗体包被96孔酶标板，与待检禽白血病抗原形成抗原抗体复合物。碱性磷酸酶标记的P27单克隆抗体特异性吸附于抗原抗体复合物，加入底物显色后，根据吸光度(0D值)判断阴阳性，所述的禽白血病P27多克隆抗体和碱性磷酸酶标记的P27单克隆抗体，可有效提高检测的敏感性、特异性和稳定性。本发明禽白血病P27多克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，将含有禽白血病P27基因的重组质粒转化到大肠杆菌(BL21)中进行表达，表达的P27蛋白纯化后采用SDS-PAGE和Western-blot检测其纯度。经层析纯化后的禽白血病P27抗原免疫家兔，第一次皮下多点皮下免疫，抗原加弗氏完全佐剂共2ml。10天后第二次皮下多点免疫，抗原加弗氏不完全佐剂共2ml。10天后第三次皮下多点免疫，抗原加弗氏不完全佐剂共2ml。10天后第四次加强免疫。10天后测抗体效价，ELISA鉴定P27多克隆抗体，放血收集血清，并纯化禽白血病P27多克隆抗体。所述P27单克隆抗体的制备过程为，表达纯化的P27抗原与等量弗氏完全佐剂混匀后，腹腔及皮下多点注射BALB/c小鼠，间隔2周免疫三次，采血测效价。细胞融合前第四次加强免疫。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合、培养筛选特异性单克隆抗体。本发明用禽白血病病毒P27多克隆抗体包被酶标板时采用0.05mol/l,pH9.5的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照是禽白血病病毒P27表达纯化的抗原，所述的阴性对照为未感染过禽白血病的健康鸡只的阴性血清。所述底物溶液是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny—phosate, pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(PNP)，OD值在405nm处有最大吸收。所述洗涤液为含0.05%Tween-20的PBS缓冲液。所述终止液由二乙醇胺、氯化钠EDTA和氢氧化钠制备。本试剂盒的判定标准:为了得到正确的检测结果，阴性对照的平均吸光度在0.15以下，阳性对照的平均值和阴性对照的平均值之差不小于0.5。S/P比率的计算:
权利要求
1.一种禽白血病P27单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC N0.7456。
2.一种禽白血病P27单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌而得。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测禽白血病P27中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述应用指在特异性检测反应中作为包被原。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述包被原是在检测禽白血病P27的试剂盒中作为反应载体的包被原。
6.禽白血病抗原P27蛋白的表达方法，其特征在于，步骤按顺序如下: (1)将含有禽白血病病毒P27基因的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中； (2)再接种于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中，37°C过夜培养，所述LB固体培养基按如下配制:将胰蛋 白胨IOg,酵母提取物5g, NaCllOg溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0定容至IL而成； (3)取3 4个步骤(2)所得单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡 250rpm 培养至 0D600=0.6 ； (4)再加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，用量为使诱导剂浓度达到lmmol/I，37°C继续培养3小时，获得表达蛋白。
7.由权利要求6所述的方法所得禽白血病抗原P27蛋白。
8.一种禽白血病P27多克隆抗体，是用权利要求7所述的抗原P27蛋白免疫家兔所得的。
全文摘要
本发明属于动物疫病血清学诊断技术领域，涉及一种禽白血病P27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。由本发明所述杂交瘤细胞株分泌而得禽白血病P27单克隆抗体可应用于检测禽白血病P27，本发明用P27特异性多克隆抗体包被96孔酶标板，用碱性磷酸酶标记P27单克隆抗体，本发明的禽白血病P27多克隆抗体和碱性磷酸酶标记的P27单克隆抗体，有效提高了检测的敏感性、特异性和稳定性。本发明为禽白血病阳性鸡群的淘汰、净化、培育具有遗传性抵抗力的新品种提供了一种高效、敏感的检测方式，其成本低，操作简便，适于畜牧业生产的推广与应用。
文档编号C12N5/20GK103243077SQ20131016080
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者吴培星, 宋楠, 遇秀玲, 李纯玲, 宁海强, 韩涛, 张继瑜 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所, 北京天之泰生物科技有限公司, 北京天恩泰生物科技有限公司