一种来源于大肠杆菌的离子通道基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明将一种来源于大肠杆菌的离子通道基因ENHX2基因转入植物并使得这种转基因植物能够具备增加植物抗盐性的作用。所述离子通道基因ENHX2含1650个碱基，编码的氨基酸549个；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示。本发明中来源于酿离子通道蛋白基因ENHX2采用人工方法合成，转基因植物具备较高的抗盐性。
【专利说明】一种来源于大肠杆菌的离子通道基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于大肠杆菌的离子通道基因的 序列，利用农杆菌将该基因转化到植物中，使植物耐盐能力得到提高。
【背景技术】
[0002] 盐渍化土壤是广泛分布的不利于植物生长的一种土地，盐分胁迫严重影响着植物 的正常生长发育。土壤盐碱化问题引起了世界各地学者的日益关注，成为现代土壤学研究 的热点。所谓盐土是指土壤饱和提取液中电导率（EC)高于4 ds / m，并且可交换性钠百分 数（ESP)的含量低于15%的土壤，这些土壤的pH -般为中性偏碱，当ESP高于15 %、pH大 幅上升时的盐土又称为盐碱土。盐碱土在陆地生态系统上分布广泛，全世界盐渍土面积约 10亿公顷。在全球的干旱和半干旱地区，约有50%的灌溉土地受到盐碱化的影响，区域内 的非灌溉土地同样会发生盐碱化。在我国从滨海到内陆，从低地到高原都分布着不同类型 的盐碱土壤，盐渍土面积约3 460万公顷，盐碱化耕地760万公顷，即近1 / 5耕地发生盐 碱化。
[0003] 人们就逆境对植物影响的认识和研究，首先是从表观生理指标一般性描述开始， 其次研究植物在各种逆境下产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分子 水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号传导、基因表达与调控、蛋白质组装和细胞 膜功能获得。为更深入了解植物对不同逆境响应的分子机理和研究人工调控的生物技术等 方面展示出良好前景。
[0004] 抗盐能力因种而异，抗盐性强的植物原生质膜具有极低的透性，在同种盐渍条件 下，吸收盐类明显少于抗盐弱的品种，在一定程度上加强了拒盐的作用。所以可利用生理生 化指标鉴定、组织培养、转基因等技术培育新的抗盐作物品种，使其适应盐碱土环境 本项发明利用PTDS法合成了来源于大肠杆菌的离子通道基因，将该基因转化拟南芥， 进而提高了转基因拟南芥的抗盐能力，该基因对于培育植物抗盐的植物品种非常重要，具 有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于将一种来源于大肠杆菌的离子通道基因 iJWC 转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物的耐盐性的功能。
[0006] 一种来源于大肠杆菌的离子通道基因烈，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示， 其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0007] 所述来源于大肠杆菌的离子通道基因烈ffiU长1650bp，编码的氨基酸549个。 [0008] 所述来源于大肠杆菌的离子通道基因 iJWC通过农杆菌介导转入拟南芥，应用于 植物耐盐性。
[0009] 所述来源于大肠杆菌的离子通道基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤： 的人工合成 依照PTDS(PCR_based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自大肠杆菌的离子 通道基因进行化学合成，在保持iJWC基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成了 基因。
[0010] 2 ) 农杆菌双元载体的构建 万船恐基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在pCAMBIA-1301 载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元， 这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355启动子+TMV omega leader sequence 控制 3)电击法转化农杆菌 参照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD公司）制备农杆菌GV3101感受态.并且将构建好的农杆菌 双元载体经电击法转入到农杆菌中。
[0011] 4)农杆菌介导转化拟南芥 利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内.首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中， 轻轻搅动约3?5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆 封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两 个月后，收集种子，4 °C冰箱贮存待用。
[0012] 5)拟南芥转化植株种子的筛选 将得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测得 到转入EWC基因的拟南芥。
[0013] 6)转基因拟南芥耐盐性验证 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星 期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于耐盐抗性实验。F分别用不同浓度的NaCl溶液 处理野生型和转基因拟南芥株系。盐处理14d，结果显示在150、200 mmol/L NaCl处理下 野生型生长明显受抑制，叶片发黄，而转基因株系抑制较小。结果说明iJWC基因明显提高 了拟南芥的耐盐性。
[0014] 本发明实现的有益效果 本发明采用PTDS法合成了来源于大肠杆菌的离子通道基因，为了进一步分析该基因 在盐碱逆境中的作用与功能，我们比较了转原基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株 的耐盐性。结果表明，野生型和转iJWC基因拟南芥植株在表型上有很大的差异。结果显示 在150mmol/L NaCl处理下野生型生长明显受抑制，叶片发黄，而转基因株系抑制较小。结 果说明βνΛΚ?基因明显提高了拟南芥的耐盐性。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是用于拟南芥转化的植物表达载体示意图。
[0016] 图2是获得的转基因拟南芥的⑶S染色图。
[0017] 图3是转原办^基因拟南芥与野生型拟南芥的耐盐表型图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说 明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明 技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0020] 本发明所用的试验材料及其来源包括： 野生型拟南芥)生态型拟南芥，23 °C人工气候室培 养，16 h光照培养。
[0021] 克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、 10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国 西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂 盒购自美国应用系统公司。
[0022] 本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛一奥德里奇（Sigma - Aldrich)。
[0023] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科学出版社)。
[0024] 实施例1 大肠杆菌基因的人工合成 根据Genbank登录的大肠杆菌ENHX2基因序列（ABJ03869)，用以基因合成方法 【Nucleic Acids Research, 2004，32，e98】，在不改变基因编码的氨基酸序列的前提下， 按以下原则进行合成基因编码区的设计：（一)优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二)消 除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三)消除逆向重复序列、茎 环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四)使基因编码蛋 白符合N端原则（Tobias 1991)，以提商翻译蛋白的稳定性。（五）设计提商基因5'端的自 由能，以提商基因翻译起始效率。
[0025] 扩增条件为：94°C 预热 1 min ;94°C，30 s，50°C，30 s，72°C，2 min，使用的 Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本)，共25个循环。
[0026] PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10 μ?直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物 公司）。4°C连接过夜，高效转化DH5 α感受态中。获得阳性克隆。
[0027] 实施例2 农杆菌双元载体的构建 上述人工合成的烈ffiU基因的阳性克隆用引物SP1基因0RF经PCR扩增后头尾分别加 入Bam HI和Sac I切点，经Bam HI + Sac I双酶切，回收DNA片段与相应酶切的载体相连， 经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体(见图1)。
[0028] 实施例3 电击法转化农杆菌 1)制备农杆菌 GV3101 感受态，方法参照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司）((Raineri et al., Bio. Tech·, 1990， 8: 33-38)。
[0029] 2)取50yL GV3101感受态细胞，加入lyL DNA，转入0.2 cm电击杯转化（400Ω， 2. 5KV，25y f)。加入1 mL含有1%甘露醇的LB培养基恢复培养2小时（28°C，250rpm)。分 别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL，庆大霉素50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL)。
[0030] 3)挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定，PCR检测。
[0031] 实施例4 农杆菌介导转化拟南芥 A拟南芥的培养 1)拟南芥种子在4°C进行2 - 3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期 的提前。
[0032] 2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9 :3 :0. 5的比例拌勻，经高温灭菌后装于10cm的塑料 小盆，以营养液PNS浸湿待用。
[0033] 3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养 2 - 3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。
[0034] 4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视 情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2 - 10cm(少 数已经开花）可用于转化(何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志，1991，13(3) :97-101 )。
[0035] B农杆菌的准备 1) 挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培养 20 小时。（Rashid et al·，1996) 2) 取lmL菌液转接入20 - 30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培养约 12 小时，测 0D600 ~ L 5。
[0036] 3) 8000rpm，4°C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%鹿糖，0· 05% Silwet L-77)并稀释至 0D600 ?0· 8。
[0037] C拟南芥蘸花法转化 1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3?5秒后取出，全部转化完毕后，托盘 中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度下生 长24小时，即可正常培养。
[0038] 2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花 发育的不同时期进行转化，提高转化效率。
[0039] 3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。
[0040] 实施例5 拟南芥转化植株种子的筛选 1)称25 - 30mg种子放入1. 5mL离心管。
[0041] 2) lmL 75%乙醇消毒lmin (不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。
[0042] 3)加入lmL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离 心5秒，去上清。
[0043] 4)无菌水洗涤3 - 4次。
[0044] 5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板（Hyg 50yg/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰 箱放置两天，22°C，16小时光照培养6天。
[0045] 6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株（T1) 继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。
[0046] 实施例6 转基因阳性植株的检测 按Jefferson (1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液（50m mol/ L NaH2P04，pH7.0 ;0· 5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1% Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc [X-glucuronide])于37°C保温2 - 4小时后，用75%乙醇脱色观察(见图2)。
[0047] 实施例7 大肠杆菌离子通道iJWZJ?基因转化植物后的耐盐分析 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星 期。然后比较了转iJWC基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的耐盐性。结果表明，野 生型和转烈ffiU基因拟南芥植株在表型上有很大的差异。结果显示在150mmol/L NaCl处 理下野生型生长明显受抑制，叶片发黄，而转基因株系抑制较小。结果说明iJWC基因明显 提高了拟南芥的耐盐性（图3)。
[0048]
【权利要求】
1. 一种来源于大肠杆菌的离子通道基因基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2. 根据权利要求1所述的来源于大肠杆菌的离子通道基因，其特征在于，其氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示。
3. 权利要求1或2所述的来源于大肠杆菌的离子通道基因采用人工方法制备而成。
4. 权利要求1或2所述的来源于大肠杆菌的离子通道基因采用农杆菌蘸花法转化拟南 芥。
5. 权利要求1或2所述的来源于大肠杆菌的离子通道基因转基因植物在抗盐性中的应 用。
【文档编号】C12N15/82GK104140970SQ201310163235
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】薛永, 殷浩, 蒋小辉, 侯晓光, 吴顺霞, 侯曙光, 周惠, 王瑞, 伍光彩, 张扬 申请人:南京博欧生物科技有限公司