专利名称：一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大黄鱼抗菌肽基因，尤其是涉及一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其制备方法与应用。
背景技术：
Hepcidin是近年来新发现的一类具有独特性质的小分子抗菌肽。Krause等(1.Krause A, Neitz S， MagertHJ ，et al.LEAP-1, a novelhighly disulfide-bondedhuman peptide, exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett,2000，480:147-150)首次从人血液中分离纯化了这条多肽，并将其命名为肝脏表达的抗菌肽(LEAPl)。随后，Park 等(2.Park CHj Valor EVj Waring AJj etal.Hepcidin, a urinary antimicrobialpeptide synthesized in the liver[J].J BiolChem，2001，276 (11):7806-7810)将从人尿分离的这条多肽命名为hepcidin，此后 一直沿用此名称。目前，从多种哺乳动物及鱼类中已成功克隆到hepcidin基因。与其他抗菌肽不同，hepcidin在各物种间具有较高的结构保守性，在成熟肽区域中富含8个半胱氨酸，可形成4对二硫键，使其分子结构高度紧缩(3.Hunter HNj Fulton DB,GanzTj et al.The solution structure of human hepcidin, apeptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake andhereditary hemochromatosis [J].J BiolChem，2002，277 (40): 37597-37603) 研究表明，hepcidin具有广泛的抗细菌、病毒、真菌和原生动物活性(4.Cuesta A, MeseguerJ，EstebanMA.The antimicrobial peptide hepcidin exerts an important role in theinnate immunity against bacteria in the bony fish gilthead seabream[J].MolImmunol, 2008，45(8):2333-2342)。本申请 A(5.Zheng W, Liu G, Ao J，et al.Expressionanalysis of immune-relevant genes in the spleen of large yellowcroaker (Pseudosciaenacrocea) stimulated with poly 1:C[J].Fish ShellfishImmunol, 2006, 21 (4):414-30)前期通过对病毒类似物poly (1: C)诱导大黄鱼脾脏组织cDNA文库的表达序列标签(expressed sequence tag, EST)分析，发现了多条编码大黄鱼抗菌肽hepcidin的EST序列。已经报道，真鲷Pagrosomus major、S卢鱼Lateolabraxjaponicus、石斑鱼 Epinephelusdrummondhay1、黑鲷 Sparusmacrocephlus 等鱼种hepcidin基因均存在多态性现象(6.王克坚，海洋鱼类和青蟹抗菌肽hepcidin和scygonadin的研究[J].厦门大学学报(自然科学版)，2011，50⑵:418_424)，这与人类及其他哺乳类动物只存在一个hepcidin基因(除鼠具有两个hepcidin基因外)存在显著不同，这种现象反映出鱼类在复杂的水体环境下可能需要多个hepcidin基因拷贝来参与自身的免疫防御反应(7.Huang PHj Chen JYj Kuo CM.Three different hepcidins fromtilapia，Oreochromismossambicus:analysis oftheir expressions and biologicalfunctions [J].MolImmunolj 2007，44(8): 1922-1934)，也说明了 hepcidin 可能是鱼类重要免疫防御因子。因为Hepcidin成熟肽具有4对二硫键结构,所以hepcidin基因的异源表达及表达产物的纯化一直具有很大的难度。由于原核表达系统不能对表达产物进行翻译后的修饰，并且化学合成的成本普遍偏高。因此我们选用能够对表达产物进行翻译后的修饰，使表达产物形成正确的分子内二硫键的真核表达系统——巴斯德毕赤酵母表达系统(8.LiZ, Moy A, Sohal K, et al.Expression and characterization of recombinant humansecretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)protein from Pichiapastoris[J].Protein ExprPurif, 2009, 67 (2): 175-181)来进行大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的重组表达，以期获得具有抗菌活性的表达产物，为进一步研究大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的功能以及其开发应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供可高效表达大黄鱼抗菌肽h印cidin基因的酵母工程菌。本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼抗菌肽h印cidin基因的酵母表达产物及其制备方法。本发明的目的之三在于提供大黄鱼抗菌肽h印cidin重组蛋白的应用。所述酵母工程菌为巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZ a A-hepcidin (Pichiapastoris SMD1168/pPICZ a A_h印cidin)已于2013年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013085，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武
汉大学。 所述大黄鱼抗菌肽h印cidin基因的酵母表达产物为分子量约20kDa的大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白，该大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白在终浓度为200ng/ μ L时,对2株水产病原菌嗜水气单胞和副溶血弧菌具有较为明显的抑制作用，显示出其在水产抗菌剂研发中的良好应用前景。所述大黄鱼抗菌肽h印cidin基因cDNA序列及推断的氨基酸序列如下:
权利要求
1.巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZ a A-hepcidin (Pichia pastoris SMDl 168/pPICZaA-h印cidin)，已于2013年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO:M2013085o
2.大黄鱼抗菌肽h印cidin基因的酵母表达产物，其特征在于其为分子量约20kDa的大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白，该大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白在终浓度为200ng/μ L时，对2株水产病原菌嗜水气单胞和副溶血弧菌具有较为明显的抑制作用，显示出其在水产抗菌剂研发中的良好应用前景。
3.大黄鱼抗菌肽hepcidin基因cDNA序列及推断的氨基酸序列如下:I TCAGACCAGAGAAGAACTCAGAGAGCTGACAAAACTCACCAAAAGATCTTCAGATATTTA61 GCTGAAGTTAAACCAGTCAAACCCTCCAAAGATGAAGACATTCAGTGTTGCAGTTGCAGT21 MKTFSVAVAVI2I GGCCGTCATGCTCGCCTTCATTTGTCTTCAGGAGAGCTCTGCTGTCCCAGTCAATGAAGA41 AVMLAFICLQESS AV PVNEEI8I GCAAGAGCTGGAGCAGCAAATTTATTTTGCTGATCCAGAGATGCCAGTGGAATCATGCAA61 QELEQQIYFADPEMPVESCK241 GATGCCGTATTACATGCGTGAGAATCGTCAGGGCAGCCCTGCTAGATGCAGGCTTTGCTG81 MPYYMRENRQGSPARCRLCC301 CCGTTGCTGTCCTAGAATGAGGGGATGTGGTATCTGCTGCAGGTTCTGAGGATTCCTGCA101 RCCPRMRGCGICCRF*361 CCAACCTGGGATC TCCACAACAACCACTAAATATTAATTTGTCATGCAACTTCACAGCTT421 ATAAACAAGTTTAGCTGCTTTTGGCTGTTGGTTTATTTTACTTTCTTGAAGAAATTTTAC481 AACTTTCAGGTTGTACACTCAAAGAATTAGGGAATGCTGAATTCGTATGTGCTCATCTGC54I AAAAACTGTACTGTGTGCCATCCCAATAACATTTTATGTTAGCGCA 其中，下划直线部分为预测的大黄鱼抗菌肽hepcidin信号肽；下划波纹线部分标示推断的重组表达蛋白氨基酸序列；星号表示终止密码子。
4.如权利要求2所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物的制备方法,其特征在于包括以下步骤: 1)克隆大黄鱼抗菌肽h印cidin基因全长cDNA序列，进而采用PCR技术扩增出编码第25位至第85位氨基酸的183bp大黄鱼抗菌肽h印cidin基因片段； 2)将步骤I)得到的大黄鱼抗菌肽hepcidin基因片段克隆到Invitrogen公司毕赤酵母表达载体PPCIZ α Α,构建得到含大黄鱼抗菌肽hepcidin基因片段的重组表达载体pPICZaA-hepcidin ； 3)将经线性化的重组表达载体pPICZa A-hepcidin电击转化巴斯德毕赤酵母SMDl 168菌株(InvitiOgen公司)，经抗生素Zeocin筛选及基因组PCR扩增鉴定，获得含有大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZ a A-hepcidin,也称酵母工程菌SMD1168/pPICZa A-hepcidin ;同时，将线性化的毕赤酵母表达载体pPICZ a A电击转化巴斯德毕赤酵母SMDl 168菌株，获得的巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZ a A作为对照菌株； 4)巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZa A-hepcidin在BMMY培养基中经0.5%甲醇诱导、30°C振荡培养72h，将培养物离心收集上清，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE和Western-blotting分析均证明了大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白在上清中得到了分泌型表达； 5)利用镍离子金属鳌合亲和层析介质(N1-NTA)纯化该重组蛋白:在巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZ a A-hepcidin的培养物上清中加入NaCl至终浓度为0.2M，4°C放置8h，4°C离心取上清液并过滤，将过滤后的上清液全部上柱，40C结合，控制流速，然后用Binding缓冲液过柱，洗去未结合的蛋白，再用Elution缓冲液洗脱目的蛋白，纯化后的蛋白分别经缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3进行3步透析，每步不低于12h，透析后即得到了纯化的大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白。
5.如权利要求4所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物的制备方法,其特征在于在步骤4)中，所述BMMY培养基配方为:20g/L胰化蛋白胨；10g/L酵母抽提物；0.1M磷酸钾缓冲液，ρΗ6.0 ；1.34%ΥΝΒ ;4Χ 1(Γ5%生物素；0.5%甲醇。
6.如权利要求4所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物的制备方法,其特征在于在步骤5)中，所述Binding缓冲液的配方为:20mMNaH2P04，0.5MNaCl，20 40mM咪唑，ρΗ=7.4ο
7.如权利要求4所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述Elution缓冲液的配方为:20mM NaH2PO4,0.5MNaCl，500mM咪唑，pH=7.4。
8.如权利要求4所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物的制备方法,其特征在于在步骤5)中，所述缓冲液I的配方为:20mMNaH2P04，0.5MNaCl，300mM咪唑；所述缓冲液2的配方为:20mMNaH2P04，0.5MNaCl, IOOmM咪唑；所述缓冲液3的配方为:20mMNaH2P04，0.5MNaCl。
9.如权利要求2所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物，其特征在于所述大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白对2株水产病原菌嗜水气单胞和副溶血弧菌具有抑制作用，包括以下步骤: O参照96孔板培养法进行重组蛋白的体外抑菌活性分析，所用5株受试菌为: 革兰氏阴性菌:副溶血弧菌(Vibrioparaphaemolyticus)； 嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)； 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)； 革兰氏阳性菌:溶壁微球菌(Micrococcus Iysodeikticus)； 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)； 2)5株受试菌分别于LB液体培养基中30°C培养至0D_为0.4 0.6，然后用LB液体培养基将各细菌培养物按1: 1000分别进行稀释，使受试菌悬液中细菌起始浓度为(2 9) X 104colony-forming units/mL ； 3)将所获得的大黄鱼抗菌肽h印cidin重组蛋白经过0.22 μ m滤膜过滤除菌后，用透析缓冲液稀释至浓度为400ng/ μ L ； 4)在96孔培养板上，每种受试菌按照以下操作设置阴性对照组1、阴性对照组2和重组蛋白实验组，每组设置3个平行样: ①阴性对照组1:每孔中加入50 μ L步骤2)所得受试菌悬液和50 μ L LB液体培养基 ②阴性对照组2:每孔中加入50 μ L步骤2)所得受试菌悬液和50 μ L透析缓冲液③重组蛋白实验组:每孔中加入50 μ L步骤2)所得受试菌悬液和50 μ L重组蛋白样品将96孔培养板置30°C静置培养25h,在不同时间点测定培养板各受试菌培养液物的A600值，根据不同时间点各受试菌培养物的A_值绘制其生长曲线，再依据各受试菌的生长曲线变化来表示重组蛋白的抑菌效果。结果显示，该大黄鱼抗菌肽hepcidin重组蛋白对2株水产病原菌嗜水气单胞菌和副溶血弧菌具有较为明显的抑制作用，显示出其在水产抗菌剂研发中的应用前景。
10.如权利要求9所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因的酵母表达产物,其特征在于在步骤2)中，所述LB液体培养基的配方为:胰化蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaC110g/L ；在步骤3)中，所述透 析缓冲液的配方为:20mM NaH2PO4,0.5M NaCl。
全文摘要
一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其制备方法与应用，涉及大黄鱼抗菌肽基因。克隆基因全长cDNA序列，扩增出基因片段，再克隆到毕赤酵母表达载体，构建得重组表达载体；将经线性化的重组表达载体电击转化巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株，经筛选及基因组PCR扩增鉴定得巴斯德毕赤酵母SMD1168/pPICZαA-hepcidin，将表达载体电击转化巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株，作为对照菌株，在培养基中经诱导、培养，离心收集上清，在上清中得到分泌型表达；纯化该重组蛋白在上清中加入NaCl至终浓度为0.2M，上清液过滤，上柱，过柱，再洗脱目的蛋白，纯化后的蛋白透析，即得。
文档编号C12N15/81GK103224893SQ201310172478
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者陈新华, 汪玉华, 敖敬群 申请人:国家海洋局第三海洋研究所