大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法
【专利摘要】本发明属于发酵工程【技术领域】，具体涉及一种大量生产γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。所述枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.7288。本发明所获得的诱变菌株SY-ND-SFX029与常规γ-PGA生产菌相比，其γ-PGA生产能力强，并由此能够有效提高γ-PGA的生产效率，降低生产成本。
【专利说明】大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵工程【技术领域】，具体涉及一种大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。
【背景技术】
[0002]Y -聚谷氨酸[Y-poly (glutamic acid), Y-PGA],是由 L-谷氨酸[L_Glu]、D_ 谷氨酸[D-Glu]单体通过Y-谷氨酰胺键结合而成的一类均聚氨基酸。近年来对这种高分子材料的研究开发进展迅速，该种材料可以自然降解，而且降解产物无毒害，不会对环境产生二次污染。Y -PGA作为一种高分子聚合物，具有许多独特的物理、化学和生物学特性，例如可生物降解性、强吸水性、良好的生物相容性、可塑性、粘结性等特性。这些特性使其具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和黏结等有益功能。因此，在注重环保，强调可持续发展的今天，Y-PGA及其衍生物在农业、环保、医药、水处理及化妆品工业等领域有着广泛应用前景。
[0003]Y-PGA是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到的聚合氨基酸之一。1937年Ivaovics等在病原菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的荚膜中首次发现了Y-PGA，此后在一些非致病性的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)革兰氏阳性菌的荚膜中也发现了 Y-PGA的存在，例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。Y-PGA作为某些微生物荚膜的主要成分之一，很多环境下是作为微生物的一种适应性因子存在，如保护细胞不受蛋白酶的攻击或高盐环境下保持水分的吸收。Y-PGA对环境无污染，为绿色生物产品。目前日本、我国台湾和美国等对Y-PGA发酵的研究处于世界领先水平，很多相关的生产工艺和技术已经形成专利。其中我国台湾味丹企业已经实现了 Y-PGA的商业化生产。
[0004]目前合成Y-PGA的主要方法是微生物发酵法、化学合成法、提取法等。化学合成法面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低。Y-PGA作为一种高分子聚合物，其许多物理化学性质与分子量密切相关，采用化学合成法得到的Y -PGA分子量较低，而提高产物分子量必将大大降低产率，因此，该方法不具备实际应用价值。提取法由于Y-PGA固有的特性，使得提取工艺复杂，成本较高，无法大规模生产。Y-PGA的制备方法主要集中在微生物发酵合成，微生物发酵法工艺简单、培养条件温和、周期短且适合于大规模生产，因此，微生物发酵法是目前制备Y-PGA最具有工业化前景的生产方法。但该方法产量不高是制约其大规模工业生产的主要原因。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0007]—种大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SY-ND-SFX029已于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为:CGMCC N0.7288。
[0008]所述菌株以纳豆中筛选出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SY-ND为出发菌株经常压室温等离子体诱变后得到；其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SY-ND已于2011年9月6日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为=CGMCCN0.5224。
[0009]大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，将所述诱变菌株枯草芽孢杆菌于保藏培养基中，在30-37°C活化12-24h ;活化后菌株于种子培养基中，于30-37°C，100-150rpm下培养1_2天，作为种子液；将所得种子液以4-8% (v/v)接种比例接种于发酵培养基中，在30-37°C下，100-150rpm振荡培养2_4天。
[0010]所述保藏培养基(LB培养基):胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaC110g/L,琼脂15-20g/L，蒸馏水 1.0L, ρΗ7.2 ；
[0011]所述种子培养基:蛋白胨6-15g/L,葡萄糖5-10g/L,酵母膏3-lOg/L, NaC15_8g/L,ρΗ6.0-7.0, K2HPO40.5-lg/L, KH2PO40.5-lg/L, MgSO40.5-lg/L，水 1.0L ；
[0012]发酵培养基:L-谷氨酸钠25-35g/L，蔗糖25_40g/L，蛋白胨6_20g/L，K2HPO40.5-lg/L, MgSO40.5-lg/L, KH2PO40.5-lg/L, CaCl20.1-0.3g/L, MnSO4.H2O0.05-0.08g/L，蒸馏水 1.0L, pH6.6-7.2。
[0013]本发明所具有的优点:本发明所获得的诱变菌株SY-ND-SFX029与常规Y -PGA生产菌相比，其Y-PGA生产能力强，并由此能够有效提高Y-PGA的生产效率，降低生产成本。
[0014]具体实施方法
[0015]下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能一次限定本发明的保护范围。
[0016]实施例1
[0017]以枯草芽孢杆菌SY-ND为出发菌株采用常压室温等离子体诱变技术筛选菌株SY-ND-SFX029
[0018]1.诱变菌株SY-ND-SFX029的获得
[0019](I)选择生长良好的Y -聚谷氨酸生产菌株SY-ND斜面菌种，接种至菌种保藏培养基活化12h，对活化后的菌液适当稀释至0D600值0.8-1.2，取微量上述稀释好的菌液于等离子体诱变育种机，在距离离子源2mm处,分别照射10s、30s、lmin、2min、3min、4min、5min,对照射后菌液适当稀释涂平板，于30°C恒温培养，计算致死率。
[0020]所述菌株SY-ND已于2011年9月6日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.5224。保藏培养基:蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏 3g/L、NaC15g/L，ρΗ7.0。
[0021](2)根据(I)的计算结果，致死率为80%时正突变率大于负突变率，当致死率高于90%时，负突变率较高，所以选择致死率为80%-90%的处理组，即上述对菌株SY-ND分别照射lmin、2min、3min的三组等离子体照射处理组，对处理结果梯度稀释涂平板，恒温培养。
[0022](3)把(2)中的诱变菌株接种到发酵培养基的固体平板上培养，选择培养基中菌落边缘较为整齐、粘稠、透明，用接种环触碰呈拉丝状，即得高产聚谷氨酸诱变菌株。所述发酵培养基的固体平板培养基为L-谷氨酸钠30g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L，K2HP04lg/L,KH2PO41g/L, MgSO40.5g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4.H2O0.05g/L,琼脂粉 18g/L，蒸馏水 1.0L,pH6.8，
[0023](4)取(3)中得到的多株菌株接种到发酵培养基中，在30°C下，120rpm振荡培养3天，即得到聚谷氨酸高产菌株SY-ND-SFX029。
[0024]聚谷氨酸高产菌株SY-ND-SFX029已于2013年3月8日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCCN0.7288。
[0025]发酵培养基成分为L-谷氨酸钠30g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L，K2HP04lg/L,KH2PO41 g/L, MgSO40.5g/L, CaCl20.25g/L, MnSO4.H2O0.05g/L, pH6.8，蒸馏水 1.0L, 121。。灭菌 20min。
[0026]培养条件:250mL摇瓶，装液量40mL，30°C，120rpm,振荡培养3天。
[0027]2.诱变菌株SY-ND-SFX029的特性
[0028](I)菌体形态:菌体着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动，为革兰氏阳性菌。
[0029](2)菌落形态:菌落大体呈圆形，面积较大，菌苔边缘整齐，菌落不透明且粘度大，接种环触碰有拉丝状。当发酵培养基中添加适量L-谷氨酸钠时，菌落拓展明显，菌落表面呈“木耳状”，倒置培养时，菌落悬挂呈滴落状。
[0030](3)培养特征:37°C，120rpm震荡培养3天，成熟发酵液颜色为浅黄色。
[0031](4)可以利用的碳源:葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、柠檬酸、甘油、糖蜜、L-谷氨酸钠，上述碳源可以选择性混合使用。
[0032](5)可以分别以葡萄糖、蔗糖为唯一碳源进行生长，并且生长良好。
[0033](6)可以利用的氮源:蛋白胨、鱼粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏，上述氮源可单一使用，也可选择性混合使用。
[0034]实施例2
[0035]枯草芽孢杆菌SY-ND-SFX029的培养
[0036]1.培养基的配制
[0037](I)保藏培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaC110g/L，琼脂18g/L，蒸馏水
1.0L, ρΗ7.2，121°C高压蒸汽灭菌 20min。
[0038](2)种子培养基:蛋白胨6g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，NaC15g/L, ρΗ6.5，K2HPO40.5g/L, KH2PO40.5g/L, MgSO40.5g/L，蒸馏水 1.0L, 121 °C 高压灭菌 20min。
[0039](3)发酵培养基:L-谷氨酸钠25g/L，蔗糖30g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO40.5g/L, KH2PO40.5g/L, CaCl20.25g/L, MnSO4.H2O0.05g/L，蒸馏水 1.0L, pH6.8，121。。高压蒸汽灭菌20min。
[0040]2.菌种活化
[0041]将枯草芽孢杆菌SY-ND-SFX029转接种子培养基中斜面培养，即于恒温培养箱中，37°C 培养 12h。
[0042]3.种子培养
[0043]选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述I中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装40mL培养基)中，于37°C，120rpm振荡培养24h。
[0044]4.发酵培养
[0045]将3中制得的种子培养液按4% (v/v)接种量接种于发酵培养基中(250mL三角瓶内装40mL培养基)，于37°C，120rpm培养3天。
[0046]检测结果:诱变枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SY_ND_SFX029在发酵培养基发酵生产Y -聚谷氨酸产量为25.5g/L。出发菌株SY-ND的聚谷氨酸发酵产量为7.lg/L，经诱变选育后菌株产量比出发菌株产量提高2.6倍。
【权利要求】
1.一种大量生产Y -聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SY-ND-SFX029已于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.7288。
2.按权利要求1所述的大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，其特征在于:所述菌株以纳豆中筛选出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SY-ND为出发菌株经常压室温等离子体诱变后得到；其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SY-ND已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC N0.5224。
3.一种权利要求1所述的大量生产Y -聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于:将所述诱变菌株枯草芽孢杆菌于保藏培养基中，在30-37°C活化12-24h ；活化后菌株于种子培养基中，于30-37°C，100-150rpm下培养1_2天，作为种子液；将所得种子液以4-8%(v/v)接种比例接种于发酵培养基中，在30-37°C下，100-150rpm振荡培养2_4天。
4.按权利要求3所述的大量生产Y-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于: 所述保藏培养基(LB培养基):胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L,琼脂15-20g/L，蒸馏水 1.0L, ρΗ7.2 ； 所述种子培养基:蛋白胨6-15g/L，葡萄糖5-10g/L，酵母膏3-10g/L，NaC15_8g/L，ρΗ6.0-7.0, K2HPO40.5-lg/L，KH2PO40.5-lg/L, MgSO40.5-lg/L，蒸馏水 1.0L ；
发酵培养基:L_ 谷氨酸钠 25-35g/L，蔗糖 25-40g/L，蛋白胨 6_20g/L，K2HPO40.5-lg/L,MgSO40.5-lg/L, KH2PO40.5-lg/L, CaCl20.1-0.3g/L, MnSO4.H2O0.05-0.08g/L,蒸馏水 1.0L,pH6.6~7.2o
【文档编号】C12N1/20GK104164376SQ201310187362
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】李秀颖, 沈飞翔, 朱希坤, 闫海生, 王芳 申请人:中国中化股份有限公司, 沈阳化工研究院有限公司