Sacs基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了分离的核酸、分离的多肽、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统以及用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。其中，该分离的核酸即SACS突变体，与SEQ?ID?NO：1相比具有c.1229delT突变，或者c.5840C>G突变。通过检测这些突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病。
【专利说明】SACS基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及SACS基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的核酸、分离的多肽、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统以及用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。
【背景技术】
[0002]遗传性疫挛性共济失调(spasticataxia of the Charlevoix-Saguenay type,SACS)是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，以进行性小脑功能障碍，伴反射亢进痉挛状态的锥体束征及伴肌萎缩的感觉运动性周围神经病为临床表现。SACS病多在1-5岁发病，最初临床表现为行走能力较同龄儿童推迟，步态不稳和频繁跌倒，在发病早中期，构音障碍和痉挛性截瘫是其主要的临床表现，随着病情的发展，下肢的周围神经病变逐渐明显，锥体束征逐渐被日益严重的周围神经病变所掩盖，在疾病的后期常可看到远端肌萎缩、弓形足和槌状趾，而下肢的病理征甚至会被这些症状所掩盖，部分患者可伴发有轻度的智力发育障碍或精神行为异常。病情进展相对缓慢，在发病30-40年后，多数患者需要做轮椅。头颅MRI可显示小脑蚓部萎缩，神经电图和神经活检显示严重的轴性神经病变伴随轻度的脱髓鞘，感觉神经纤维往往较运动神经纤维损伤严重，肌肉活检常可看到组织总线粒体DNA的缺失。
[0003]现阶段，寻找致病基因对疾病诊断或治疗意义重大。目前已知SACS为痉挛性共济失调病的致病相关基因，且已发现多个致病基因位点，但仍存在着相当一部分未知致病基因位点。
[0004]因而，目前对痉挛性共济失调病的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法。
[0006]本发明是基于发明人的下列工作而完成的:发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了痉挛性共济失调病的致病基因上的新突变。
[0007]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID N0:1相比，该核酸具有c.1229delT突变，或者c.58400G突变。根据本发明的实施例，发明人确定了 SACS基因突变体，这些新突变体与痉挛性共济失调病的发病密切相关，从而通过检测这些新突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病。
[0008]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO:2相比，该分离的多肽具有p.Leu410X突变，或者p.Prol947Arg突变。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病。
[0009]根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，是所述生物样品易感痉挛性共济失调病的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。
[0010]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易感痉挛性共济失调病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。
[0011]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有:适于检测SACS基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述SACS基因突变体具有c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。
[0012]根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID N0:1相比具有c.5840C>G突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种SACS基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。
[0013]根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。
[0014]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0016]图1:显示了根据本发明一个实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，
[0017]A为根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统的示意图，
[0018]B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0019]C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0020]图2:显示了根据本发明一个实施例的SACS患者家系的家系图谱；
[0021]图3:显示了根据本发明一个实施例，图2所示SACS患者家系内的两名患者及其父母的SACS基因c.1229delT突变位点的Sanger测序验证峰图；
[0022]图4:显示了根据本发明一个实施例，图2所示SACS患者家系内的两名及其父母的SACS基因c.58400G突变位点的Sanger测序验证峰图；
[0023]图5:显示了图2所示SACS患者家系中患者I小脑萎缩的头部磁共振诊断图。
【具体实施方式】
[0024]下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025]SACS基因突变体
[0026]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID N0:1相比，该核酸具有c.1229delT突变，或者c.58400G突变。需要说明的是，本发明的分离的核酸编码SACS突变体，也可以称为“编码SACS突变体的核酸”，即该核酸可以理解为与编码SACS突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与SACS的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码SACS突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了 SACS基因的新突变体，这些突变体与痉挛性共济失调病的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否同时存在，可以有效地预测生物体是否易感痉挛性共济失调病。
[0027]对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0028]这些编码SACS突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法，确定的痉挛性共济失调病的致病基因上的新突变，并且在现有技术中并未见到SACS基因上的c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变与痉挛性共济失调病相关的报道。
[0029]野生型SACS基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示:
【权利要求】
1.一种分离的核酸，其特征在于， 与SEQ ID N0:1相比，所述核酸具有c.1229delT突变，或者c.5840C>G突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2.一种分离的多肽，其特征在于， 与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有p.Leu410X突变，或者p.Prol947Arg突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID N0:1相比具有c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变，是所述生物样品易感痉挛性共济失调病的指示， 任选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括: 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ；以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括: 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地，采用选自Hiseq2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括: 利用SACS基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，针对c.1229delT突变，所述SACS基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:4-5所示的核苷酸序列；针对c.58400G突变，所述SACS基因外显子特异性引物具有如SEQID NO:6-7所示的核苷酸序列。
6.一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易感痉挛性共济失调病， 任选地，所述核酸提取装置进一步包括: RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有SACS基因外显子特异性引物，以便利用SACS基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，针对c.1229delT突变，所述SACS基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:4-5所示的核苷酸序列；针对c.58400G突变，所述SACS基因外显子特异性引物具有如SEQID NO:6-7所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种。
8.一种用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有: 适于检测SACS基因突变体的试剂，其中 与SEQ ID NO:1相比，所述SACS基因突变体具有c.1229delT和c.58400G的复合杂合突变， 任选地，所述试剂为核酸探针或引物。
9.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的核酸。
10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受体细胞而获得的。
【文档编号】C12M1/34GK104178486SQ201310188366
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】沈璐, 詹自雄, 王俊岭, 唐北沙, 戴梅枝, 管李萍, 王俊 申请人:中南大学湘雅医院, 深圳华大基因科技有限公司