生产莫纳甜和莫纳甜前体的制作方法

生产莫纳甜和莫纳甜前体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了可用于从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制造莫纳甜或其盐的方法和组合物。也公开了生产吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中间体的方法。所提供的组合物包括核酸分子、多肽、化学结构和细胞。方法包括体外和体内方法，体外方法包括化学反应。
【专利说明】生产莫纳甜和莫纳甜前体[0001]本申请是国际申请号为PCT/US2004/034558、国际申请日为2004年10月21日，进入中国国家阶段的申请号为200480034841.9，名称为“生产莫纳甜和莫纳甜前体”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求2003年10月21日提交的美国临时专利申请号60/513，406的优先权，该申请被全文纳入作为参考。
【技术领域】
[0003]本公开提供了用于生产吲哚3-丙酮酸、2-羟基2_(吲哚-3基甲基)-4_酮戊二酸和/或莫纳甜(monatin)的方法和材料。
【背景技术】
[0004]吲哚-3-丙酮酸是一种强效抗氧化剂，相信它抵消了氧气浓度高的组织中的氧化应激(Politi 等色氨酸研究的最近进展”(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini 等编，Plenum Press, New York, 1996,第 291-8 页)。吲哚丙酮酸也是作为主要的植物生长激素生长素(可扩散的生长促进因子)的吲哚-乙酸(IAA)的产生途径中的中间物。在生理过程包括顶端优势、向性、纸条伸长、诱导形成层细胞分裂和生根中，亚微克量的IAA是有活性的。园艺中用合成生长素诱导生根并促进果实形成和发育。参见例如美国专利号5，843，782和5，952，231。在高浓度时，合成生长素是有效的阔叶植物除草剂。可认为，通过发酵生产的天然生长素比化学生产的除草剂对环境更友好。1999年生长调节剂的全球销售额为4亿英镑(14亿美元)。除了植物相关用途以外，吲哚乙酸还用于药物应用。例如，美国专利号5，173，497提出，用这些化合物治疗记忆损伤，如伴随阿尔茨海默病和老年性痴呆的记忆损伤。美国专利号5，173，497中提出的机制是这些化合物抑制乙酰胆碱酯酶并提高大脑中的乙酰胆碱水平。
[0005]通过过氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸产生吲哚-3-甲醇，且可容易地转化成二吲哚甲烷。据报道，两种化合物能够消除毒素并促进产生有益于女性健康的激素。氯化D-色氨酸被鉴定为非营养性甜味剂，对探索其它衍生物的兴趣持续增加。
[0006]莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4_氨基戊二酸)是天然存在的，类似于氨基酸色氨酸成分的甜味剂。它可提取自南非灌木似冬青叶硬木朔(Sclerochitonilicifolius)的根皮，作为高强度甜味剂在食品和饮料工业中有前途。关于莫纳甜的专利的一些例子包括:美国专利号 5，994，559 ;4，975，298 ;5，128，164 和 5，128，482。

【发明内容】

[0007]本发明涉及莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸一也称为4-氨基-2-羟基-(IH-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者根据另一种编号系统，称为4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，该化合物具有下式:
[0008]NH2
IOH I
o> °




LJ


n
[0009]莫纳甜也有以下化学名称:3-(1-氨基-1，3- 二羧基-3-羟基-丁 -4-基)-吲哚；
4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基丁烷-4-基)-吲哚。
[0010]莫纳甜是一种天然存在的高强度甜味剂。莫纳甜有四种立体异构形式:2R, 4R( “R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；2S, 4S( “S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；2R，4S( “R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)以及2S，4R( “S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。本文中，除非另有说明，“莫纳甜”7是指莫纳甜的所有四种立体异构体，以及莫纳甜立体异构体任意组合的任何混合物(例如莫纳甜的R，R和S，S立体异构体的混合物)。
[0011]本发明部分基于确定从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸，和/或通过中间体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(莫纳甜前体，MP,莫纳甜的α-酮形式)来产生莫纳甜的几种生物合成途径。公开了可用于制造莫纳甜、吲哚-3-丙酮酸和MP的多肽和核酸序列。因为莫纳甜的有机合成需要拆分异构体，所以可利用便宜的原料并可仅产生一种异构体的生化途径在经济上更有利。
[0012]可通过吲哚-3-丙酮酸、ΜΡ、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖来产生莫纳甜(图1)。产生或制造莫纳甜或其中间体的方法见图1-3和11-13，包括将底物转化为第一种产物，然后将第一种产物转化为第二种产物，等等，直到产生所需终产物。
[0013]图1-3和11-13以框显示了可能的中间产物和终产物。例如，可用本文提供的方法和材料进行一种产物到另一种产物的转化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到ΜΡ、ΜΡ到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化学方法或生物学方法促进这些转化。术语“转化”指在将一种产物(如第一种中间体)转变成另一产物(如第二种中间体)的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽主动促进的反应。术语“生物转化”指由多肽主动促进的反应。转化可在体内或体外发生。当使用生物转化时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物上。可用本领域普通技术人员已知的任何反应器，例如在分批或连续反应器中完成转化。
[0014]也提供了方法，包括使第一种多肽接触底物，制造第一种产物，然后使产生的第一种产物接触第二种多肽，产生第二种产物，然后使产生的第二种产物接触第三种多肽，产生第三种产物，例如莫纳甜。所用多肽和所产生的产物见图1-3和11-13。
[0015]公开了可用于进行图1-3和11-13中所示转化的多肽及其编码序列。在一些实施例中，具有一个或多个改变多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。
[0016]公开了产生莫纳甜的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
[0017]在具体实施例中，公开的细胞包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种，或者五种或多种)以下活性:色氨酸转氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无 EC 号，Hadar 等，J.Bacteriol 125:1096-1104,1976 和 Furuya 等，Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93，2000)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2._)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和擬基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8th International Symposium onVitamin B6and Carbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)和/ 或谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
[0018]在另一实施例中，细胞包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种，或者五种或多种)以下活性:吲哚乳酸脱氢酶(EC1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羟基苯丙酮酸还原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基_2_氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、
1.4.1.4)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D-色氨酸转氨酶和/或D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)。
[0019]此外，公开的细胞可包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种，或者五种或多种)以下活性:色氨酸转氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC编号)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羟基苯丙酮酸还原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3._)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)和/或D-色氨酸转氨酶。
[0020]能生成莫纳甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨 酸和/或吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物转化成吲哚-3-丙酮酸；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将叼丨哚-3-丙酮酸转化成MP，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转化成莫纳甜。能用于这些转化的示范多肽示于图2和3。
[0021]本发明另一方面提供了组合物如MP，含有至少一种外源性核酸序列(如至少两种、三种、四种、五种或多种外源性核酸序列)上编码的至少两种多肽，或有时至少三种或至少四种多肽的细胞。
[0022]本文提供的方法和材料可用于制造产物如莫纳甜、MP、莫纳甜中间体和莫纳甜衍生物。莫纳甜和本文所述的一些莫纳甜中间体可用作甜味剂或合成莫纳甜衍生物的中间体。
[0023]另一方面，本发明的特征是产生莫纳甜的方法。在某些实施方式中，产生莫纳甜或其盐的方法包括:(a)在培养基中培养微生物，该微生物含有至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸；和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在某些实施方式中，醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶，EC4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它实施方式中，该微生物选自苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)、稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(E.coli)。或者，该微生物可选自棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(brevibacterium)。
[0024]在其它实施方式中，培养基含有非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物(如氨苄青霉素)或其组合。非离子去污剂包括吐温、Triton X-100或十二烷基乙酸铵。在一个实施方式中，培养基含有浓度小于5 μ g/L的生物素。在另一实施方式中，在培养微生物之前，培养基的PH约为pH7-pH8。此外，培养基可包括糖蜜、玉米浆或其组合。
[0025]在一些实施方式中，该微生物是大肠杆菌，培养基是Trp-1+葡萄糖培养基。在其它实施方式中，该微生物的生长需要苯丙氨酸和酪氨酸，培养基含有苯丙氨酸和酪氨酸。该微生物也可含有aspC和proA基因。此外`，该微生物可以是产生和分泌谷氨酸的谷氨酸棒杆菌。在一些实施方式中，该微生物(如谷氨酸棒杆菌)分泌莫纳甜或其盐。在另一实施方式中，在发酵罐中培养微生物。
[0026]在一些实施方式中，培养基含有色氨酸、丙酮酸，非离子去污剂(如吐温)，青霉素，青霉素衍生物或其组合。在其它实施方式中，转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
[0027]此外，本发明的特征是产生莫纳甜或其盐的方法，包括:(a)在培养基中培养谷氨酸棒杆菌(ATCC13058);和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，培养基含有吐温、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
[0028]本发明的特征还有具有至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合，其中所述微生物产生莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶，EC4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它实施方式中，转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.21)。微生物可包括过量产生丙酮酸的微生物，和/或是硫胺营养缺陷型，苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型或硫辛酸营养缺陷型。
[0029]在一些实施方式中，微生物选自光滑假丝酵母(Candida glabrata)、皮状丝抱酵母(Trichosporon cutaneum)、脂解假丝酵母(Candida lipolytica)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它实施方式中，该微生物含有aspC基因和proA基因。在某些实施方式中，该微生物含有aspC基因和proA基因和至少一个色氨酸操纵子基因。在其它实施方式中，该微生物是大肠杆菌。在其它实施方式中，该微生物含有缺陷的F1_ATP酶基因，破坏的内源性IipA基因，破坏的pheA基因，破坏的内源性色氨酸酶(tna)基因和/或一种或多种色氨酸生物合成基因的两个或多个拷贝。在一些实施方式中，该微生物过量产生色氨酸。在其它实施方式中，该微生物过表达ppsA基因,相对于相应的对照微生物,3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖 7_ 憐酸(3-deoxy-D-arabino-hapatulosonic 7-phosphate acid)(DAHP)合酶活性提高，它包括编码具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，该核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合和/或tkt基因。在其它实施方式中，该微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0030]在一些实施方式中，该微生物还含有编码具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。在其它实施方式中，该微生物分泌莫纳甜或其盐和/或是脂肪酸营养缺陷型。在其它实施方式中，该微生物是含有表达醛缩酶的核酸的细菌菌株，其中由该核酸表达的醛缩酶能够产生富含立体异构体的莫纳甜混合物。在一些实施方式中，富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是S，S莫纳甜或其盐。或者，富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是R，R莫纳甜或其盐。在一个实施方式中，该微生物过表达至少一种编码色氨酸摄取多肽的核酸。
[0031]在另一方面，本发明的特征是产生莫纳甜或其盐的方法，该方法包括:(a)在产生莫纳甜或其盐的条件下在培养基中培养产生莫纳甜或其盐的微生物，和(b)从培养基或培养的微生物中获得莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，该微生物分泌莫纳甜或其盐和/或是脂肪酸营养缺陷型。
[0032]此外，本发明也包括`鉴定能够合成莫纳甜或其盐的细胞的方法，该方法包括:(a)在选自莫纳甜或其盐、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐、莫纳甜或其盐的类似物、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐的类似物，及其组合的碳/能源的存在下培养细胞；和(b)测试细胞生长，其中细胞生长说明细胞将碳源/能源转化成丙酮酸，从而说明该细胞能够合成莫纳甜或其盐。在一个实施方式中，细胞是丙酮酸营养缺陷型，在细胞中通过代谢碳/能源产生丙酮酸。在其它实施方式中，该细胞含有破坏的PykA和pykF基因。
[0033]而且，本发明的特征是鉴定能够由色氨酸合成莫纳甜或其盐或2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸或其盐或其组合的细胞的方法，该方法包括:(a)在不存在色氨酸而存在莫纳甜或其盐、2-羟基2 (吲哚-3-基甲基)4-酮戊二酸或其盐或其组合的情况下培养色氨酸营养缺陷型细胞；和(b)测试色氨酸营养缺陷型细胞的生长，其中细胞生长说明该细胞能够从莫纳甜或其盐，2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合合成色氨酸，从而说明该细胞能够由色氨酸合成莫纳甜或其盐或2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合。
[0034]本发明的特征还有产生莫纳甜或其盐的方法，该方法包括:(a)在培养基中培养微生物，其中该微生物选自苜蓿中华根瘤菌、睾丸酮丛毛单胞菌、稻草假单胞菌和谷氨酸棒杆菌；和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，该微生物未经遗传修饰。在其它实施方式中，培养基是PHB培养基。培养基也可包括色氨酸、丙酮酸、非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。在一些实施方式中，该微生物是苜蓿中华根瘤菌或睾丸酮丛毛单胞菌。在其它实施方式中，该微生物是睾丸酮丛毛单胞菌，和/或培养基还含有色氨酸和丙酮酸。在其它实施方式中，培养基是TY培养基。培养基也可包含色氨酸、丙酮酸或其组合。
[0035]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的涵义与本发明所涉及【技术领域】的普通技术人员所通常理解的相同。虽然在实践本发明的过程中可采用与本文所述内容相似或相同的方法和材料，但下面描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都被全文纳入作为参考。在冲突情况下，本说明书，包括定义将控制(本发明范围)。此外，材料、方法和实施例仅为示范性，不旨在限制。
[0036]通过以下详述和所附权利要求书将明白本发明的其它特征和优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]图1显示用于生成莫纳甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径通过色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种通过吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后通过MP中间体生成莫纳甜。
[0038]框中所示化合物是底物和生物合成途径中生成的产物。
[0039]与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转化成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(批哆醛5'-磷酸)能催化不依赖于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
[0040]图2是使用MP中间体的生物合成途径的更详细图。框中显示了途径中各步骤的底物。便于底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。
[0041]图3显示将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。框中显示了底物，和便于底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。
[0042]图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
[0043]图5A和5B是色谱图，显示酶法生成的莫纳甜的LC/MS鉴定。
[0044]图6是酶法合成的莫纳甜的电喷射质谱。
[0045]图7A和7B是酶混合物中生成的莫纳甜的LC/MS/MS子离子分析色谱图。
[0046]图8是色谱图，显示酶法生成莫纳甜的高分辨质谱测量。
[0047]图9A-9C是色谱图，显示(A) R-色氨酸、⑶S-色氨酸和(C)酶法生成莫纳甜的手性分离。
[0048]图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的莫纳甜的相对量。(_)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
[0049]图11-12是示意图，显示用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0050]图13是示意图，显示能用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0051]图14是描述遗传修饰的大肠杆菌7692和BW25113细胞中丙酮酸产量增加的图。
[0052]图15是描述在过量产生丙酮酸的培养基中生长的遗传修饰的大肠杆菌7692和BW25113细胞中丙酮酸产量增加的图。
[0053]图16是从睾丸酮丛毛单胞菌(ATCC49249)中克隆的proA基因的核酸序列。
[0054]图17是由来自睾丸酮丛毛单胞菌(ATCC49249)的基因编码的ProA醛缩酶多肽的氨基酸序列。
[0055]序列表
[0056]所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用标准字母缩写(核酸碱基)和三字母编码(氨基酸)表示的。只显示各核酸序列的一条链，但参照所示链应理解包括互补链。
[0057]SEQ ID NO:1和2分别列出来自苜蓿中华根瘤菌的转氨酶(tatA基因，在文献中称为酪氨酸转氨酶或芳族转氨酶)的核酸和氨基酸序列。
[0058]SEQ ID NO:3和4分别列出来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的酿氛酸转氨酶(2.4.1)(与tatA (SEQ ID NO:1和2)同源)的核酸和氨基酸序列。
[0059]SEQ ID NO:5和6分别列出来自类球红细菌(35053)(新颖，根据2.4.1序列SEQID NO:3和4克隆)的转氨酶的核酸和氨基酸序列。
[0060]SEQ ID NO:7和8分别列出来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的广谱底物转氨酶(bsat)的核酸和氨基`酸序列。
[0061]SEQ ID NO:9和10分别列出来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 11 和 12分别列出来自食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族转氨酶(araT)(通过同源性鉴定为芳族转氨酶)的新核酸和氨基酸序列。
[0063]SEQ ID NO:13和14分别列出来自类球红细菌(35053)的多底物转氨酶(msa)(通过与登录号AAAE01000093.1，bpl4743_16155和登录号ZP00005082.1同源鉴定为多底物转氨酶)的核酸和氨基酸序列。
[0064]SEQ ID NO:15和16列出用于克隆枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat)基因序列的引物的核酸序列。
[0065]SEQ ID NO:17和18列出用于克隆苜蓿中华根瘤菌tatA序列的引物的核酸序列。
[0066]SEQ ID NO:19和20列出用于克隆枯草芽孢杆菌araT转氨酶序列的引物的核酸序列。
[0067]SEQ ID NO:21和22列出用于克隆类球红细菌(2.4.1和35053)多底物转氨酶序列的引物的核酸序列。
[0068]SEQ ID NO:23和24列出用于克隆硕大利什曼原虫bsat序列的引物的核酸序列。
[0069]SEQ ID NO:25和26列出用于克隆食淀粉乳杆菌araT序列的引物的核酸序列。
[0070]SEQ ID NO:27和28列出用于克隆类球红细菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物的核酸序列。
[0071]SEQ ID NO:29和30列出用于克隆大肠杆菌aspC序列(基因序列Genbank登录号:ΑΕ000195.1，蛋白质序列Genbank登录号:AAC74014.1)的引物的核酸序列。
[0072]SEQ ID NO:31和32分别列出来自大肠杆菌的芳族转氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
[0073]SEQ ID NO:33和34列出用于克隆大肠杆菌tyrB序列的引物的核酸序列。
[0074]SEQ ID NO: 35-40列出用于克隆具有4_羟基_2_氧戊二酸醛缩酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0075]SEQ ID NO:41和42列出来自大肠杆菌的色氨酸酶(tna)基因和来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸-酹裂合酶(tpl)基因的核酸序列，它们分别编码蛋白质 P00913 (G1:401195)和 P31013 (G1:401201)。
[0076]SEQ ID NO:43_46列出用于克隆色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物的核酸序列。
[0077]SEQ ID NO:47_54列出用于使色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶多肽突变的引物的核酸序列。
[0078]SEQ ID NO:55_64列出用于克隆具有4_羟基_4_甲基_2_氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0079]SEQ ID NO:65和66列出来自睾丸酮丛毛单胞菌的4_羟基_4_甲基_2_氧戊二酸醛缩酶(ProA)的核酸和氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:67-68列出用于在pET30Xa/LIC中具有大肠杆菌aspC的操纵子中克隆睾丸酮丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(ρι.οΑ)的引物的核酸序列。
[0081]SEQ ID NO:69-72列出用于在pESC-his中克隆大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA的引物的核酸序列。
[0082]SEQ ID NO:73_74列出加`到用于克隆本文所公开基因的引物5'端的核酸序列。
[0083]SEQ ID NO:75和76列出用于缩短aspC和proA基因之间的间插序列的引物的核酸序列。
[0084]SEQ ID NO:77和78列出用于在pPRONco中克隆大肠杆菌tnaA的引物的核酸序列。
[0085]SEQ ID NO:79和80列出用于在pPRONco中克隆大肠杆菌色氨酸操纵子(trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因)的引物的核酸序列。
[0086]SEQ ID NO:81和82分别列出质粒pGX50 (来自5_甲基色氨酸抗性细胞)的trpE基因的核酸和氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:83和84列出用于将含有睾丸酮丛毛单胞菌4_羟基_4_甲基_2_氧戊二酸醛缩酶(ProA)和大肠杆菌aspC的操纵子克隆到棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pEKEX-2中的引物的核酸序列。
[0088]SEQ ID NO:85和86列出用于在大肠杆菌中产生pykA敲除的引物的核酸序列。
[0089]SEQ ID NO:87和88列出用于在大肠杆菌中产生pykF敲除的引物的核酸序列。
[0090]SEQ ID NO:89列出来自食淀粉乳杆菌的芳族转氨酶(araT)的前十个氨基酸(SEQID NO:12)。
【具体实施方式】
[0091]提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，单数形式也指复数，除非上下文另有明确规定。例如，提到“含有一种蛋白”包括一种或多种这样的蛋白，提高“含有细胞”包括一种或多种细胞和本领域技术人员已知的它的等价物，等等。术语“约”包括发生于任何测定中的实验误差的范围。除非另有说明，假定所有的测定数字前面都有“约”字，即使没有明显地使用“约”字。
[0092]cDNA(互补DNA):缺少内部非编码节段(内含子)和决定转录的调节序列的一段DNA。可在实验室中通过提取自细胞的信使RNA逆转录合成cDNA。
[0093]保守取代:生化特性相似的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸取代(如2、5或10个残基)。保守取代一般对得到的多肽的活性影响小或无影响。例如，包含一个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽理想地保持色氨酸转氨酶活性。可通过用，例如标准方法如定位诱变或PCR来操作编码该多肽的核苷酸序列来产生含有一个或多个保守取代的多肽。
[0094]取代变体是氨基酸序列中至少一个残基被去除，并在其位置中插入了一个不同残基的变体。可用来取代蛋白质中原始氨基酸的并认为是保守取代的氨基酸的例子包括:用丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸；用谷胺酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸；用谷氨酸、谷胺酰胺、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸取代天冬酰胺；用天冬酰胺、谷氨酸或谷胺酰胺取代天冬氨酸；用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷胺酰胺；用天冬氨酸、谷胺酰胺、赖氨酸或精氨酸取代谷氨酸；用脯氨酸取代甘氨酸；用天冬酰胺、赖氨酸、谷胺酰胺、精氨酸、酪氨酸取代组氨酸；用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代异亮氨酸；用异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；用天冬酰胺、谷氨酸、谷胺酰胺、组氨酸、精氨酸取代赖氨酸；用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；用苏氨酸、丙氨酸取代丝氨酸；用丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸；用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；用组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；用甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸取代缬氨酸。参见 Ben-Bassat 等(J.Bacteriol.169:751-7，1987)，O，Regan 等(Gene77:237-51，1989)，Sahin-Toth 等(Protein Sc1.3:240-7，1994), Hochuli 等(Bio/Technology6:1321-5,1988)，W000/67796 (Curd等)或遗传学和分子生物学的标准教科书，以了解关于保守取代的更多信息。`
[0095]外源性:在提到核酸和特定细胞时本文所用术语“外源性”指在天然情况下不是源自该特定细胞的任何核酸。因此，认为在引入细胞时，非天然存在的核酸对细胞来说是外源性的。对于特定细胞而言，天然存在的核酸也可以是外源性的。例如，当将分离自人X的细胞的整个染色体引入人Y的细胞时，它对Y的细胞来说是外源性核酸。在细胞中外源性核酸表达产生“外源性”蛋白。
[0096]功能等效:具有等效功能。在酶中，功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通过酶序列中的序列改变来提供功能等效物，其中具有一个或多个序列改变的多肽保持了未改变多肽的功能(如酶活性)。在具体实施例中，色氨酸转氨酶功能等效物保持了将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。
[0097]序列改变的例子包括但不限于:保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个实施例中，给定多肽与抗体结合，功能等效物是与相同抗体结合的多肽。因此，功能等效物包括结合特异性与多肽相同的肽，可用作代替该多肽的试剂。在一个实施例中，功能等效物包括结合序列不连续、抗体与线性表位结合的多肽。因此，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO:12的氨基酸1-10) (SEQ ID NO:89)，功能等效物包括不连续的表位，可以是(**=任何数量的间插氨基酸):NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L_COOH。在这个例子中，如果该多肽的三维结构使其可以结合能结合SEQ ID NO:12的氨基酸1-10的单克隆抗体，那么该多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸1_10功能等效。
[0098]杂交:本文所用术语“杂交”指根据互补的单链DNA和/或RNA形成双链体分子的能力来测试两个核酸分子的核苷酸序列的互补性的方法。在本发明范围内，核酸杂交技术可用于获得分离的核酸。简要说，与SEQ ID NO:11所列序列或其部分有同源性的任何核酸可用作在中等至高度严谨条件下杂交鉴定相似核酸的探针。鉴定后，可纯化、测序并分析该核酸，以确定它是否在本发明范围内。
[0099]可通过Southern或Northern分析进行杂交来分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。可用生物素、洋地黄毒苷、多肽或放射性同位素如32P来标记探针。可以在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离待分析的DNA或RNA，转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适的膜上，用本领域熟知的标准技术用探针杂交，如Samtoook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY 的第7.39-7.52节所述。探针的长度一般至少约20个核苷酸。例如，对应于SEQ ID NO:11所列20个毗连核苷酸序列的探针可用于鉴定相同或相似的核酸。此外，可采用长于或短于20个核苷酸的探针。
[0100]本公开也提供了长度至少约为12个碱基(如，长度至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)并
且在杂交条件下与具有SEQ ID NO:11所列核酸序列的正义或反义链杂交的分离核酸序列。杂交条件可以是中等或高度严谨的杂交条件。就本公开目的而言，中等严谨的杂交条件意味着在约 42°C 下在含有 25mM KPO4 (pH7.4)、5X SSC、5X Denhart 溶液、50 μ g/mL 经超声处理的变性鲑精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探针(约5xl07cpm/ μ g)的杂交溶液中进行杂交，而在约50°C下用含有2X SSC和0.1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗漆。
`[0101]高度严谨的杂交条件意味着在约42°C下在含有25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5XDenhart溶液、50 μ g/mL经超声处理的变性鲑精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探针(约5xl07cpm/μ g)的杂交溶液中进行杂交，而在约65°C下用含有0.2X SSC和0.1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。
[0102]分离:在提及核酸时，本文所用术语“分离”指不与来源于天然存在的生物体基因组中直接毗连(一个在5'端，一个在3'端)的序列直接毗连的天然存在的核酸。例如，分离的核酸可以是，但不限于:在天然存在的基因组中，通常发现重组DNA分子侧翼的一个核酸序列被去除或不存在的任何长度的重组DNA分子。因此，分离的核酸包括但不限于:以独立于其它序列的分离分子(如用PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA以及掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。当提及核酸时，本文所用术语“分离”也包括任何非天然存在的核酸，因为在自然中未发现非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因组中非天然存在的核酸序列不具有直接毗连的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被认为是分离核酸。可用普通的分子克隆技术或化学核酸合成技术来制造工程改造的核酸。分离的非天然存在的核酸可以独立于其它序列，或掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
[0103]在例如，cDNA或基因组文库、或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中，认为存在于几百至几百万其它核酸分子中的核酸不是分离核酸。
[0104]当提及多肽时，本文所用术语“分离”指以一些方式，例如从细胞中或从以前的环境中分离的多肽。分离多肽也可指以一些方式纯化的多肽。
[0105]核酸:本文所用术语“核酸”包括RNA和DNA，DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链核酸。其中单链核酸可以是正义链或反义链。此外，核酸可以是环形或线状。一个或多个核酸可存在于较大的核酸内。例如，编码醛缩酶多肽的核酸和编码转氨酶多肽的核酸可存在于较大的单一核酸内，如基因组DNA或质粒载体。或者，编码醛缩酶多肽的核酸和编码转氨酶多肽的核酸可存在于两个不同核酸，如两个不同质粒载体中。[0106]操作性连接:当第一核酸序列与第二核酸序列发生功能性关系时，第一核酸序列“操作性连接”于第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录，将启动子操作性连接于编码序列。通常，操作性连接的DNA序列是毗连的，当需要时可将两个多肽编码区连接在相同的阅读框中。
[0107]过度表达:如果在细胞和/或微生物中产生的由特定核酸或基因编码的多肽的浓度高于相应的野生型或天然细胞和/或微生物中所产生的浓度，则细胞“过度表达”该特定核酸或基因。细胞可过度表达细胞中的外源性、重组或天然存在的(即天然)核酸或基因。例如，可通过在细胞中过度表达天然存在的核酸而在细胞中产生更高浓度的多肽，其中未遗传修饰编码多肽本身的核酸，但修饰或加入了指导核酸序列转录的启动子。术语“过度表达”也可涉及过度表达的蛋白质，即以高于相应野生型或天然细胞和/或微生物的浓度存在于细胞和/或微生物中的蛋白质。
[0108]多肽:多肽指与翻译后修饰无关的氨基酸链。
[0109]多肽修饰:本公开包括酶，及其合成实施方式。此外，本文所述方法可采用具有所需酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(用所公开的多肽序列为起点获得的化学功能化的多肽分子)和变体(同源物)。本文所公开的多肽包括可以是L-氨基酸和/或D-氨基酸，天然存在或非天然存在的氨基酸序列。
[0110]可通过各种化学技术修饰多肽，产生活性与未修饰多肽基本相同，并任选地具有其它所需特性的衍生物。例如，可以药学上可接受的阳离子盐，或酯化形成C1-C16酯，或转化成式NR1R2的酰胺的形式提供多肽的羧酸基团(羧基端或侧链)，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C16烷基或者结合形成杂环如5-元环或6-元环。多肽的氨基(氨基端或侧链)可以是药学上可接受的酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、顺丁烯二酸盐、酒石酸盐和其它有机盐形式，或可被修饰为C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺的形式。
[0111]可用熟知技术将氨基酸侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可用一个或多个卤原子如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或这种羧酸的酰胺来取代氨基酸侧链的苯基或酚环。氨基酸侧链的亚甲基可以延伸到同源的C2-C4亚烷基中。可用许多良好公认的保护基团中的任何一个，如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域技术人员也将认识到将环结构引入本公开多肽中以选择和提供对结构的构象约束，导致稳定性提高。例如，可以向多肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸，以致当氧化时，该多肽将含有二硫键，产生环状多肽。其它多肽环化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端酰胺和酯。
[0112]肽模拟物和有机模拟物实施方式也是在本公开范围之内，这种肽模拟物和有机模拟物的化学组成的三维排列模拟肽骨架和成分氨基酸侧链的三维排列，导致此公开多肽的肽模拟物和有机模拟物具有可检测的酶活性。对于计算机建模应用而言，使药效团理想化，生物活性的结构要求的三维定义。用当前的计算机建模软件(用计算机辅助药物设计或CADD)，可设计适合各药效团的肽模拟物和有机模拟物。参见例如Walters，《药物的计算机辅助建模》(Computer-Assisted Modeling of Drugs),刊于 Klegerman 和 Groves (编),《制药生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology), 1993, Interpharm Press:BuffaloGrove, IL,第 165_74 页和第 IO2 章，Munson (编),《药理学原理》(Principles ofPharmacology), 1995, Chapman和Hall,用于CADD技术的说明。用这些技术制备的模拟物也包括在本发明范围内。在一个实施例中，模拟物模拟酶或其变体、片段或融合所产生的酶活性。
[0113]探针和引物:可根据本文提供的氨基酸序列和核酸序列容易地制备核酸探针和引物。“探针”包括含有可检测标记或报道分子的分离核酸。示范性标记包括但不限于:放射性同位素、配体、化学发光剂和多肽(如酶)。例如，SambiOOk等(编)，《分子克隆:实验室手册》(《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual))第2版,第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,和 Ausubel等(编)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology) ,GreenePublishing and ffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 中讨论了标记方法和适合各种目的的标记的选择指南 。
[0114]“引物”一般是具有10个或更多个核苷酸的核酸分子(如具有约10-100个核苷酸的核酸分子)。引物可通过核酸杂交退火到互补靶核酸链上，在引物和靶核酸链之间形成杂交体，然后通过例如，DNA聚合酶多肽沿靶核酸链延伸。可通过例如，聚合酶链反应(PCR)或本领域已知的其它核酸扩增方法将引物对用于扩增核酸序列。
[0115]例如，在参考文献如Sambrook等(编)，《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ；Ausubel 等(编)，《新编分子生物学实验指 南》(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 ;和 Innis 等(编)，((PCR 方法:方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications), Academic Press:San Diego，1990中描述了探针和引物的制备和使用方法。例如，可通过用于此目的的计算机程序如 Primer (0.5 版，? 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)从已知序列获得PCR引物对。本领域技术人员将理解，具体的探针或引物的特异性随长度而提高，但探针或引物的尺寸范围是序列全长到短至五个连续核苷酸的序列。因此，例如，20个连续核苷酸的引物可退火到具有特异性高于仅15个核苷酸的相应引物的靶上。因此，为了获得更大的特异性，探针和引物可选自例如:10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050，3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450 或更多个连续核苷酸。
[0116]启动子:指导核酸序列转录的核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子可包括可位于距转录起始位点多达几千碱基对的远端增强子或阻抑元件。
[0117]纯化的:本文所用术语“纯化的”不要求绝对纯净；而打算作为相对术语。因此，例如，纯化的多肽或核酸制剂可以是主题多肽或核酸各自比在生物体的天然环境中的多肽或核酸的浓度高的多肽或核酸制剂。例如，如果制剂中多肽含量至少占总可溶性蛋白质含量的50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%，那么可认为该多肽制剂是纯化的。
[0118]重组:“重组”核酸是一种具有(I)在表达它的生物体中不天然存在的序列或(2)由两种分离的、较短的序列人工组合而成的序列。常常用化学合成，更常见的是如用遗传工程技术人工操作核酸的分离节段来完成此人工组合。“重组”也用于描述已人工操作的，但含有与发现于分离出该核酸的生物体的调节序列和编码区相同的核酸分子。“重组”多肽是由重组核酸表达的多肽。
[0119]序列同一性:用序列之间的相似性，或称为序列同一性来表示氨基酸序列之间的相似性。常常通过同一性百分数(或相似性或同源性)来量度序列同一性；此百分数越高，两个序列越相似。当用标准方法比`对时，多肽的同源物或变体，如SEQ ID N0:12具有相对较高的序列同一性。
[0120]用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法见=Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981 ;Needleman和 Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970 ;Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444-8,1988 ;Higgins和Sharp, Gene73:237-44，1988 ；Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151-3，1989 ；Corpet 等，NucleicAcids Researchl6:10881-90,1988;和 Altschul 等，Nature Genet.6:119-29,1994。
[0121]可从几种来源获得NCBI局部序列比对基本检索工具(BLAST?) (Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10，1990)，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和Internet,与序列分析软件 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 联合使用。
[0122]多肽变体一般的特征是经缺口 blastp设置为默认参数的NCBI Blast 2.0进行氨基酸序列全长比对计算具有至少50%序列同一性。对于比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列而言，采用Blast2序列函数，用设置为默认参数的默认BL0SUM62矩阵，(存在缺口损失11，每残基缺口损失I)。当比对短多肽(少于约30个氨基酸)时，用Blast2序列函数，用设置为默认参数的PAM30矩阵(开放缺口 9，延伸缺口罚分I)进行比对。当用此方法评价时，与参比序列相似性更大的多肽显示出同一性百分数提高，如序列同一性为至少80%、至少90%、至少95%、至少98%，甚至至少99%。当比较少于完整序列的序列同一性时，在10-20个氨基酸的短窗口中同源物和变体的序列同一性一般至少为80%，且序列同一性可以为至少85%、至少90%、至少95%或98%，这取决于它们与参比序列的相似性。在此短窗口中确定序列同一'I"生的方法见Bethesda,Maryland的国家生物技术信息中心维护的网站。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性的范围仅是为了指导；完全可能获得在所提供范围之外的非常有效的同源物。
[0123]类似的方法可用于确定核酸序列的序列同一性百分数。在具体实施例中，比对同源序列与天然序列，通过计算两个序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定匹配数量。通过将匹配数量除以鉴定序列(如SEQ ID N0:11)中所列序列长度，或除以分节长度(如来自鉴定序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以100来确定序列同一性百分数。例如，与SEQ ID NO:11所列序列比对时具有882个匹配的核酸序列与SEQ ID NO:11所列序列的同一性为75.0%(即(882+1176) *100=75.0)。应注意，序列同一性百分数值四舍五入到最接近的十分之一。例如，75.11,75.12,75.13和75.14四舍五入到75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19四舍五入到75.2。也应注意，长度值总是整数。
[0124]特异性结合物:能够特异性结合于本文所述任何多肽的物质。例子包括但不限于:多克隆抗体、单克隆抗体(包括人源单克隆抗体)和单克隆抗体的片段如？&13、？(&13’)2和Fv片段以及能够特异性结合于这种多肽的表位的任何其它物质。
[0125]本文所提供的多肽的抗体可用于纯化或鉴定这种多肽。本文所提供的氨基酸和核酸序列可用于生产识别本文所述多肽的基于特异性抗体的结合物。
[0126]可生产多肽、部分多肽或其变体的单克隆或多克隆抗体。多肽抗原上产生抗一个或多个表位的抗体宜特异性检测该多肽。即，产生抗特定多肽的抗体将识别和结合该特定多肽，基本不会识别和结合其它多肽。通过许多标准免疫测定方法中的任何一种，如Western印迹(参见例如，Sa`mbrook等(编)，《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)来确定抗体与特定多肽特异性结合。
[0127]为通过Western印迹测定给定抗体制剂(如在小鼠中产生的抗具有SEQ ID NO:12所列氨基酸序列的多肽的制剂)特异性检测合适的多肽(如具有SEQ ID N0:12所列氨基酸序列的多肽)，从细胞中抽提细胞总蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
[0128]然后，可将分离的细胞总蛋白转移到膜(如硝酸纤维素)上，用抗体制剂孵育该膜。洗涤膜去除非特异性结合的抗体后，可用合适的偶联于多肽如碱性磷酸酶的第二抗体(如抗鼠抗体)检测存在的特异性结合的抗体，因为通过免疫定位的碱性磷酸酶应用
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑鎗导致产生深蓝色化合物。
[0129]适合用作免疫原的基本纯的多肽可获自转染细胞、转化细胞或野生型细胞。通过，例如Amicon过滤装置浓缩将最终制剂中多肽浓度调整到几微克/微升的水平。此外，大小范围是全长多肽至少达9个氨基酸残基的多肽可用作免疫原。这种多肽可在细胞培养物中产生、可用标准方法化学合成或可通过将大多肽切割成可纯化的较小多肽而获得。在主要组织相容性复合体(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情况下，当呈递给免疫系统时，长度少达9个氨基酸残基的多肽可具有免疫原性。因此，具有本文所公开的任何氨基酸序列的至少 9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、I100、1150、1200、1250、1300、1350或更多个连续氨基酸残基可用作生产抗体的免疫原。
[0130]可根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256:495-7,1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备本文所公开的任何多肽的单克隆抗体。
[0131]可通过用多肽(或其片段)免疫合适的动物来制备含有本文所公开任何多肽的异源表位的抗体的多克隆抗血清，该多肽可以是未修饰或经修饰提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可参见 Vaitukaitis 等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-91，1971)。
[0132]可用抗体片段代替整个抗体，并可在原核宿主细胞中容易地表达抗体片段。制造和使用单克隆抗体的免疫有效部分，也称为“抗体片段”的方法是熟知的，包括 Better 和 Horowitz (Methods Enzymol.178:476-96，1989)、Glockshuber 等(Biochemistry29:1362-7, 1990)、美国专利号5，648，237 ( “功能性抗体片段的表达”(Expression of Functional Antibody Fragments))、美国专利号 4，946，778 ( “单多妝链结合分子”(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美国专利号5，455，030 ( “采用单链多肽结合分子的免疫疗法”(Immunotherapy Using Single ChainPolypeptide Binding Molecules))和其中引用的参考文献中描述的方法。
[0133]转化:“转化”细胞是通过例如分子生物学技术引入了核酸分子的细胞。转化包括可将核酸分子引入细胞的所有 技术，包括但不限于:用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化和通过电穿孔引入裸DNA、脂质转染和基因枪加速。
[0134]变体、片段或融合多肽:所公开的多肽包括其变体、片段和融合物。经工程改造，编码多肽(例如SEQ ID NO:12)、融合多肽或多肽片段或变体的DNA序列(例如SEQ ID NO:
11)可在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达该多肽。为了获得表达，可改变DNA序列，且操作性连接于其它调节序列。将含有调节序列和多肽编码序列的最终产物称为载体。可将该载体引入真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞和/或植物细胞。引入细胞后，该载体可产生所述多肽。
[0135]融合多肽可包括连接于不抑制所需多肽活性(例如，将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的能力)的其它氨基酸序列的多肽，如芳族转氨酶(例如，SEQ ID N0:12)。在一个实施例中，所述其它氨基酸序列的长度不超过约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸。
[0136]本领域普通技术人员将理解，可用不影响编码多肽生物活性的许多方式改变DNA序列。例如，可用PCR在编码多肽的DNA序列中产生变异。这种变体可以是用于表达该多肽的宿主细胞中密码子偏好优化的变体，或促进表达的其它序列改变。
[0137]载体:将核酸分子引入细胞，产生转化细胞。载体可包括允许它在细胞中复制，如含有复制起点的核酸序列。载体也可包括一个或多个可选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。
[0138]生物合成途径概述
[0139]如图1-3和11-13所示，可用许多生物合成途径产生莫纳甜或其中间体如吲哚-3-丙酮酸或MP。对各底物(如葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各产物(如色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫纳甜)的转化，可采用几种不同多肽。而且，可在体内、体外、或通过体内反应和体外反应的组合，如包括无酶化学反应的体外反应来进行这些反应。因此，图1-3和11-13是示范，显示可用于获得所需产物的多种不同途径。
[0140]葡萄糖到色氨酸
[0141]许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成莫纳甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转化成吴纳甜。
[0142]在其它例子中，用已知多肽改造生物体可产生色氨酸或过量产生色氨酸。例如，美国专利号4，371，614描述了用含野生型色氨酸操纵子的质粒转化大肠杆菌菌株。色氨酸操纵子基因包括编码多肽邻氨基苯甲酸合酶组分I (EC4.1.3.27)、邻氨基苯甲酸合酶组分IKEC4.1.3.27)、N-(5'-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(EC5.3.1.24)/吲哚-3-甘油磷酸合酶(EC4.1.1.48)、色氨酸合酶、α亚基(EC4.2.1.20)和色氨酸合酶、β亚基(EC4.2.1.20)的色氨酸生物合成基因，它们都参与从分支酸产生色氨酸。
[0143]美国专利号4，371，614所述色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，W08701130描述遗传改造大肠杆菌菌株以生成色氨酸并讨论增加发酵生产的L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
[0144]提高色氨酸产量
[0145]在大多数生物体中色氨酸产量受到调节。一个机制是通过途径中某些酶的反馈抑制。例如，提高色氨酸的水平可导致色氨酸产率降低。因此，当采用工程改造的宿主细胞通过色氨酸中间体生产莫纳甜时，可用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，可通过重复接触高浓度的5-甲基色氨酸来选择耐各种色氨酸类似物的生长抑制的长春花(Catharanthusroseus)植株，如下列文献所述(Schallenberg 和 Berlin, Z.Naturforsch, 34:541-5，1979)。所得植株的色氨酸合酶活性受由于基因突变产生的产物抑制的影响小。
[0146]可用类似方法选择抗反馈的株。例如，可以通过在苯丙氨酸类似物、β -2-噻吩基丙氨酸、间_氟_D, L-苯丙氨酸和对-氟-D, L-苯丙氨酸上培养大肠杆菌菌株#7692 (来自E.Coli Genetic Stock Center,W3110tnaA2trpEfbrl9(Yanofsky 等，J.Bacteriol.,158:1018-1024，1984;和Doolittle和 Yanofsky，J.Bacteriol.，95:1253，1968))来选择抗反馈的aroG DAHP (3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸)合酶的突变体。此大肠杆菌菌株#7692可产生可测量量的色氨酸，可用作引入外源性核酸如编码醛缩酶和转氨酶的核酸的起始宿主。另一大肠杆菌菌株E971(ATCC15491)是显示DAHP合酶水平升高以及吲哚和色氨酸水平比亲本菌株高的原养型菌株(Lim和Mateles, 1964J.Bacteriol., 87: 1051-1055) ?该菌株可用于获得用生长培养基中的5-甲基色氨酸类似物降低了抗反馈的邻氨基苯甲酸合酶(EC5.3.1.24)突变体。此菌株也可用作引入编码醛缩酶和转氨酶的外源性核酸的宿主。
[0147]可通过定向进化产生对产物抑制较不敏感的多肽来优化色氨酸产量。例如，可在培养基中不含色氨酸，但含有高浓度的不可代谢的色氨酸类似物的平板上进行筛选。美国专利号5，756，345,4, 742，007和4，371，614描述了在发酵生物中提高色氨酸产量的方法。色氨酸生物合成的最后一步是将丝氨酸加在吲哚上。因此，提高丝氨酸的有效性来增加色氨酸产量。[0148]色氨酸生物合成的控制点是DAHP合酶。此多肽的三种同工酶由以下基因编码:ar0F、ar0G和aroH，它们分别可被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸反馈抑制。L-酪氨酸反馈抑制的DAHP合酶约占总酶活性的20%，L-苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合酶约占总酶活性的80%，L-色氨酸抑制的DAHP合酶对总酶活性的贡献很小。得到的酶抗反馈的突变体可提供该控制点失调的株。通常，主要的抗反馈靶是aroG和aroF。
[0149]一种分离抗反馈突变体的方法是用化学诱变或紫外线诱变并选择在氨基酸类似物上可生长的生物体。可用类似物β-2-噻吩基丙氨酸获得对反馈不敏感的aroG (Duda和Sasvar1-Szekely, (1973) Acta.Biochim.Biophys.Acad.Sc1.Hung.8 (2): 81-90)。也可用类似物间-氟-D，L-苯丙氨酸(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem.，54 (3): 707-713)以及对氟苯丙氨酸(Hagino 和 Nakayama, (1974) Agr.Biol.Chem., 38 (I): 157-161)产生对反馈不敏感的aroG。
[0150]一种获得抗反馈的DAHP合酶的方法是用氨基酸类似物并产生天然基因已突变的株。另一方法是克隆编码抗反馈的酶的基因，它能提供更大弹性，并且用不同启动子可降低转录调节的可能性(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem., 54 (3): 707-713)。
[0151]色氨酸生物合成中另一调节点是分支点酶邻氨基苯甲酸合酶，在大肠杆菌中它是trpE和trpD编码的双组分蛋白。可用氨基酸类似物5-氟色氨酸和5-甲基色氨酸获得不受色氨酸反馈抑制的突变体(Shiio 等，(1975)Agr.Biol.Chem., 39 (3):627-635)。
[0152]此外,在乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中可能出现色氨酸反馈抑制邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶和色氨酸合酶。然而，可使这些酶对抑制不敏感(Matsui等，(1987) J.Bacteriol.，169:5330-5332)。这种突变体可显示色氨酸水平升高，因此，预计它能提高莫纳甜水平。
[0153]细胞所用控制其合成色氨酸水平的其它方法包括在转录水平上调节。在谷氨酸棒杆菌中，酪氨酸在转录水平上调节DAHP合酶，通过操纵5，调节区来减轻此种调节可提高色氨酸生物合成(Shiio, 1986,《氨基酸生产的生物技术》(Biotechnology of AminoAcids Production), Aida, K.、Chibita, L.、Nakayama, K.、Takinami, K.和 Yamada, H.编.Elsevier).在大肠杆菌中，通过阻抑和弱化在转录水平上调节色氨酸(trp)操纵子，阻抑产生80倍变异和弱化产生6-8倍变异。阻抑蛋白的TrpR多肽的失活可提高trp操纵子mRNA的水平。前导肽形成mRNA二级结构，它响应于带电荷tRNAtap水平。5'-调节弱化区的缺失可帮助克服此额外水平的调节(Yanofsky等，J.Bacteriol.，158:1018-1024，1984)。在枯草芽孢杆菌中也观察到色氨酸-RNA-结合弱化蛋白(TRAP)的弱化机制，通过下调或缺失编码它的基因减轻弱化可提高此宿主生物体中的色氨酸合成(Babitzke和Gollnick，2001，J.Bacteriol.，183:5795-5802)。或者，可上调抗-TRAP 多肽的表达。
[0154]可通过在色氨酸途径中过度表达多肽来提高色氨酸产量，这可提高莫纳甜水平。例如，过度表达编码转酮酶的核酸、aroFfbr和aroL(编码莽草酸激酶)可提高色氨酸产量。然而，过度表达这些序列可引起对细胞的代谢负担，在极限培养基中，细胞可分泌出各种中间体。可用更富有营养的培养基来提高色氨酸水平(Kim等，2000，J.Microbiol.Biotechnol.，10 (6):789-796)。此外，含有失调的DAHP合酶表达、失调的邻氨基苯甲酸合酶表达和编码磷酸核糖基转移酶的多拷贝质粒的谷氨酸棒杆菌细胞的色氨酸产量可增加到 43g/L(Katsumata 和 Ikeda, (1993)Bio/Technology,11:921-9250)。[0155]芳族氨基酸途径中受反馈和/或转录控制的其它酶包括莽草酸脱氢酶(由aroE编码)和莽草酸激酶I/II (由aroK、aroL编码)。诱变aroE基因可提供抗反馈的酶。AroK和aroL受酪氨酸的负转录控制。遗传操纵启动子区或缺失调苄基因(trpR和tyrR)可减轻酪氨酸的控制。
[0156]苯丙氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸，它们的生物合成可从色氨酸上转移碳，因为分支酸是所有三种芳族氨基酸的共同前体，并且是色氨酸代谢和苯丙氨酸/酪氨酸代谢之间的分支点。可去除或中断苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成途径，以降低分支酸消耗，这可通过遗传敲除编码分支酸变位酶/预苯酸(prephanate)脱氢酶的pheA或tyrA基因来完成。分支酸变位酶与邻氨基苯甲酸合酶(trpD和trpE基因产物)竞争可用的分支酸。中断或去除竞争性芳族氨基酸途径的示范性菌株包括大肠杆菌NRRL B12262(参见实施例15)、大肠杆菌 NRRL B12258、大肠杆菌 SR250(Rothman 和 Kirsch，J Mol Biol.(2003)327，593-603)、谷氨酸棒杆菌ATCC21847 (参见实施例17)、谷氨酸棒杆菌ATCC21850、谷氨酸棒杆菌ATCC21851。或者，除去除苯丙氨酸和酪氨酸途径和需要将氨基酸加入培养基外，可克隆trpE基因(或整个色氨酸操纵子)并用异源启动子过度表达trpE基因，因为邻氨基苯甲酸合酶与分支酸的亲和力高于pheA或tyrA(Dopheide等，(1972) J.Biol.Chem., 247:4447-4452)。降低碳流到苯丙氨酸和酪氨酸的另一方法是修饰它们的转录控制。还有，催化色氨酸转化为吲哚和丙酮酸的色氨酸酶多肽的表达降低可帮助防止色氨酸丧失(Aiba等，Appl.Environ.Microbiol.,1982,43:289-297)。
[0157]在一个实施方式中，可以改造中心机制，以提高莫纳甜产量。如本文所述，为获得足够的莫纳甜产量，选择或得到的生物体应具有高于野生型生物体的速率生产色氨酸的能力。因为色氨酸不是最终产物，而是到莫纳甜途径中的中间体，所以开发不仅具有累积更高浓度的色氨酸能力，而且具有流量提高的菌株是至关重要的。可用多种方法来改造中心碳机制，以将碳转移到莽草酸和分支酸途径中，使得可以产生高水平的莫纳甜。
[0158]芳族化合物如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中第一步是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)缩合`形成DAHP。可用各种方法提高各前体的有效性，并提高此第一反应的性能。以下五种方法是用于提高PEP有效性的可能的例子。
[0159]第一，可消除通过磷酸转移酶系统(PTS)摄取葡萄糖对PEP的消耗。葡萄糖转运系统的失活可产生葡萄糖负突变体。已分离PTS_葡萄糖+突变体。它们中一些通过半乳糖透性酶、葡糖激酶和ATP转运和磷酸化葡萄糖,不消耗PEP (Flores等，(1996) Nat.Biotechnol.,14:620-623;和 Chen 等，(1997)Biotechnol.Prog.，13:768-775)。葡萄糖透性酶系统需要较大量的ATP来磷酸化葡萄糖。可通过加入编码葡萄糖易化子(facilitator)(由glf编码)、葡萄糖脱氢酶(由gdhIV编码)和葡糖酸激酶(由glk编码)的基因引入不同的葡萄糖转运和磷酸化系统，它们也可导致PEP水平升高(W099/55877)。此机制可产生葡糖酸6-磷酸，它是戊糖磷酸途径中的中间体，因此可提高此途径中的碳流并导致E4P水平升高。
[0160]第二，PEP消耗酶、PEP羧化酶(Ppc)和丙酮酸激酶(如PykA和PykB)的失活可增加可用的 PEP 库(Bongaerts 等，(2001)Met.Eng., 3, 289-300)。
[0161]第三，可通过提高PEP合酶(Pps)的表达将通过PTS或丙酮酸激酶形成的丙酮酸再循环回 PEP 中(Patnaik 等，(1995)Biotechnol.Bioeng.,46:361-370;和 Yi 等，(2002)Biotechnol.Prog.，18:1141-1148)。[0162]第四，可通过破坏csrA基因改变糖异生调节(碳贮存调节器)，这可增加糖异生，影响参与PEP代谢、降低糖酵解和提高PEP水平的几种酶的调节(Tatarko等，(2001)Current Microbiol.,43(I):26-32)。
[0163]第五，可通过供给糖如不像葡萄糖，绕过PTS系统转运入细胞的木糖来减少PEP消耗。
[0164]为了提高E4P的有效性，可过度表达编码转酮酶的tktA基因和/或编码转醛酶的talB基因。在将碳流导入芳族途径中表达转酮酶更有效(Liao等，(1996)Biotechnol.Bioeng.,52:129-140)。例如，具有修饰的戊糖磷酸途径的谷氨酸棒杆菌菌株可用来产生色氨酸(携带 pKW9901 的 KY9218 ；Ikeda 和 Katsumata, Appl.Environ.Microbiol.，1999，65(6):2497-502)。
[0165]可采用这些方法的任何组合。例如，可将这些修饰中的几种组合起来应用于大肠杆菌菌株。在过度表达tktA的PTS_葡萄糖+、pykA、pykB菌株中，到芳族途径的碳流几乎提高了 20 倍(Gosset 等，(1996) J.1nd.Microbiol.，17:47-52)。此外，可将这些方法可与其它修饰联用，以降低色氨酸生物合成途径中后来发生的瓶颈(如芳族途径的色氨酸分支中过度表达基因，缺失PheA和tyrA基因以避免分支酸消耗，过表达trpE和trpD以提高邻氨基苯甲酸的合成)，从而增加色氨酸产量。所产生的色氨酸不需要在细胞中累积，因为它可进一步转化为产物如莫纳甜。
[0166]产生色氨酸，以及后来产生莫纳甜，可得益于引起丝氨酸生产途径中的改变。在生产色氨酸的最后一步中需要丝氨酸，最后一步包括丝氨酸与吲哚-3-甘油磷酸酯的反应。此反应由色氨酸合酶多肽催化。通过色氨酸途径的碳流增加可导致一些反应不平衡，出现新瓶颈。由于通过另一途径产生丝氨酸，所以其产率可成为色氨酸生产中的限制因素。可通过过度表达途径中的第一个 基因来增加通过丝氨酸途径的碳流，该基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PDG;Ikeda 等，(1994) Biosc1.Biotech.Biochem.，58 (4): 674-678)。
[0167]提高丙酮酸产量
[0168]可通过增加宿主生物产生的丙酮酸量来提高由生物体产生的莫纳甜量。一种产生莫纳甜的途径基于吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸反应形成莫纳甜的4-酮酸衍生物。为了将此反应向前推进，能够将大量碳转移到丙酮酸的生物体用作生产莫纳甜的宿主。选择丙酮酸超产菌，它们不需要耐受高浓度的酸，但它们的代谢途径应失调，以使更多的碳转移到丙酮酸。某些酵母，如皮状丝孢酵母(Wang 等，Lett.Appl.Microbiol.，35:338-42，2002)、脂解假丝酵母、酿酒酵母和光滑假丝酵母(以前称为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)(Li 等，Appl.Microbiol.Biotechnol., 57:451-9, 2001)从葡萄糖过量产生丙酮酸(高达50g/L)，可用于产生本文所述产物。
[0169]这些不同菌株的硫胺营养缺陷型在硫胺有限的条件下累积丙酮酸，因为硫胺依赖性丙酮酸脱氢酶(TOH)的活性降低损害了丙酮酸的氧化脱羧。硫辛酸是PDH的辅因子。同样，硫辛酸营养缺陷型，如大肠杆菌菌株W14851ip2(ATCC25645 ；Kawasaki等，J.Ferment.Bioeng.,82:604-6,1996)可将丙酮酸累积到显著的程度(>25g/L) (Yokota 等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，41:638-643，1994)。将 Fl-ATP 酶缺陷基因引入 W14851ip2 菌株可进一步提高丙酮酸生产的速率和量。此突变导致细胞的能量产生有缺陷，此缺陷趋向于由提高通过糖酵解的碳流来补偿，因此产生更大量的丙酮酸(Yokota等，J.Ferment.Bioeng.,83:132-138,1997) 0双突变菌株可用于产生过量产生几种氨基酸包括色氨酸(Kawasaki等，1996上述)、亮氨酸和缬氨酸(美国专利号5，888，783和6，214，591)的宿主菌株。
[0170]除了丙酮酸脱氢酶复合物中的突变以外，可通过去除或降低丙酮酸脱羧酶、丙酮酸铁氧还蛋白-氧化还原酶、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶和/或丙酮酸氧化酶的表达获得丙酮酸产量的进一步提高。参见例如，W003/000913。
[0171]过量产生丙酮酸的菌株中过度表达色氨酸酶基因可用于从吲哚产生色氨酸(Kawasaki等，1996，上述)。过量产生丙酮酸可提高色氨酸产量，也使形成莫纳甜前体的底物(丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸)水平提高。或者，当采用色氨酸酶基因时，在存在过量铵的情况下可同时供给丙酮酸和吲哚。可用去污剂提高吲哚的溶解性，或者可连续供给吲哚以使毒性和沉淀减至最低程度。
[0172]色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
[0173]可用一些多肽将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶种类(EC) 2.6.1.27,1.4.1.19,1.4.99.1,2.6.1.28,1.4.3.2,1.4.3.3,2.6.1.5,2.6.1.-、
2.6.1.1和2.6.1.21。这些种类包括但不限于称为色氨酸转氨酶的多肽(也称为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、和L-色氨酸:2-氧戊二酸转氨酶),它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺；D-色氨酸转氨酶，它将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也称为NAD (P) -L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸:NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD (P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD (P) H ；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2 ;色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也称为L-色氨酸-α-酮异已酸转氨酶和L-色氨酸:苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮`酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸:氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ；D-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸:氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ;色氨酸氧化酶,它使L-色氨酸和H2O和O2转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H202。这些种类也含有酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
[0174]转氨酶种类中有这种活性的11个成员描述于下面的实施例1，包括SEQ ID N0:11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和氨基酸序列，与分别在SEQ ID NO: 11和12中所示序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少99%的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NO: 11和12中所示片段和融合体，它们保持转氨酶活性或编码具有转氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500 或 1000 个 SEQ ID NO: 11 的毗连核苷酸或至少 6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO: 12的毗连氨基酸。所示序列(和其变体、片段和融合体)可以是载体的一部分。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步产生MP和/或莫纳甜。
[0175]L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)已知，序列可分离自一些不同来源，如地中海蝰(Vipera lebetine) (sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah) (sp P81383)、红口峻(Agkistrodon rhodostonma) (sp P81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox) (spP56742)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobacter cresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)和红球菌属(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且可分离自例如鬼伞属(Coprinus) SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。
[0176]色氨酸脱氢酶已知，并可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番爺、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。许多D-氛基酸脱氧酶基因序列已知。
[0177]如图11-13所示，如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
[0178]吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
[0179]将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过各种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或 1.1.1.111 多肽类的成员。1.1.1.11 0多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也称为吲哚乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27,1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也称为乳酸脱氢酶、乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R) -4-羟苯基乳酸脱氢酶(也称为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸:NAD (P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也称为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶，1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也称为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸:NAD(P) +氧化还原酶)。可能这些种类中的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。
[0180]化学反应也可用于将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如:使用B2催化剂的空气氧化(China ChemicalReporter, 13卷，28期，18页(I)，2002)，金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过
氧化氢。
[0181]吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸(MP)
[0182]一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸加一种三碳源(如丙酮酸)转化成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16,4.1.3.17和4.1.2._。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
[0183]例如，EP1045-029中所述多肽(EC4.1.3.16,4-羟基_2_氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也称为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17，也称为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
[0184]图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3_碳(C3)分子结合吲哚_3_丙酮酸。EC4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员，特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转化成丙酮酸。可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β -裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也称为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点诱变可增加β-裂合酶反应速率，如Mouratou等(J.Biol.Chem274:1320-5,1999)和实施例5所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子在下文描述。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚_3_丙酮酸。
[0185]MP到莫纳甜
[0186]MP到莫纳甜的转化可由下列I个或多个催化:色氨酸转氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员在下文描述(实施例1)，包括SEQ ID NO: 11和12所示新的种类成员，实施例4提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
[0187]此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰基硼氢化钠进行。
[0188]图11-13显示另外的多肽，它们能用于使MP转化成莫纳甜，以及提供增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫纳甜产量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转化成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶(如草酰乙酸脱羧酶)转化成丙酮酸和二氧化碳(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转化成ε -醛基赖氨酸(图12)。ε -醛基赖氨酸自发转化成1-哌啶
6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转化成莫纳甜，可使用能再循环NAD⑵H和/或产生挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。
[0189]提高莫纳甜产量的其它方法
[0190]可用于提高莫纳甜产量的具有遗传修饰的菌株的其它例子包括:
[0191]I)大肠杆菌 AGX1757，可分离自 W3110 (具有质粒 pSC101+trpI 的 trpAEl、trpR、tnaA)。可进行NTG诱变，选择6-氟色氨酸或5-甲基色氨酸抗性。可通过加入普朗尼克(Pluronic) L-61使色氨酸或莫纳甜在培养基中结晶以提高产率。
[0192]2)谷氨酸棒杆菌KY9225衍生自Ρχ_115_97，显示苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型，并含有耐色氨酸抑制的邻氨基苯甲酸合酶。
[0193]3)诱变乳发酵短杆菌1041trpE，使其对色氨酸反馈抑制脱敏感。发现该基因具有被精氨酸所取代的丝氨酸残基。发现推定弱化子内终止子结构中鸟嘌呤突变成腺嘌啉也减轻转录调节(Matsui 等,(1987) J.Bacteriology, 16:5330-5332)。
[0194]可用于使前体的有效性最优化和使莫纳甜产量最大化的其它修饰包括但不限于:(I)缺失编码有助于莫纳甜摄取的多肽的基因，(2)缺失或下调编码参与竞争途径的多肽的基因，(3)上调醛缩酶和转氨酶多肽表达，(4)缺失编码产生莫纳甜的不正确形式的转氨酶多肽的基因，和(5)提高PLP有效性。编码有助于莫纳甜摄取的多肽的基因可包括枯草芽孢杆菌天冬氨酸摄取转运蛋白(YveA ;Lorca 等，2003, J.Bacteriol., 185 (10): 3218-22),Glt-1L-谷氨酸/L-天冬氨酸/D-天冬氨酸摄取多肽(协同转运子)和谷氨酸棒杆菌gluA、B、C、D谷氨酸摄取基因。编码参与竞争途径的多肽的基因可以是tnaA基因(编码色氨酸酶多肽)，除非吲哚用作产生色氨酸的底物。[0195]设计生物合成途径中的另外考虑
[0196]取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜，能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以增强产物形成。此外，可设计遗传修饰来提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜等产物的产量。类似地，使用宿主细胞可使莫纳甜生产最优化。
[0197]如本文所述，任何生物如大肠杆菌和其它肠杆菌科(如克氏杆菌属、泛菌属和欧文氏菌属菌株)、谷氨酸棒杆菌、短杆菌菌株、杆菌菌株和酵母菌株可用于产生产物如吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜。例如，可对经改造从邻氨基苯甲酸过量产生色氨酸(导致许多有疑问的副产物)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌进行修饰，以有效生成产物。此外，产生谷氨酸的野生型黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)和谷氨酸棒杆菌菌株经修饰能有效产生其它氨基酸如赖氨酸。T.0ka，“氨基酸，生产工艺”(Amino Acids, Production Processes),刊于《生物工艺技术百科全书:发酵、生物催化和生物分离》(Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis, and Bioseparation), M.C.Flickinger 和 S.W.Drew 编，John Wiley 和Sons, Inc.New York,第89-100页。此外,可选择或设计本文所述生物体,使其(I)具有有利的生长动力学，使它们可以在低成本基质上生长，(2)分泌产物如莫纳甜，和/或(3)使莫纳甜的前体如色氨酸和丙酮酸的水平提高。可用易获得的遗传学工具从良好表征的物种产生这种生物体，和/或这种生物体具有安全地用于产生食品成分的历史。
[0198]1.去除过氧化氢
[0199]过氧化氢(H2O2)是一种产物，如果产生，可对生产细胞有毒、并可损害多肽或产生的产物(如中间体)。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
[0200]过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢分解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于:tr I Q9EV50 (木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr | Q9KBE8 (耐盐杆菌)、tr I Q9URJ7 (白色念珠菌)、tr | P77948 (天兰色链霉菌)、tr | Q9RBJ5 (野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应器也能包含过氧化氢酶多肽。
[0201]2.吡哆醛Y -磷酸(PLP)有效性的调节
[0202]如图1所示，PLP可用于本文所述I个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。
[0203]已充分研究大肠杆菌中维生素B6 (PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，449:45-8，1999)。其它代谢途径中需要2个基因(印d或gapB和serC),而3个基因(pdxA、pdxB和pdxj)是吡B多醒磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前体是从4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸形成的苏氨酸衍生物。转化到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是^cUpdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxj的基因产物催化。
[0204]如果PLP成为发酵生产莫纳甜期间的限制营养物，可增加I个或多个途径中的基因在生产宿主细胞中的表达来提高莫纳甜产量。宿主生物体可包含多拷贝的天然途径基因，或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体的基因组中。另外，可在宿主生物体内克隆入多拷贝的拯救途径基因中。
[0205]在所有生物体中保守的I个拯救途径使各种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是PdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达I个或多个这些基因可增加PLP有效性。
[0206]可通过去除或阻抑宿`主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节提高维生素B6水平。PLP阻抑参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成的多肽。此细菌菌株无代谢控制，过量产生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以类似方式遗传操作产生莫纳甜的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
[0207]3.铵利用
[0208]通过制备更能利用的氨或去除水能驱动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来驱动。
[0209]氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐而得到。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶，可提供氨。加入EC4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
[0210]4.除去产物和副产物
[0211 ] 色氨酸经色氨酸转氨酶转化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酰胺并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
[0212]多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化成2_氧戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原性等效物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
[0213]在色氨酸到莫纳甜的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转化成步骤I所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2种独立的转氨酶能提高此途径的效率，其中I种转氨酶的底物非竞争性抑制其它转氨酶的活性。
[0214]所述途径中的许多反应是可逆的，因此可达到底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加途径的产量。例如，用通透酶或其它转运蛋白使莫纳甜分泌入发酵液，或者从生物催化反应器流中选择性结晶莫纳甜并伴随底物再循环会提高反应产量。
[0215]另一种增加反应产量的方法是通过另外的酶反应或通过氨基供体基团的取代来去除副产物。例如，可产生不能在反方向中反应的副产品，或通过相变(例如终产物的沉淀)或通过自发转化成挥发性终产物如二氧化碳实现。
[0216]5.底物库的调节
[0217]可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径调节吲哚库。例如，可通过宿主细胞中编码EC4.1.1.74的基因功能性缺失来减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC4.1.99.1的基因减少或去除从色氨酸生成吲哚。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.,82:604-6，1996)。
[0218]此外，可进行遗传修饰以增加中间体，如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸的水平。
[0219]6.控制手性
[0220]通过控制立体化学(手性)能改变莫纳甜的品尝描绘。例如，不同食物系统的浓度不同的混合物中需要不同的莫纳甜异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
【权利要求】
1.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括: (a)在培养基中培养微生物，其中所述微生物包含至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸；和 (b)从所述培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶，EC4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自苜蓿中华根瘤菌、睾丸酮丛毛单胞菌、稻草假单胞菌、谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自棒杆菌属和短杆菌属。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基包含非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非离子去污剂选自吐温、TritonX-1OO和十二烷基乙酸铵。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基所含生物素的浓度小于5μ g/L。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述青霉素衍生物是氨苄青霉素。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，培养微生物前所述培养基的pH 约为 pH7 — pH8。`
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基包含糖蜜、玉米浆或其组合。
12.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌，其中所述培养基包含Trp-1+葡萄糖培养基。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物的生长需要苯丙氨酸和酪氨酸，其中所述培养基包含苯丙氨酸和酪氨酸。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物含有aspC和proA基因。
15.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌是产生和分泌谷氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述培养基包含非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，由所述谷氨酸棒杆菌分泌莫纳甜或其盐。
18.—种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括: (a)在培养基中培养谷氨酸棒杆菌(ATCC13058);和 (b)从所述培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述培养基包含吐温、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含色氨酸、丙酮酸、非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述非离子去污剂是吐温。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含丙酮酸、吐温和青霉素衍生物。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物分泌莫纳甜或其盐。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵罐中培养所述微生物。
26.一种包含至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合，其中所述微生物产生莫纳甜或其盐。
27.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶，EC4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
28.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
29.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物过量产生丙酮酸。
30.如权利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物是硫胺营养缺陷型。
31.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物是苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型。
32.如权利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自光滑假丝酵母、皮状丝孢酵母、脂解假丝酵母和酿酒酵母。
33.如权利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物是硫辛酸营养缺陷型。
34.如权利要求33所述的微生物,其特征在于,所述微生物包含aspC和proA基因。
35.如权利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含aspC和proA基因和至少一个色氨酸操纵子基因。
36.如权利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
37.如权利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含缺陷的Fl— ATP酶基因。
38.如权利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物的内源性IipA基因中有破坏。
39.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物过量产生色氨酸。
40.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含一种或多种色氨酸生物合成基因的两个或多个拷贝。
41.如权利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含被破坏的pheA基因。
42.如权利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物包含被破坏的内源性色氨酸酶(tna)基因。
43.如权利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物过度表达ppsA基因。
44.如权利要求39所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
45.如权利要求44所述的微生物，其特征在于，相对于对应的对照微生物，所述微生物提高了 3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DAHP)合酶活性量。
46.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物还包含编码具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，其中所述核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合。
47.如权利要求46所述的微生物，其特征在于，所述微生物还包含tkt基因。
48.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物还包含编码具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。
49.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物分泌莫纳甜或其盐。
50.如权利要求49所述的微生物，其特征在于，所述微生物是脂肪酸营养缺陷型。
51.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物是含有表达醛缩酶的核酸的细菌菌株，其中由所述核酸表达的醛缩酶能够产生富含立体异构体的莫纳甜混合物。
52.如权利要求51所述的微生物，其特征在于，所述富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是S，S莫纳甜或其盐。
53.如权利要求51所述的微生物，其特征在于，所述富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是R，R莫纳甜或其盐。
54.如权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述微生物过度表达编码色氨酸摄取多肽的至少一种核酸。
55.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括: (a)在生产莫纳甜或其盐的条件下在培养基中培养产生莫纳甜或其盐的微生物，和 (b)从所述培养基或培养的微生物中获得莫纳甜或其盐。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述微生物分泌莫纳甜或其盐。
57.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述微生物是脂肪酸营养缺陷型。
58.一种鉴定能够合成莫纳甜或其盐的细胞的方法，所述方法包括: (a)在选自以下的碳源/能源存在下培养细胞:莫纳甜或其盐、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐、莫纳甜或其盐的类似物、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐的类似物及其组合；和 (b)测试细胞生长，其中细胞生长说明该细胞将所述碳源/能源转化为丙酮酸，从而说明该细胞能够合成莫纳甜或其盐。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述细胞是丙酮酸营养缺陷型，在所述细胞中通过代谢碳源/能源产生丙酮酸。
60.如权利要求59所述的方法,其特征在于,所述细胞包含被破坏的pykA和pykF基因。
61.一种鉴定能够从色氨酸合成莫纳甜或其盐或者2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戍二酸或其盐或者其组合的细胞的方法,所述方法包括: (a)在不存在色氨酸和存在莫纳甜或其盐、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合的条件下培养色氨酸营养缺陷型细胞；和 (b)测试色氨酸营养缺陷型细胞的生长，其中细胞生长说明该细胞从莫纳甜或其盐、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合合成色氨酸，从而说明该细胞能够从色氨酸合成莫纳甜或其盐或2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合。
62.一种生产莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括: (a)在培养基中培养微生物，所述微生物选自苜蓿中华根瘤菌、睾丸酮丛毛单胞菌、稻草假单胞菌和谷氨酸棒杆菌；和 (b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。
63.如权利要求62所述的方法,其特征在于,所述微生物未经遗传修饰。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述培养基包含PHB培养基。
65.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含色氨酸、丙酮酸、非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
66.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述微生物是苜蓿中华根瘤菌或睾丸酮丛毛单胞菌。
67.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述微生物是睾丸酮丛毛单胞菌，所述培养基还包含色氨酸和丙酮酸。
68.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述培养基包含TY培养基。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含色氨酸、丙酮酸或其组合。
【文档编号】C12N9/10GK103555782SQ201310188490
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2004年10月21日 优先权日:2003年10月21日
【发明者】S·C·麦克法兰, P·M·西克斯, M·J·齐德韦克, F·A·桑切斯－里埃, D·C·卡梅隆, M·L·德苏扎, J·罗萨扎, S·J·格特, T·W·阿布拉罕 申请人:嘉吉有限公司