专利名称：一种猪视网膜细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种猪视网膜传代细胞及其应用。
背景技术：
猪圆环病毒病(Porcine Circovirus Disease，PCVD)是由PCV2病毒感染而引起的一种临床症状为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎，主要侵害5 12周龄断奶仔猪，与近年来发生的PMWS、猪皮炎与肾炎综合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, FONS)、猪呼吸道综合征(PorcineRespiratory Disease Complex, PRDC)、A2 型先天性振颤(Congenital Tremor, CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and Necrotizing Pneumonia, PNP)、繁殖障碍等疾病都有密切相关。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，并经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它病原体，使病情加重，并造成更大危害。本病呈世界性流行，自2000年证实我国存在此病以来，现已在我国猪群中普遍存在，给我国养猪业造成相当大的经济损失。研究发现，猪圆环病毒2型(以下简称PCV2)能在单核细胞、肝细胞、心肌细胞以及肾上皮细胞等原代细胞中繁殖，也能在Vero等传代上皮细胞中繁殖，但观察不到细胞病变，只有在猪视网膜上皮细胞内繁殖能使细胞产生明显的病变。而原代猪视网膜上皮细胞有分裂次数限制，体外培养20几代以后细胞就会自然衰老死亡。因此需要构建一株能连续传代的猪视网膜上皮细胞，以供PCV2的分离、培养、鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪视网膜上皮细胞，以供PCV2病毒的分离和鉴定，从而弥补现有技术的不足。本发明将含有LTAg基因的质粒转入到原代猪视网膜上皮细胞中建立了传代猪视网膜细胞MPR，该细胞可以连续传代培养，培养至80代时细胞形态和性状均未发生改变。PCV2病毒可以在该细胞内大量增殖，并引起明显的细胞病变。本发明的一个方面涉及一个转基因传代猪视网膜上皮细胞MPR，其保藏编号为:CCTCC NO: C2012193，保藏单位:中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址:湖北省武汉市武汉大学，保藏日期:2012年12月13日。本发明的细胞的构建，是将表达SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性(neomycin resistance)基因的质粒转入猪视网膜上皮细胞中构建的。所述的质粒为质粒pcDNA3.l_LTAg，其启动子为CMV (人巨细胞病毒)。本发明猪视网膜上皮细胞MPR的应用，用于PCV2病毒的分离、培养以及鉴定。本发明的MPR细胞与原代猪视网膜上皮细胞形态无变化，能连续稳定传代至80代以上。经western blot和RT-PCR检测，MPR细胞能持续稳定表达LTAg，第80代细胞仍能检测出LATg的稳定表达。因此，本发明的MPR细胞在PCV2病毒的分离、培养以及鉴定中具有很好的应用前景。
具体实施例方式本发明将I个LTAg表达质粒稳定转染到猪视网膜上皮细胞中，经过长期的筛选获得了能够稳定遗传的传代细胞，并建立了 PCV2病毒的培养方法。转入猪视网膜上皮细胞中的pcDNA3.1-LTAg质粒是由pcDNA3.1 (+)质粒构建的，在质粒中插入LTAg基因，该基因的表达由CMV (人巨细胞病毒)启动子驱动。pcDNA3.1(+)质粒中还含有Neomycin (新霉素)抗性基因，因此可以用药物G418来筛选能稳定表达LTAg的细胞。经G418压力筛选得到能稳定表达LATg，并能连续传代、性状稳定的猪视网膜上皮细胞MPR。MPR细胞接PCV2病毒72小时能观察到明显的细胞病变，并且病毒滴度能达到
6.5o实施例1 LTAg表达质粒pcDNA3.1-LTAg的构建根据NCBI genebank 中 LTAg 基因的序列(Sequence ID: gi | 156599055)设计引物，引物信息分别为:F: ttatgtttcaggttcagg、R: atggataaagttttaaac。而 293T 细胞中整合了 LTAg基因，因此，以293T细胞基因组为模板，PCR扩增出LTAg基因，测序结果表明所获得片段就是所要的目的片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的氨基酸序列为SEQID N0:2。用EcoRV限制性内切酶将pcDNA3.1 ( + )质粒切开，连入扩增获得的LTAg基因片段，就得到了能表达LTAg蛋白的质粒pcDNA3.1-LTAgo实施例2传代猪视网膜上皮细胞MPR的获得和筛选(I)取香猪仔猪的眼球10只，75%乙醇浸泡5分钟，生理盐水浸泡5分钟，PBS溶液冲洗两次。无菌条件下剪开眼球，用镊子剥离视网膜，PBS冲洗，用含有0.25%胰蛋白酶和
0.02%EDTA的消化液消化，37摄氏度的二氧化碳培养箱中消化半小时。加入10%胎牛血清的DMEM终止消化，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，加入DMEM悬浮细胞，铺到六孔板中。(2)在六孔细胞培养板中，原代猪视网膜上皮细胞铺板率达到60%_80%时，以2 μ g/孔的比例，将pcDNA3.1-LTAg质粒转染到原代猪视网膜上皮细胞中，转染液为Lipofectamine LTX (Invitrogen 公司)。(3)48小时后，倒掉旧的培养基(生长培养基:DMEM培养基，添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100 μ g/ml硫酸链霉素)，换成选择性培养基(含终浓度为600 μ g/ml G418的生长培养基)，继续培养，定期换液，筛选2周后，得到稳定表达LTAg的传代猪视网膜上皮细胞，命名为MPR，并进行了保藏。其保藏编号为:CCTCC NO: C2012193，保藏单位:中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏日期:2012年12月13日。之后，将G418的终浓度降为300 μ g/ml维持培养(维持培养基:含终浓度为300 μ g/ml G418的生长培养基)或冻存。此种方法制作的传代猪视网膜上皮细胞，显微镜下观察发现，细胞能保持原来的形态结构；增值能力得 到增强，细胞比原代细胞长得更快；遗传稳定性高，连续传代80代后，细胞的形态结构、增值能力不变；因为传代细胞表达的LTAg蛋白能辅助病毒的包装出毒，所以传代细胞接毒后病变出现的更快，更明显，且病毒滴度有所提高。
实施例3用MPR细胞培养PCV2病毒PCV2病毒培养:六孔板中MPR细胞覆盖率达到80%时，接种200 μ L PCV2毒液，37°C吸附2小时。吸出原来培养液，PBS冲洗2次，加入新的培养液，37°C 5%C02培养48小时即可观察到明显细胞病变，72小时细胞完全病变。效价测定取PCV2毒种，做10倍比稀释，分别取10_4、10_5、10' 10_7接种长势良好的视网膜上皮细胞(96孔细胞培养板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1mL,同时设细胞阴性对照孔。接种后，置37°C、5%C02培养6 7日，观察细胞病变，出现CPE者判为感染，计算TCID50 0经计算病毒滴度可达到6.5。上述的培养结果表明，本发明的MPR细胞可以有效的用来培养PCV 2病毒。
权利要求
1.一种转基因猪视网膜上皮细胞，其保藏编号为:CCTCC N0:C2012193o
2.权利要求1所述的细胞的构建方法，是将表达SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性基因的质粒转入猪视网膜上皮细胞中构建的。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的质粒为pcDNA3.l_LTAg，其启动子为 CMV。
4.权利要求1所述的细 胞在PCV2病毒的分离、培养以及鉴定中的应用。
全文摘要
本发明的涉及一个转基因传代猪视网膜上皮细胞MPR，其保藏编号为CCTCC NO: C2012193。本发明的MPR细胞与原代猪视网膜上皮细胞形态无变化，能连续稳定传代至80代以上。经western blot和RT-PCR检测，MPR细胞能持续稳定表达LTAg，第80代细胞仍能检测出LATg的稳定表达。因此，本发明的MPR细胞在PCV2病毒的分离、培养以及鉴定中具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/93GK103224911SQ201310189019
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月21日 优先权日2013年5月21日
发明者韩乃军, 邹敏 申请人:青岛易邦生物工程有限公司