生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有如下的一或多种修饰：a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因的活性增强，b)sthA基因的活性增强,和c)突变的lpdA基因。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，以及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。
【专利说明】生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用发明领域
[0001]本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。
发明背景
[0002]丁二酸又称作琥珀酸，是一种优秀的平台化合物，在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途，被美国能源部列为未来12种最有价值的平台化合物之一(McKinlay etal.2007, Appl Microb1l B1technol76:727-740)。丁二酸目前主要应用于酯化溶剂、除冰装置、发动机冷却剂、食品香精、水处理化学品等。丁二酸还可以用于生产很多下游产品，如1，4-丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。另外，丁二酸和1，4-丁二醇聚合能得到PBS (聚丁二酸丁二醇酯)塑料，其是一种性能优良的生物全降解塑料。据估计丁二酸未来的市场潜力每年将超过270万吨。大约有250种可以用苯为原料生产的化工产品都可以通过丁二酸为原料生产(McKinlay et al.2007, Appl Microb1lB1technoI76:727-740)。
[0003]目前丁二酸的生产主要是基于顺酐为原料的石油化工路线。石油价格近年来波动很大，这严重制约了丁二酸生产的可持续性和价格稳定。另一方面，化学合成法工艺复杂且常需高温高压，这大大增加了生产所需的能耗物耗；同时化学合成还会造成严重的环境污染。开发丁二酸的高效生物制造技术能从根本上解决石油化工路线的弊端:保证丁二酸价格稳定不受制于石油价格波动，降低PBS塑料的制造成本，促进其进一步的推广应用；实现绿色可持续生产、简化生产工艺、节能减排、减少环境污染。另外，丁二酸的生物制造过程中还可以吸收二氧化碳，对实现低碳经济具有很好的促进作用。丁二酸生物制造技术的核心就是能够将生物质原料高效转化为丁二酸的微生物菌株。
[0004]目前丁二酸发酵菌种主要有两大类。第一类是天然产丁二酸菌，主要有产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens) (Guettler et al.1996, US PatentN0.5504004)> 产丁二酸厌氧螺菌(Anaerob1spirillum succiniciproducens)(Glassner and Dattal992, US Patent N0.5143834)、产丁二酸曼海姆菌(Mannheimiasucciniciproducens) (Lee et al.2002, Appl Microb1l B1technol58:663-668)和巴斯夫玻拍菌(Basfia succiniciproducens) (Scholten et al.2009, B1technolLett31:1947-1951)。另一类是通过代谢工程改造的工程菌，主要是大肠杆菌。
[0005]天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸，但其自有很多缺陷。发酵过程中，糖酸转化率低，有相当一部分碳源流入到其他有机酸的合成。另外，天然产丁二酸菌发酵过程中需要丰富培养基，提高了生产成本和下游分离纯化成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁二酸，但由于其生理遗传背景都很清晰，易于改造，因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌种，将其改造成高产丁二酸的工程菌。
[0006]磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是丁二酸合成途径的关键前体。将PEP羧化成草酰乙酸(OAA)是丁二酸合成途径的关键步骤。Millard等人通过过表达大肠杆菌的PEP羧化酶基因 ppc,将丁二酸的产量提高了 3.5 倍(Millard et al., 1996, Appl EnvironMicrob1l62:1808-1810)。Kim等人发现在野生型大肠杆菌中过表达PEP羧化激酶基因pck,对丁二酸生产没有影响，但在敲除了 ppc基因的大肠杆菌中过表达pck基因，能将丁二酸的产量提高 6.5 倍(Kim et al.，2004，Appl Environ Microb1l70:1238-1241)。韩国Kwon等人进一步发现当发酵液中含有高浓度碳酸氢根离子时，在野生型大肠杆菌中过表达pck基因，能将丁二酸的产量提高2.2倍(Kwon et al., 2006, J Microb1lB1technoll6:1448 - 1452)。
[0007]Chatterjee等人通过在大肠杆菌中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脱氢酶基因ldhA，构建了工程菌NZN111。该菌株不能以葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。在此基础上筛选出能够重新利用葡萄糖为碳源发酵生长的突变菌株AFPlll (Chatterjeeet al.，2001，Appl Environ Microb1167:148-154;Donnelly et al.，1998，ApplB1chem B1technol70_72:187-198)。Vemuri 等人通过在 AFPlll 中高表达埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶基因pyc,进一步提高了丁二酸的产量。在两步法培养(先好氧培养，然后厌氧发酵产酸)条件下，丁二酸的最终浓度可达到99.2g/L (841mM),糖酸转化率为 1.lg/g (1.68mol/mol) (Vemuri et al., 2002, J Ind Microb1lB1technol28:325-332)。
[0008]Sanchez等人通过敲除醇脱氢酶基因adhE、IdhA、乙酸激酶基因ackA、磷酸乙酰转移酶基因pta、异柠檬酸裂解酶调控蛋白基因iclR，构建出工程菌SBS550MG。在两步法培养(先好氧培养，然后厌氧发酵产酸)条件下，可以生产40g/L(339mM)的丁二酸，糖酸转化率达到 1.06g/g (1.61mol/mol) (Sanchez et al., 2005, Metab Eng7:229-239)。
[0009] Vemuri等人和Sanchez等人构建出的重组大肠杆菌虽然能生产高浓度的丁二酸，但仍有一些缺陷。发酵过程采用的是两步发酵，即先采用好氧过程将细胞培养生产起来，再转变为厌氧过程进行发酵。这种工艺操作复杂，而且好氧工艺会大大提高设备的构建和运行成本。这些重组大肠杆菌都需要使用丰富培养基，这将极大地提高发酵的原料成本，并导致计算的转化率偏高。
[0010]Jantama等人通过敲除ldhA、adhE、甲酸转运蛋白基因focA、pflB、ackA、甲基乙二醛合成酶基因mgsA、丙酮酸氧化酶基因poxB，并经过进化代谢，构建出重组大肠杆菌KJ073。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产79g/L(668mM)的丁二酸，糖酸转化率达到 0.79g/g (1.2mol/mol) (Jantama et al., PCT/US2008/057439; Jantama etal., 2008a, B1technol B1eng99:1140-1153)。进一步敲除丙酸激酶基因 tdcD、2_ 酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酮酸甲酸裂解酶基因tdcE、天冬氨酸氨基转移酶基因aspC、苹果酸酶基因sfcA，并经过进化代谢，构建出重组大肠杆菌KJ122。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产 80g/L(680mM)的丁二酸,糖酸转化率达到 0.89g/g(l.36mol/mol) (Jantamaetal., PCT/US2008/057439; Jantama et al., 2008b, B1technol B1englOl: 881-893)。上述的两个重组大肠杆菌都是经过进化代谢提高了丁二酸的生产能力。Zhang等人还通过敲除PEP-糖磷酸转移酶的酶I基因ptsl、pflB基因，并增强PEP羧化激酶(PCK)的活性，构建出重组大肠杆菌XZ721。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产39g/L(327mM)的丁二酸，糖酸转化率达到 0.82g/g(l.25mol/mol) (Zhang et al., PCT/US2010/029728; Zhang etal.,2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0011]为了提高大肠杆菌生产丁二酸的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。
发明概述
[0012]一方面，本发明提供了一种用于生产丁二酸的重组大肠杆菌。
[0013]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，⑵PflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制，(3)ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制，和(4)galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强；其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b) SthA基因表达的增强、和/或SthA基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0014]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因err和编码PTS系统酶IICBae的基因ptsG。
[0015]在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编码5-磷酸核糖异构酶的基因rp1、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醛醇酶的基因talB。
[0016]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中SthA基因和tktA基因的表达增强、和/或SthA基因和tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0017]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰:T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。 在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0018]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于染色体中或者质粒中。
[0019]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b) SthA基因表达的增强、和/或SthA基因所编码的蛋白质活性的增强；和(c)突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰:T81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0020]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:(5) ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；(6) aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因簇所编码的蛋白质活性的增强；和(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
[0021]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰:(9)pck基因表达的增强、和/或PCk基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0022]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰:(10) adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0023]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:(12)aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
[0024]在第二方面，本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
[0025]在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
附图简述
[0026]图1:改造大肠杆菌获得重组菌株NZ-037的示意图。X代表基因敲除，包括ldhA、pflB、ptsl、ackA-pta基因。四角星代表基因表达的增强,包括galP、pck、aceBA、dcuC基因。
[0027]图2:NZ-037经过1080代进化获得菌株HX021。
[0028]图3:HX023经过360代进化获得菌株HX024。
[0029]图4:HX024在5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。
[0030]图5:HX027经过650代进化获得菌株HX028。
[0031]图6:HX028在5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。
[0032]图7:HX024的转录组分析。灰色方框和白色方框中的数字代表HX024基因表达强度和野生型大肠杆菌ATCC8739的相对值；缩写词:GLC:葡萄糖；G6P:6_磷酸葡萄糖；F6P:6-磷酸果糖；FBP:1，6-二磷酸果糖；GAP:3_磷酸甘油醛；DHAP:磷酸二羟基丙酮；GBP:1，3- 二磷酸甘油酸；G3P:3-磷酸甘油酸；PEP:磷酸烯醇式丙酮酸；0ΑΑ:草酰乙酸；MAL:苹果酸；FUM:富马酸；SUC:丁二酸；6PGCL:6_磷酸葡萄糖酸内酯；6PGC:6_磷酸葡萄糖酸；RL5P:5_磷酸核酮糖；X5P:5-磷酸核糖；R5P:5_磷酸木糖；S7P -J-磷酸景天庚酮糖；E4P:4-磷酸赤鲜糖；PYR:丙酮酸；ACA:酰基辅酶A;ACP:酰基磷酸；ACE:乙酸；CIT:柠檬酸；ICIT:异柠檬酸；GLO:乙醛酸；DLAC:D-乳酸;FOR:甲酸;ETH ;乙醇；NAD+:氧化型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH:还原型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADH:还原型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP+:氧化型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。galP:半乳糖透型酶基因；glk:葡萄糖激酶基因；gapA:3-磷酸甘油脱氢酶基因；pfkA:6磷酸果糖激酶基因；pck:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；mdh:苹果酸脱氢酶基因；fumA:富马酸水合酶酶I基因；frdAB⑶:富马酸还原酶基因；zwf:6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因；pgl:6_磷酸葡萄糖酸内酯酶基因；gnd:6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因；rpe:5_磷酸核酮糖差向异构酶基因；rpiAB:
5-磷酸核糖差向异构酶基因；tktA:转酮醇酶基因；tktB:转酮醇酶基因；talB:转醛醇酶基因；pykF:丙酮酸激酶基因；pdh:丙酮酸脱氢酶基因；pta:磷酸乙酰转移酶基因；ackA:乙酸激酶基因；gltA:柠檬酸合成酶基因；acn:顺乌头酸酶基因；aceB:苹果酸合成酶基因；aceA:异柠檬酸裂解酶基因；sthA:嘧啶核苷酸转氢酶基因；maeB:NADPH依赖苹果酸酶基因；dcuB:厌氧C4双羧酸转运蛋白基因；dcuC:C4双羧酸转运蛋白基因；dctA:好养C4双羧酸转运蛋白基因。
[0033]图8: (A)野生型IpdA基因以及突变的IpdA基因(IpdA*)的核苷酸序列比对；(B)野生型以及突变的IpdA基因(IpdA*)所编码的多肽的氨基酸序列比对。
[0034]发明详述
[0035]除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
[0036]一方面，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化改造的重组大肠杆菌。在本发明的大肠杆菌中，通过调节代谢途径中所涉及的一些酶的活性，从而改善了大肠杆菌丁二酸的产量和/或转化率。
[0037]如本文所用，术语“经工程化改造的重组大肠杆菌”、“工程化的大肠杆菌”和“重组大肠杆菌”可互换使用，均是指经过修饰的大肠杆菌，其中所述的修饰可以是，例如，基因表达的增强、基因表达的抑制、引入新的基因、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲除、改变基因的拷贝数、引入质粒、改变基因的启动子(例如使用强启动子或弱启动子)等。
[0038]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下的一或多种修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b)sthA基因的表达增强、和/或SthA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0039]如本文所用，术语“磷酸戍糖途径(pentose-phosphate pathway) ”具有本领域内熟知的含义。磷酸戊糖途径是在动物、植物和微生物中普遍存在的一条糖的分解代谢途径，其特征在于葡萄糖被直接氧化脱氢和脱羧，而不经过糖酵解，脱氢酶的辅酶不是NAD+而是NADP+,产生的NADPH作为还原力以供生物合成用，而不是传递给O2。
[0040]在一些实施方案中，本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、或者磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编码5-磷酸核糖异构酶的基因rp1、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醒醇酶的基因talB。
[0041]在本发明中，tktA基因(Genbank No:ACA76448.1)所编码的蛋白质的是转酮醇酶(ECNo: 2.2.1.l)，zwf基因(Genbank No:ACA77430.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(EC No: 1.1.1.49) ;pgl基因(Genbank No:ACA78522.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC No:3.1.1.31) ;gnd基因(Genbank No:ACA76645.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(EC No: 1.1.1.44) ;rpi基因(Genbank No:ACA76468.1)所编码的蛋白质的是5_憐酸核糖异构酶(EC No:5.3.1.6) ;rpe基因(Genbank No:ACA76005.1)所编码的蛋白质的是5-磷酸核酮糖差向异构酶(EC No:5.1.3.1) ;talB基因(GenbankNo:ACA79258.1)所编码的蛋白质的是转醛醇酶(EC No:2.2.1.2)。
[0042]sthA 基因(Genbank No: ACA79653.1)编码一种可溶性转氧酶(EC No: 1.6.1.1)。在一个实施方案中，本发明的sthA基因的序列如SEQ ID N0.:5所示。在一个实施方案中，本发明的sthA基因的序列与SEQ ID N0.: 5所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性。
[0043]在一个实施方案中，本发明的tktA基因的序列如SEQ ID N0.: 6所示。在一个实施方案中，本发明的tktA基因的序列与SEQ ID N0.:6所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的序列相同性
[0044]如本文所用，术语“基因表达增强”，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式实现，例如但不限于:在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白活性增强”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因的表达增强”以及“基因所编码的蛋白质的活性增强”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0045]在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一些实施方案中，使用的强启动子例如是:Ppck*(SEQ ID N0.: 108) (Zhang etal.,2009b,ApplEnviron Microb1l75:7807-7813)、M1_37(SEQ ID N0.:109)、或Ml-93 (SEQID N0.:110) (Lu et al., 2012, Appl Microb1l B1technol93:2455-2426)。
[0046]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下的一或多种修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强；和(C)突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0047]术语“突变”具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个氨基酸。
[0048]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中或者染色体中。
[0049]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于染色体中。
[0050]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中。
[0051]如本文所用，术语“质粒”具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有:pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A_M、pTrc99A-M_Kan、pKD4 和 pKD46 等。
[0052]如本文所用，术语“染色体”具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人员熟知的，例如可以参见Michael R.Green和 Joseph Sambrook的〃Molecular Cloning:ALaboratory Manual〃(Fourth Edit1n)。
[0053]IpdA基因(Genbank No:ACA79157.1)是编码硫辛酰胺脱氢酶(EC No: 1.8.1.4)的基因。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型IpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.: 2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示，而本发明的大肠杆菌中所引入的突变的IpdA基因则含有如下的一或多种突变:C242T、C823T、和C1073T ;而所述突变的IpdA基因所编码的多肽具有如下的一或多种氨基酸置换:T811、P275S、和 A358V(参见图 8)。
[0054]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0055]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.: 2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0056]本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的IpdA基因序列可能与SEQ IDN0.:2所示IpdA基因序列不完全等同，以及不同大肠杆菌菌株的IpdA基因所编码的多肽序列可能与SEQ ID N0.:1所示的多肽序列不完全等同。在本发明的某些实施方案中，所述突变的IpdA基因中的突变位于对应于SEQ ID N0.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本发明的某些实施方案中，所述突变的IpdA基因所编码的多肽中的置换位于对应于SEQ ID N0.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
[0057]在本发明中，“对应于” SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2中某一特定位置的位置可以通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽或核苷酸序列，本领域技术人员可以在适当的位置引入相应的突变，从而实现本发明的技术效果。另外，本领域技术人员也可以使用保守和类似的氨基酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基，或者在IpdA基因序列中引入同义突变，而实现本发明的技术效果。
[0058]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中SthA基因和tktA基因的表达增强、或者sthA基因和tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0059]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下遗传修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b)sthA基因的表达增强、和/或SthA基因所编码的蛋白质的活性增；和(c)突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0060]在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰:Τ81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0061]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因在对应于SEQID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0062]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下遗修饰:(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b) sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强；和(c)突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰:T81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强，和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0063]在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下修饰:(a) tktA基因的表达增强、和/或tktA基因所编码的蛋白质的活性增强，(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强，和(c)突变的IpdA基因，其在对应于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的表达增强,和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0064]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0065]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAGlc的基因err和编码PTS系统酶IICBele的基因ptsG。
[0066]在本发明中，ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I (EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。err基因(GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGle(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBankNo:ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IICBele(EC No:2.7.1.69)。
[0067]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:(l)ptsl基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2) pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0068]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:(I) PtsI基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4) galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0069]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:(I) PtsI基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2) pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0070]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰:(l)ptsl基因表达的抑制、和/或PtSl基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB基因表达的抑制、和/或PflB所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4) galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0071]在本发明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC N0.2.3.1.54)。adhE 基因(Genbank No:ACA78022.1)编码乙醇 / 乙醒脱氢酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase) (EC No: 1.1.1.1, ECNo: 1.2.1.10)。IdhA 基因(GenBank No:ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶 A(lactatedehydrogenase A) (EC No: 1.1.1.28)。galP 基因(GenBank No:ACA76443.1)编码半乳糖MFS转运蛋白。gif基因(GenBank No:AAA27691.1)编码葡萄糖转运蛋白Glf (glucosefacilitator protein)。pck 基因(GenBank No:ACA75988.1)编码憐酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，又称作 PCK 酶(EC No:4.1.1.49)。
[0072]如本文所用，术语“基因表达的抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方式实现，例如但不限于:基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子(例如使用弱启动子)等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白质的活性抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因表达的抑制”以及“基因所编码的蛋白质的活性抑制”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0073]在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰:(l)ptsl基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2) pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；(3) IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0074]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:(5) ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；(6) aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因簇所编码的蛋白质活性的增强；和(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
[0075]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质的活性增强。在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中的pck基因被敲除。
[0076]pta 基因(GenBank No:ACA77021.1)编码磷酸乙酰转移酶(EC No:2.3.1.8)，而ackA 基因(GenBank No:ACA77022.1)编码乙酸激酶(EC No: 2.7.2.1)。aceBA 基因簇包括aceB 基因(GenBank No:ACA79615.1)编码苹果酸合成酶(EC No:2.3.3.9)和 aceA 基因(GenBank No:ACA79614.1)编码异柠檬酸裂解酶(EC No:4.1.3.1) ? dcuC 基因(GenBankNo:ACA78647.1)编码 C4 二羧酸转运蛋白 DcuC。mgsA 基因(GenBank No:ACA78263.1)编码甲基乙二醛合成酶(EC No:4.2.3.3)。
[0077]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰:(10) adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0078]tdcDE 基因簇包括 tdcD 基因(GenBank No:ACA76259.1)和 tdcE 基因(GenBankNo:ACA76260.1)，其中tdcD基因编码丙酸激酶(EC No:2.7.2.15)，而tdcE基因编码2-酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酸甲酸裂解酶(EC No:2.3.1.54)。adhE基因(GenBankNo:ACA78022.1)编码乙醇 / 乙醛脱氢酶(EC No: 1.1.1.1/EC No: 1.2.1.10)。
[0079]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰:(12)aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强；(13)dcuB基因表达的增强、和/或dcuB基因所编码的蛋白质活性的增强；(14)mdh基因表达的增强、和/或mdh基因所编码的蛋白质活性的增强；(15)fumA基因表达的增强、和/或fumA基因所编码的蛋白质活性的增强；(16)fumB基因表达的增强、和/或fumB基因所编码的蛋白质活性的增强；和(17)frdABCD基因簇表达的增强、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
[0080] aceEF基因簇编码丙酮酸复合体E1/E2 (EC No: 1.2.4.1)，包括aceE基因(GenBankNo:ACA79159.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体El和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E2。dcuB基因(GenBank No:ACA79506.1)编码厌氧C4 二羧酸转运蛋白 DcuB0 mdh 基因(GenBank No:ACA76147.1)编码苹果酸脱氢酶(EC No: 1.1.1.37)。fumA 基因(GenBank No:ACA77662.1)编码好氧富马酸酶 I(EC No:4.2.1.2) ? fumB 基因(GenBank No:ACA79507.1)编码厌氧富马酸酶 I (EC No:4.2.1.2)。frdABCD 基因簇编码富马酸还原酶(EC No: 1.3.5.4),包括frdA基因(GenBank No:ACA79460.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)编码富马酸还原酶铁硫蛋白亚基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)编码富马酸还原酶C亚基、和frdD基因(GenBankNo:ACA79463.1)编码富马酸还原酶D亚基。
[0081]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7260 (2013年2月25日，分类命名:大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中科院微生物所)的菌株。
[0082]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7259 (2013年2月25日，分类命名:大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中科院微生物所)的菌株。
[0083]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7550(2013年5月3日，分类命名:大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中科院微生物所)的菌株。
[0084]在第二方面，本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
[0085]在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法包括培养本发明的大肠杆菌，以及任选的收集或者纯化丁二酸。
[0086]在一个实施方案中,本发明所述的“培养”包括种子培养和发酵培养。
[0087]如本文所用，术语“种子培养”是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
[0088]如本文所用，术语“发酵培养”是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。
[0089]在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。
[0090]如本文所用，术语“厌氧发酵”是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。
[0091 ] 在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。
[0092]在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤:
[0093](I)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下培养一段时间得到种子液；
[0094](2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养。
[0095]本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟知的(诸葛健等，1994，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社)。
[0096]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:温度为30_45°C，例如30-31 0C >31-32 °C >32-33 °C >33-34 °C >34-35 °C >35-36 °C >36-37 °C >37-38 °C >38-39 °C、39-40 O、40-410、41-42 O、42-43 O、43-44 O、或 44-45 V。
[0097]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:种子培养的时间为6-16小时,例如6-7 小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14小时、14-15小时、或15-16小时。
[0098]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:发酵培养的时间为2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
[0099]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10% (V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
[0100]在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5 的接种量接种于发酵培养基，例如 OD55tl 为 0.05-0.1,0.1-0.2,0.2-0.3、0.3-0.4 或 0.4-0.5。
[0101]在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。
[0102]在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0103]大量元素:葡萄糖、KH2PO4、K2HP04、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜碱-KCl ；
[0104]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0105]在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0106]大量元素:葡萄糖20-120g/L，KH2P042_5g/L、K2HP044_8g/L、(NH4) 2HP043_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KC10.1-lg/L ；
[0107]微量元素=FeCl3.6H20 1-5 μ g/L、CoCl2.6H20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2H200.05-1 μ g/L、ZnCl20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2H20 0.05-1 μ g/L、MnCl2.4H2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0108]在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0109]大量元素:葡萄糖、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜碱-KCl ；
[0110]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0111]在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0112]大量元素:葡萄糖20-120g/L，NH4H2PO40.5-1.5g/L、(NH4) 2HP042_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜喊-KCl 0.1-lg/L ；
[0113]微量元素:FeCl3.6Η201-5μ g/L、CoCl2.6Η20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2Η20
0.05-1 μ g/L、ZnC l20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2Η200.05-1 μ g/L、MnCl2.4Η2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0114]在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下:
[0115]将菌株厌氧发酵，包括以下步骤:
[0116](I)种子培养:将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷却后将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37°C以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种；
[0117](2)发酵培养:将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按照终浓度OD55tl=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，37°C培养2_5天，得到发酵液。
[0118]在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法中还包括从发酵液中提取和/或纯化丁二酸的步骤。
[0119]在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
实施例
[0120]本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
[0121]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0122]本发明具体包括如下实施例:
[0123]实施例1、重组大肠杆菌NZ-037的构建
[0124]重组大肠杆菌NZ-037的构建(表1)，分为以下八个步骤:
[0125](I)乳酸脱氢酶基因IdhA的敲除
[0126](1-1):首先构建质粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表达调控和外源基因整合。
[0127]质粒构建操作步骤共四步:
[0128]第一步，以pACYC184 质粒 DNA (Mok et al., 1991, Nucleic AcidsResl9:2321-2323)为模板，使用引物 184-cat-up (SEQ ID N0.:7)和 184-cat-down(SEQ IDN0.:8)，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列，称为片段I。
[0129]扩增体系为:NewEnglandB1labs Phus1n5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各1mM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phus1n High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0130]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0131]第二步，以芽抱杆菌Bacillus subtilis sp subtilisl68的染色体DNA(该菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC N0.1.1390)为模板，使用引物Bs-sacB-up (SEQ IDN0.: 9)和Bs-sacB-down (SEQ ID N0.:10)进行PCR扩增果聚糖鹿糖转移酶基因(sacB),基因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。扩增体系和扩增条件参见上文第一步。
[0132]第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶SacI (NEB公司)在37°C酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extrat1n Kit，购自B1MIGA生物技术有限公司);各取20ng片段I和片段II，加入I μ 110ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、I μ I T4-DNA连接酶(NEB公司)，补充蒸馏水至10 μ 1，25°C反应5分钟；以酶连片段为底物，取I μ 1，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参见上文第一步，得到含有cat-sacB的连接片段III。
[0133]第四步，将PCR获得的片段III取1μ 1，加入1μ I pEASY-blunt simple载体(试剂盒，北京全式金生物技术有限公司)，25°C反应15分钟；氯化钙转化法:加入50 μ ITranslO感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100 μ g/ml)和氯霉素(终浓度为34 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F(SEQ IDN0.:11)/M13-R(SEQ ID N0.: 12)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ_CS (表3)。
[0134](1-2):从大肠杆菌ATCC8739 (Gunsalus et al.，1941，J B1l ChemHl: 853-858)出发，采用两步同源重组的方法敲除IdhA基因，获得重组大肠杆菌SUC-T102，包括以下六
I K
少:
[0135]第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up(SEQIDN0.:13 和 XZ-ldhA-down(SEQ ID N0.: 14)进行 PCR 扩增，PCR 产物为 1753bp，该 PCR 产物包含大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶编码基因IdhA (GenBank No:ACA77176.1)及其上下游各大约400个碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例上文(1-1)中的第一步。
[0136]将扩增得到的1753bp PCR产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系及氯化钙转化法参见上文(1-1)中质粒ρΧΖ-CS构建方法中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，将得到的重组质粒命名为PXZ001。
[0137]第二步，以pXZOOl质粒DNA为模板，使用引物XZ-1dhA-1 (SEQ ID N0.: 15和XZ-1 dhA-2 (SEQ ID N0.: 16)进行PCR扩增，得到4758bp的PCR产物，该PCR产物包含pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各约400个碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例上文(1-1)中的第一步。
[0138]第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段cat-sacB连接至第二步的PCR扩增产物,具体如下:
[0139]以pXZ-CS 为模板,使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID N0.: 17)和 cat-sacB-down (SEQIDN0.:18)进行PCR扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。
[0140]连接体系为:10ng的第二步4758bp的PCR产物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μ 110XT4 连接缓冲液(NEB 公司)，1μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive endunits/ml),补充蒸懼水至20 μ I。室温连接2小时。取1ul用氯化|丐转化法转入TranslO,过程参见上文(1-1)中质粒PXZ-CS构建方法中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZOOl中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为PXZ002C。
[0141]第四步，以pXZ002C质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA_down扩增出3447bp DNA片段I。扩增体系和扩增条件参见上文(1-1)中质粒ρΧΖ-CS构建步骤中的第一步。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因IdhA上游约400个碱基、cat-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因IdhA下游约400个碱基。
[0142]将DNA片段I用于第一次同源重组:首先将pKD46质粒(Datsenko andWanner2000, Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645;质粒购买于美国耶鲁大学 CGSC 大肠杆菌保藏中心)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。
[0143]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988，Nucleic Acids Resl6:6127-6145);将 50 μ I 感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的B1-Rad电击杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为Suc-TlOl。
[0144]第五步，将第二步得到的4758bp的PCR产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组；具体步骤如下:将第二步的4758bp的PCR产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extrat1n KU，购自B1MIGA生物技术有限公司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2 μ 110ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20 μ 1，37°C反应30分钟；加入1μ I Τ4连接酶(NEB公司，400，000粘附末端单位/ml)，室温反应2小时得到连接产物。酶连产物取1ul用氯化钙转化法转入Trans 10，过程参见上文(1-1)中质粒ρΧΖ-CS构建步骤中的第四步。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒PXZ003。
[0145]第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出829bp DNA片段ILDNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Suc_T101。
[0146]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的Suc-TlOl的电转化感受态细胞(制备方法参见Dower et al., 1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的B1-Rad电击杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时，去除pKD46质粒。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为763bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T102(表I)。
[0147]敲除IdhA基因所构建的质粒见表3,使用的引物序列见表2。
[0148](2)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB的敲除
[0149]从重组大肠杆 SUC-T102出发，使用上文(I)部分中相同的方法敲除pfIB基因(GenBank No:ACA78322.1)，获得重组大肠杆菌Suc_T104。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除IdhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将IdhA替换为PflB。
[0150](3)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I基因PtsI的敲除
[0151]从重组大肠杆菌SUC-T104出发，使用上文(I)部分中相同的方法敲除ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1)，获得重组大肠杆菌Suc_T106。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除IdhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将IdhA替换为ptsl。
[0152](4)半乳糖MFS转运蛋白GalP的激活
[0153]从重组大肠杆菌Suc-T106出发，将galP基因(GenBank No:ACA76443.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck* (SEQ ID N0.108)，获得重组大肠杆菌SUC-T108。在本发明中，Ppck*代表大肠杆菌pck启动子突变体，也即在相对于ATG起始处的-64位处G变为A(Zhang et al., 2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0154]包括以下六步:
[0155]第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up (SEQIDN0.:27)和 XZ-galP-P-down (SEQ ID N0.:28)进行 PCR 扩增，得到 841bp 扩增产物，为大肠杆菌ATCC8739的半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件以及其上下游各约400个碱基。将扩增产物克隆到PEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZOll。
[0156]第二步，以pXZOll 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ-galP-P_l(SEQ ID N0.:29 和XZ-galP-P-2 (SEQ ID N0.: 30)进行PCR扩增，得到4614bp扩增产物，其扩增产物包含pEASY-Blunt载体和半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及上下游各约400个碱基。
[0157]第三步，以pXZ-CS质粒为模板,使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down进行PCR扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的 DNA 片段。
[0158]将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的4614bp PCR扩增产物。转化Transl-Tl感受态细胞。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到ρΧΖΟΙΟ中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为PXZ012C。
[0159]第四步，以pXZ012C 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down 进行PCR扩增，得到3303bp DNA片段I ;该0嫩片段I包含半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件上游约400个碱基、cat-sacB DNA片段、半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件下约400个碱基。
[0160]将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T106，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc_T106。
[0161]电转条件参见上文(1-2)中IdhA基因敲除的第四步。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物为XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，得到验证正确的单菌落，将其命名为SUC-T107。
[0162]第五步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI (SEQID N0.:31)和 P-pck*-down-KpnI (SEQ ID N0.:32)扩增大肠杆菌 ATCC8739 的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的调控元件pck，引物序列见表2。PCR产物进行SpeI (购自NEB公司)和KpnI (购自NEB公司)酶切。将其克隆到经过相同酶酶切的质粒pTrc99A (Amann etal., 1998, Gene69:301-15)表达载体上，命名为质粒pXZ602。以质粒pXZ602为模板，使用引物pck*-F(SEQ ID N0.:33)和pck*-R(SEQ ID N0.:34)进行扩增，引物序列为见表2。扩增产物经过T4多核苷酸激酶(购自NEB公司)磷酸化，自连得到阳性质粒，测序验证无误后，命名为PXZ603。
[0163]以pXZ603 为模板，使用引物 P-pck^-up-Spel 和 P-pck^-down-Kpnl 进行 PCR 扩增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突变调控元件Ppck*，与第二步得到的4614bp扩增产物连接，得到质粒pXZ013。
[0164]用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物对以质粒pXZ013为模板扩增出DNA片段II。
[0165]第六步，DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Suc_T107。电转条件参见上文(1-2)中IdhA基因敲除步骤中的第六步。用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down进行PCR以及测序验证，得到1051bp为正确的单菌落，将其命名为Suc-T108(表 I)。
[0166]将半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件置换成Ppck*所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
[0167](5)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的激活
[0168]从重组大肠杆菌Suc-T108出发，将pck基因(GenBank No:ACA75988.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*,获得重组大肠杆菌Suc-TllO (表1)。
[0169]具体如下:
[0170]第一步同源重组:以pXZ-CS 为模板,使用引物 pck-cat-sacB-up (SEQ ID N0.:35)和pck-cat-sacB-down(SEQ ID N0.:36)扩增DNA片段I,用于第一次同源重组。引物序列见表2 ;得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-TlOS，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
[0171]第二步同源重组:以pXZ603质粒为模板，使用引物P-pcP-up-Spel/P-pck*-down-KpnI扩增(引物序列见表2)，得到378bp人工调控元件Ppck* ;将378bp人工调控元件Ppck*电转入整合了片段I的中间重组菌，得到重组菌I。重组菌IPCR验证的引物pck-YZ-up(SEQ ID N0.:37)和pck-YZ-down(SEQ ID N0.:38)，得到 676bp且测序正确的单菌落，将其命名为菌株Suc-TllO。
[0172](6)磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA的敲除
[0173]从重组大肠杆菌Suc-TllO出发，使用上文(I)部分中相同的方法敲除磷酸乙酰转移酶编码基因pta(GenBank N0.ACA77021.1)和乙酸激酶编码基因ackA(GenBankN0.ACA77022.1)，获得重组大肠杆菌NZ-035 (表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除IdhA基因过程中所使用的引物的名称，仅分别将IdhA替换为ackA或者pta。
[0174](7)苹果酸合成酶AceA和异柠檬酸裂解酶AceB的激活
[0175]以重组大肠杆菌NZ-035出发，使用和实施案例上文(4)部分中相同的方法将aceBA 基因簇(aceB GenBank No:ACA79615.1, aceA GenBank No:ACA79614.1)的原始启动子替换为Ppck*启动子，获得重组大肠杆菌NZ-036(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于激活galP基因过程中所使用的引物的名称，仅将galP替换为aceB。
[0176](8) 二羧酸Dcu转运蛋白DcuC的激活
[0177]以重组大肠杆菌NZ036出发，使用和上文(4)部分中相同的方法将dcuC基因(GenBank N0.ACA78647.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*,获得重组大肠杆菌NZ-037(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于激活galP基因过程中所使用的引物的名称，仅将galP替换为dcuC。
[0178]表1、生产丁二酸的重组大肠杆菌
[0179]
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰: (1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制， (2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制， (3)IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制，和 (4)galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强； 其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰: (a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和 (b)SthA基因表达的增强、和/或SthA基因所编码的蛋白质活性的增强。
2.权利要求1的大肠杆菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因err和编码PTS系统酶IICBele的基因ptsG。
3.权利要求1或2的大肠杆菌，其中所述磷酸戊糖途径中所涉及的基因是选自如下的一或多种基因:编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编码5-磷酸核糖异构酶的基因rp1、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醛醇酶的基因talBo
4.权利要求3的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中SthA基因和tktA基因的表达增强、和/或SthA基因和tktA基因所编码的蛋白质活性的增强。
5.权利要求1-4任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰: (5)ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制； (6)aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强； (7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因所编码的蛋白质活性的增强；和 (8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
6.权利要求1-5任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰:T81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α， 任选地，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
7.权利要求6的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因位于质粒或染色体中。
8.权利要求6的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7260保藏于CGMCC。
9.权利要求1-7任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰:(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
10.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7259保藏于CGMCC。
11.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下修饰: (10)adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；和 (11)tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
12.权利要求11的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7550保藏于CGMCC。
13.权利要求9的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的遗传改造:aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
14.生产丁二酸的方法,所述方法包括培养权利要求1-13任一项的大肠杆菌。
15.权利要求1- 13任一项的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
【文档编号】C12N1/21GK104178443SQ201310198953
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】张学礼, 朱欣娜, 徐洪涛, 谭在高 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所