一种生产p-d-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产P-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用。本发明提供的重组菌为将编码SDGBGL蛋白的基因导入大肠杆菌得到的重组菌;所述SDGBGL蛋白为如下（a)或（b)或（c):(a)序列表的序列1自N末端第20-775位氨基酸残基组成的蛋白质；（b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c)将（a)或（b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有P-葡萄糖苷酶活性的由（a)或（b)衍生的蛋白质。本发明提供的菌株生产e-葡萄糖苷酶的能力高，发酵过程简单易操作，具有很好的应用价值。本发明对于P-葡萄糖苷酶的生产以及相关工业应用具有重大价值。
【专利说明】一种生产β -D-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产β -D-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002] β-葡萄糖苷酶（P-D-Glucosidase，EC3. 2. L 21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水 解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cell〇bias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素 酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β -D-葡萄 糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
[0003] 1837年Liebig和Wohler[l]首次在苦杏仁汁中发现了 β-葡萄糖苷酶。该酶 在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现 该酶的存在。β -葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原 核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌 (Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母（Candidapeltata)、黄孢原 毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)等；β -葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝、 猪小肠等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种生产β-葡萄糖苷酶的工程菌及其应用。
[0005] 本发明提供的重组菌为将编码SDGBGL蛋白的基因导入大肠杆菌得到的重组菌； 所述SDGBGL蛋白为如下（a)或（b)或（c):
[0006] (a)序列表的序列1自N末端第20-775位氨基酸残基组成的蛋白质；
[0007] (b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (c)将（a)或（b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具 有β -葡萄糖苷酶活性的由（a)或（b )衍生的蛋白质。
[0009] 所述编码SDGBGL蛋白的基因可为如下（1)或（2)或（3)或（4)所述的DNA分子：
[0010] (1)序列表的序列2自5'末端第58-2328位核苷酸所示的DNA分子；
[0011] (2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0012] (3)在严格条件下与（1)或（2)限定的DNA序列杂交且编码具有β-葡萄糖苷酶 活性的蛋白的DNA分子；
[0013] (4)与（1)或（2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有β-葡萄 糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。
[0014] 上述严格条件可为在6父55(：，0.5%503的溶液中，在65〇(：下杂交，然后用2\55(：、 0· 1%SDS 和 I X SSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0015] 所述编码SDGBGL蛋白的基因可通过重组表达载体导入所述大肠杆菌。所述重组 表达载体具体可为将所述编码SDGBGL蛋白的基因导入pEASY-El载体得到的重组质粒。
[0016] 所述大肠杆菌可为大肠杆菌Rosetta (DE3)。
[0017] 本发明提供的菌株SDGBGL，是在Escherichia coli Rosetta (DE3)中导入含有目 的蛋白的编码基因的重组质粒得到的，已于2013年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 7630。
[0018] 本发明还保护以上任一所述的重组菌在制备β-葡萄糖苷酶中的应用。
[0019] 本发明还保护以上任一所述的重组菌的发酵上清。制备所述发酵上清的方法可如 下：将所述重组菌振荡培养至0D600约为0. 6时加入IPTG并使其浓度达到0. 5mM，诱导培养 后离心收集上清液。制备所述发酵上清的方法具体如下：将所述重组菌接种于含1〇〇μ g/ ml氨苄青霉素的LB培养基，37° C、200rpm振荡培养至0D600约为0. 6时加入IPTG并使其 浓度达到0. 5mM，然后20° C、200rpm振荡培养8小时，然后4° C、5000rpm离心30min并收 集上清液。
[0020] 本发明还保护所述发酵上清在制备β -葡萄糖苷酶中的应用。
[0021] 本发明还保护所述发酵上清在水解糖苷中的应用。所述糖苷可为单葡萄糖苷、二 葡萄糖苷或半乳糖苷。所述糖苷具体可苷类化合物的糖苷。所述苷类化合物可为大豆苷 元-7-0-葡萄糖苷、黄豆苷元-7-0-葡萄糖苷、牛蒡苷元-4-0-葡萄糖苷、白藜芦醇-3-0-葡 萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-半乳糖苷、对硝基 苯-β -D-葡萄糖苷、对硝基苯-β -D-半乳糖苷、染料木黄酮-7-0-葡萄糖苷、七叶树苷 元-6-0-葡萄糖苷、开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷或松脂醇二葡萄糖苷。基于所述发酵 上清可以水解以上苷类化合物的糖苷，所述发酵上清可用于制备大豆苷元、黄豆苷元、牛蒡 苷元、白藜芦醇、山奈酚、槲皮素、对硝基苯酚、染料木黄酮、七叶树苷元、开环异落叶松树脂 酚和松脂醇等。
[0022] 本发明提供的菌株生产β_葡萄糖苷酶的能力高，发酵过程简单易操作，具有很 好的应用价值。本发明对于β_葡萄糖苷酶的生产以及相关工业应用具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为Strain-I的16S rRNA序列与现有序列的比对结果。
[0024] 图2为实施例2中的SECO转化率结果。
[0025] 图3为实施例2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0026] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0027] pEASY-El载体：北京全式金生物技术有限公司，目录号CE101-01。大肠杆菌 Rosetta(DE3):北京康为世纪生物科技有限公司，目录号CW0811A。
[0028] 开环异落叶松树脂酚（SECO标准品):Sigma公司，目录号60372。大豆苷元-7-0-葡 萄糖苷（Daidzin，产品号30408)、黄豆苷元-7-0-葡萄糖苷（Glycitin，产品号G1296)、牛 蒡苷元-4-0-葡萄糖苷（Arctiin，产品号SMB00078)、白藜芦醇-3-0-葡萄糖苷（Piceid， 产品号15721)、山奈酚-3-0-葡萄糖苷（Astragalin，产品号79851)、槲皮素-3-0-葡萄糖 苷（Isoquercitrin，产品号 17793)、槲皮素-3-0-半乳糖苷（Hyperoside，产品号 83388)、 对硝基苯 _ β -D-葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β -D-glucopyranoside，产品号 N7006)、对硝 基苯-β -D-半乳糖昔（4-nitrophenyl- β -D-galactopyranoside，产品号 N8755)、染料木 黄酮-7-0-葡萄糖苷（Genistin，产品号G0897)、七叶树苷元-6-0-葡萄糖苷（Aesculin，产 品号02352)、开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（Secoisolariciresinol diglucoside，产品 号 S0202)均购自 Sigma-Aldrich 公司。松脂醇二葡萄糖苷（Pinoresinol diglucoside, 产品号63902-38-5)购自北京华美互利生物化工。大豆苷元（Daidzein，产品号D7802)、 黄豆苷元（Glycitein，产品号G2785)、牛蒡苷元（Arctigenin，产品号SMB00075)、白藜 芦醇（trihydroxystilbene，产品号 572691)、山奈酚（kaempferol，产品号 60010)、槲皮 素（Quercetin，产品号Q4951)、对硝基苯酚（4-Nitrophenol，产品号48695)、染料木黄酮 (Genistein，产品号G6699)、松脂醇（Pinoresinol,产品号40674)均购自Sigma公司。七 叶树苷元（Esculetin，产品号246573)购自Aldrich公司。以上各个化合物纯度均在95% 以上。
[0029] 实施例1、野生菌、SDGBGL蛋白和bgl基因的发现
[0030] 采集新鲜人粪便标本，经庖肉培养基增菌，得到肠道菌群样本，接种到5mL无碳源 培养基中，加入底物亚麻籽柏(粒径为200 μ m-1000 μ m)100mg，37°C厌氧培养48h。取10 μ 1 无碳源培养基菌液，10倍梯度稀释。取1〇_6倍稀释液涂平板，37°C厌氧培养24h。挑取 其中的单菌落，接种到5mL无碳源培养基中，加入底物亚麻籽柏(粒径为200 μ m-1000 μ m) IOOmg,培养2天后进行HPLC检测，筛选可以产生肠二醇（enterodiol，END)的单菌落。取 10 μ L活性菌的菌液加入庖肉液体培养基增菌，KT 5倍稀释液涂平板，厌氧培养48h后观 察，有白色且较大（Strain-I)、黄色（Strain-II)和透明且较小（Strain-Ill)三种不同颜 色和形态的菌落。
[0031] 如图 1 所不，Strain-I 的 16S rRNA 序列与菌株 Bacteroides uniformis mat-344 有100%的相似度。因此，Strain-I属于单形拟杆菌B.uniformis。已于2011年5月25日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 4897。
[0032] 菌株Strain-I含有β -D-葡萄糖苷水解酶，可以脱去开环异落叶松树脂酚二葡萄 糖苷（Secoisolariciresinol Diglucoside, SDG)结构上的双糖而生成开环异落叶松树脂 酷（Secoisolariciresinol, SEC0)。
[0033] 发明人通过生物信息学的方法，利用NCBKNational Center for Biotechnology Information)服务器中的protein数据库，从菌株Strain-I的全基因组测序信息中筛选 得到了与β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，BGL)相关的蛋白，将该蛋白命名为SDGBGL 蛋白，将编码该蛋白的基因命名为bgl基因。
[0034] SDGBGL蛋白如序列表的序列1所示(预期分子量为81. 5kDa)，bgl基因如序列表 的序列2所示。
[0035] 实施例2、重组菌的构建
[0036] 一、重组质粒的构建
[0037] 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0038] 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。
[0039] Fl :5, -CCGGGTGTGCCGCAGCTTGGAAAGT-3,；
[0040] Rl :5' -CAGACAATCCTACTCTCATCTCTTC-3'。
[0041] 3、将步骤2的PCR扩增产物插入pEASY-El载体，得到重组质粒pEASY-SDGBGL。根 据测序结果，对重组质粒pEASY-SDGBGL进行结构描述如下：在pEASY-El载体中插入了序列 表的序列2自5'末端第58-2328位核苷酸所示的双链DNA分子(该双链DNA分子编码序列 表的序列1自N末端第20-775位氨基酸残基组成的蛋白质)。
[0042] 二、重组菌的构建
[0043] 将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta (DE3)，获得5株转bgl基因重组 菌，分别命名为重组菌I、重组菌II、重组菌III、重组菌IV和重组菌V。
[0044] 三、重组菌表达目的蛋白的能力比较以及重组菌产生的粗酶液的β -D-葡萄糖苷 水解酶酶活比较。
[0045] 将步骤二得到的各个重组菌按照如下平行处理的方式进行试验(将Strain-I作 为对照）：
[0046] 1、将重组菌接种于含100μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基，37° C、200rpm振荡培 养至OD6c?约为0. 6时(此时取样并离心，分别收集上清液和沉淀，将上清液命名为上清液 甲；将沉淀进行超声破碎后离心收集上清液，将上清液命名为上清液乙）加入IPTG并使其 浓度达到0. 5mM，然后20° C、200rpm振荡培养8小时，然后4° C、5000rpm离心30min并分 别收集上清液(此时的上清液命名为上清液丙）和菌体，用PBS缓冲液重悬菌体后超声破碎 至溶液澄清且不再粘稠，然后4° CUOOOOrpm离心30min，收集上清液(此时的上清液命名 为上清液丁)。
[0047] 2、检测各个重组菌进行步骤1得到的上清液丙的β -D-葡萄糖苷水解酶酶活
[0048] 使用pH6. 0的磷酸钠缓冲液配制2. Omg/ml的SDG溶液，将Iml SDG溶液与Iml上 清液丙混合，30° C静置反应，不同时间点取样，通过HPLC分析SECO的产量。
[0049] HPLC参数如下：
[0050] 色谱柱：BDS HYPERSIL C18 (4. 6mmX 250mm，5 μ m) (Thermo Fisher Scientific Inc.，USA);保护柱：SecurityGuard Cartridges C18(4X3. 0mm，广州菲罗门科学仪器有限 公司）；
[0051] 流动相为水、乙腈、或乙腈和水的混合物；
[0052] 洗脱过程：第0_30min，乙腈在流动相中的体积百分含量由0%线性上升至50% ;第 30-32min，乙腈在流动相中的体积百分含量由50%线性上升至100% ;第32-40min，流动相为 乙腈。
[0053] 流速：1. 0ml/min ;
[0054] 检测波长：280nm ;
[0055] 柱温：25° C。
[0056] SECO标准品的峰值对应的保留时间为2 Imin。
[0057] SECO 转化率（%)= Csecq/C' SECQX 100%，Csecq 为实际测得的 SECO 含量（mg/ml)，C' SEC。 为理论上SDG全部转化得到的SECO含量（mg/ml)。
[0058] SECO转化率结果见图2。重组菌I、重组菌II、重组菌III、重组菌IV和重组菌V 得到的上清液丙的SECO转化率均显著高于菌株Strain-I，90min即可基本完成SDG到SECO 转化反应，其中重组菌Π的效果最好，SECO转化率最大，90min时的SECO转化率可达94%。
[0059] 3、将重组菌II进行步骤1得到的各个上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图 3。图3中，泳道1为上清液甲，泳道2为上清液乙,泳道3为上清液丙,泳道4为上清液丁， 泳道M为蛋白分子量标准。结果表明：经IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，Isoprop yl β -D-1-Thiogalactopyranoside)诱导前的培养上清以及菌体破碎上清中均没有检测到 目的蛋白；IPTG诱导后的培养上清中可以检测到约80kDa的蛋白，与预期大小81. 5kDa - 致，其表达量约占整个可溶性蛋白的20% ;IPTG诱导后的菌体破碎上清中没有检测到目的 蛋白。
[0060] 四、重组菌的保藏
[0061] 将重组菌II命名为SDGBGL，已于2013年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 7630。
[0062] 实施例3、SDGBGL蛋白对不同苷类成分的转化
[0063] 在β -D-葡萄糖苷水解酶的作用下，大豆苷元-7-0-葡萄糖苷的预期产物为大豆 苷元，黄豆苷元-7-0-葡萄糖苷的预期产物为黄豆苷元，牛蒡苷元-4-0-葡萄糖苷的预期 产物为牛蒡苷元，白藜芦醇-3-0-葡萄糖苷的预期产物为白藜芦醇，山奈酚-3-0-葡萄糖 苷的预期产物为山奈酚，槲皮素-3-0-葡萄糖苷的预期产物为槲皮素，槲皮素-3-0-半乳 糖苷的预期产物为槲皮素，对硝基苯-β -D-葡萄糖苷的预期产物为对硝基苯酚，对硝基 苯-β -D-半乳糖苷的预期产物为对硝基苯酚，染料木黄酮-7-0-葡萄糖苷的预期产物为染 料木黄酮，七叶树苷元-6-0-葡萄糖苷的预期产物为七叶树苷元，开环异落叶松树脂酚二 葡萄糖苷的预期产物为开环异落叶松树脂酚，松脂醇二葡萄糖苷的预期产物为松脂醇。
[0064] 取苷类化合物(大豆苷元-7-0-葡萄糖苷、黄豆苷元-7-0-葡萄糖苷、牛蒡苷 元-4-0-葡萄糖苷、白藜芦醇-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-葡萄糖 苷、槲皮素-3-0-半乳糖苷、对硝基苯-β -D-葡萄糖苷、对硝基苯-β -D-半乳糖苷、染料木 黄酮-7-0-葡萄糖苷、七叶树苷元-6-0-葡萄糖苷、开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷或松脂 醇二葡萄糖苷)，用pH6. 0的磷酸钠缓冲液配成I. Omg/ml的溶液。取Iml溶液与Iml实施例 2中的重组菌II得到的上清液丙混合，30° C静置反应90min。取样后利用HPLC的方法检测 产物，HPLC参数与实施例2中的HPLC参数完全相同。大豆苷元标准品的峰值对应的保留时 间为7. 8min，黄豆苷元标准品的峰值对应的保留时间为11. 2min，牛蒡苷元标准品的峰值 对应的保留时间为23. 4min，白藜芦醇标准品的峰值对应的保留时间为15. lmin，山奈酚标 准品的峰值对应的保留时间为13. 5min，槲皮素标准品的峰值对应的保留时间为12. 3min， 对硝基苯酚标准品的峰值对应的保留时间为5. 7min，染料木黄酮标准品的峰值对应的保留 时间为25. 2min，七叶树苷元标准品对应的保留时间为8. 9min，松脂醇标准的峰值对应的 保留时间为19. 9min、开环异落叶松树脂酚标准品的峰值对应的保留时间为21. Omin。
[0065] 结果见表1。重组菌II得到的上清液丙（SDGBGL蛋白）对不同的苷类化合物均 具有水解作用，它不仅可以水解单葡萄糖苷，同时可以水解二葡萄糖苷，且可以水解半乳糖 苷，在90min的反应混合液中可以检测到这些化合物经脱糖后的苷元成分。
[0066] 表ISDGBGL蛋白转化不同苷类成分90min后的产物
[0067]
【权利要求】
1. 将编码SDGBGL蛋白的基因导入大肠杆菌得到的重组菌；所述SDGBGL蛋白为如下 (a)或（b)或（c): (a) 序列表的序列1自N末端第20-775位氨基酸残基组成的蛋白质； (b) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c) 将（a)或（b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 β -葡萄糖苷酶活性的由（a)或（b)衍生的蛋白质。
2. 如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述编码SDGBGL蛋白的基因为如下（1) 或（2)或（3)或（4)所述的DNA分子： (1) 序列表的序列2自5'末端第58-2328位核苷酸所不的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； (3) 在严格条件下与（1)或（2)限定的DNA序列杂交且编码具有β -葡萄糖苷酶活性 的蛋白的DNA分子； (4) 与（1)或（2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有β -葡萄糖苷 酶活性的蛋白的DNA分子。
3. 如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述编码SDGBGL蛋白的基因通过重 组表达载体导入所述大肠杆菌。
4. 如权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述重组表达载体为将所述编码SDGBGL 蛋白的基因导入PEASY-El载体得到的重组质粒。
5. 如权利要求1至4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌 Rosetta (DE3)。
6. 如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的保藏编号为CGMCC No.7630。
7. 权利要求1至6中任一所述的重组菌在制备β -葡萄糖苷酶中的应用。
8. 权利要求1至6中任一所述的重组菌的发酵上清。
9. 权利要求8所述发酵上清在制备β-葡萄糖苷酶中的应用。
10. 权利要求8所述发酵上清在水解糖苷中的应用。
【文档编号】C12N9/42GK104212754SQ201310217251
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】杨东辉, 陶逸伦, 刘树林 申请人:北京大学