基于电化学-dna反应控制芯片的酸碱法扩增dna片段技术的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术,具体地,本发明提供了一种扩增核酸的方法,所述方法包括步骤(a)在pH10-14的碱性条件下使双链核酸分子解链;(b)在pH5-8的中性和近中性条件下使解链的核酸分子与引物进行复性;以及在核酸聚合酶存在下使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸从而形成扩增的双链核酸分子。该方法由于其简便、高效、低成本、环境友好等特点,可广泛用于医学检验、刑事证据提取、分子生物学研究等领域。
【专利说明】基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸检测领域,具体地,本发明涉及一种基于通过溶液pH值控制双链 核酸变性-复性过程的核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] PCR技术在生命科学实验和生物分子检测等领域广泛使用,对生命科学的发展产 生了难以估量的推动作用。由于其待扩增核酸样品制备简单、样品需要量少、操作简单、扩 增过程完全自动化而逐步运用到相关领域。近些年来,在病理学检验、疾病早期预警、流行 病病毒分离、考古、法医物证学等诸多领域中,PCR技术都有非常精彩的应用。
[0003] 由于PCR技术具有高度的不可替代性,PCR技术从诞生之时起就处于不断发展、不 断创新之中。当前的PCR技术从温度的变化入手,通过控制DNA分子在不同温度下所进行 的变性、复性和延伸过程,施加 DNA复制所必需的各种碱基、引物、无机离子、缓冲液和DNA 聚合酶,完成DNA分子的高保真度扩增。但是,这一方法具有明显的局限性。其一,每一个 循环PCR反应都涉及温度的大幅度变化,由于温度变化是一个缓慢的过程,所以整个PCR的 反应时间至少需要2小时。其二,每一个循环中,反应温度都在94-36-72摄氏度的区间内 往复变化,电能消耗量高。因此,现行PCR的使用成本也相对较高。电能消耗量高的另一个 副作用是对环境的损害。其三,除了实时定量PCR,常规的PCR反应无法对反应过程进行监 控,无法对DNA扩增的效果进行及时的干预。上述不足之处制约了 PCR技术的进一步发展, 是PCR更广泛使用的瓶颈之一。
[0004] 综上所述,本领域尚缺乏一种耗能低,反应时间短,可及时干预的PCR技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种通过调节体系酸碱性控制双链核酸变性-复性过程的 方法。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种简便、高效率、能够在常温下进行的PCR技术。
[0007] 本发明的第一方面,提供了一种扩增核酸的方法,所述方法包括:
[0008] (la)变性步骤:在ρΗΙΟ-14的碱性条件下,使得扩增体系中的双链核酸分子解 链;
[0009] (lb)复性和延伸步骤:在pH5_8的中性和近中性条件下,使得扩增体系中的单链 核酸分子与引物进行复性,和在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核酸分子的引物进行 延伸,形成扩增的双链核酸分子。
[0010] 在另一优选例中,所述方法包括重复上述步骤(a)、(b)至少15?60次,较佳地 20?45次。
[0011] 在另一优选例中,在步骤(a)、和/或(b)中,反应温度为10?70°C;较佳地,反应 温度为15?45°C。
[0012] 在另一优选例中,在整个扩增过程中,扩增体系的温度维持在10?70°C ;较佳地, 15 ?45°C。
[0013] 在另一优选例中,步骤(a)中所述pH较佳为11. 5-12. 5。
[0014] 在另一优选例中,步骤(b)中所述pH较佳为6. 5-7. 5。
[0015] 各步骤中,时间的优选范围如下:步骤(a) > 20秒,步骤(b) > 60秒。
[0016] 步骤(a)较佳的20-120S,更佳25-80s,最佳35-60s ;步骤(b)较佳的60-300S,更 佳 60-150s,最佳 100-150s。
[0017] 在另一优选例中,所述的核酸分子包括DNA、RNA、或DNA-RNA杂合分子。
[0018] 在另一优选例中,所述扩增体系含有待扩增DNA、dNTP、引物、聚合酶和镁离子。
[0019] 在另一优选例中,在步骤(a)和/或(b)中,通过添加碱性溶液或酸性溶液来调节 扩增体系的pH值。
[0020] 在另一优选例中,通过向扩增体系中添加碱性溶液调节扩增体系的pH值至 ρΗΙΟ-14。
[0021] 在另一优选例中,所述的碱性溶液包括:NaOH溶液、K0H、Ca(0H)2等强碱性溶液,以 及BR缓冲液(pH = 11?14)、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(pH = 10?12)等能够将反 应体系pH值调节至碱性(pH > 10)的缓冲液。
[0022] 在另一优选例中,通过向扩增体系中添加酸性溶液调节扩增体系的pH值至 pH5_8。
[0023] 在另一优选例中,所述的酸性溶液包括:HC1溶液、H2S04溶液、ΗΝ0 3溶液,Η3Ρ04溶 液等强酸溶液,以及BR缓冲液(pH = 0?3)、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液 等能够将反应体系pH值调节回中性的缓冲液。
[0024] 在另一优选例中,所述方法还包括:通过电化学方法调控扩增体系的pH值。
[0025] 在另一优选例中,所述的步骤(a)和/或(b)中,还包括通过电化学法测定扩增体 系的电位,从而测得扩增体系的pH值。
[0026] 在另一优选例中,所述的步骤(a)、和/或(b)中,还包括通过电化学法调节扩增体 系的电位,从而调节扩增体系的pH值。
[0027] 在另一优选例中,所述的扩增核酸的方法为聚合酶链反应方法(PCR)。
[0028] 在另一优选例中,所述的核酸聚合酶为具有DNA聚合酶活性的酶类,较佳地,所述 的核酸聚合酶包括:大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段(DNA聚合酶I大片段)、大肠杆菌 DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、DNA聚合酶a、DNA 聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合 酶、Vent DNA 聚合酶、Bca Best DNA 聚合酶、Sac DNA 聚合酶、Iproof DNA 聚合酶、KOD DNA 聚合酶、Phusion DNA 聚合酶、UlltraPF? DNA 聚合酶、LA Tag DNA 聚合酶、Super Tag DNA 聚合酶。
[0029] 在另一优选例中,所述的核酸聚合酶耐受pH5_14。
[0030] 在另一优选例中,所述的核酸聚合酶耐受PH6-9。
[0031] 在另一优选例中,在步骤(b)中还包括补加核酸聚合酶的步骤。
[0032] 在另一优选例中,核酸聚合酶的加入量为10U/循环周期。
[0033] 本发明的第二方面,提供了一种扩增核酸的设备,所述设备包括:
[0034] (3i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置,所述容器用于容纳进行核酸扩增 反应的扩增体系;
[0035] (3ii)碱性溶液添加装置,所述碱性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加碱性 溶液,从而调节扩增体系的PH至碱性条件;
[0036] (3iii)酸性溶液添加装置,所述酸性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加酸性 溶液,从而调节扩增体系的PH至酸性或中性条件;
[0037] (3iv) pH测量装置,所述的pH测量装置用于精确控制体系pH值。
[0038] 在另一优选例中,所述的(i)?(iv)中的一个或多个包括在电化学工作站内。
[0039] 在另一优选例中,所述的用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置为DNA反应芯 片。
[0040] 在另一优选例中,所述的pH测量装置包括:指示剂、酸度计、pH电位计。
[0041] 在另一优选例中,所述的设备还包括核酸聚合酶添加装置。
[0042] 本发明的第三方面,提供了一种扩增核酸的设备,所述设备包括:
[0043] (4i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的扩增装置,其中,所述容器用于容纳进 行核酸扩增反应的扩增体系;
[0044] (4ii)电化学工作站,所述电化学工作站用于调控及检测反应体系的pH值。
[0045] 在另一优选例中,所述的扩增装置包括微流控芯片、DNA反应芯片、enpidoff管、 培养瓶。
[0046] 在另一优选例中,所述电化学工作站与扩增装置之间通过导线相互连接。
[0047] 在另一优选例中,所述电化学工作站通过对体系施加预设的电压,从而调控所述 扩增体系的pH达到预定值。
[0048] 在另一优选例中,所述的设备中还包括用于添加核酸聚合酶添加装置。
[0049] 在另一优选例中,所述的扩增装置为微流控芯片。
[0050] 在另一优选例中,所述设备通过电化学方法调控所述扩增体系的pH值。
[0051] 在另一优选例中,所述设备通过改变芯片上工作电极与参比电极之间电位差的方 法产生相应的电流,引起DNA反应液的电解质产生相应程度分解,从而引起pH值变化。
[0052] 在另一优选例中,所述微流控芯片包括工作电极和/或参比电极
[0053] 在另一优选例中,所述的工作电极为Ag/AgCl电极。
[0054] 在另一优选例中,所述的参比电极为Ir02电极。
[0055] 在另一优选例中,所述微流控芯片包括含有DNA反应液的响应区(R区)和/或含 有电解质溶液的控制区(C区)。
[0056] 在另一优选例中,所述的工作电极和C区相连。
[0057] 在另一优选例中,所述的参比电极和R区相连。
[0058] 在另一优选例中,所述的C区和R区之间为半封闭式连接。
[0059] 本发明的第四方面,提供了一种扩增核酸的方法,所述方法包括:
[0060] (1)提供一扩增体系,所述扩增体系包括待扩增DNA模板、引物、dNTP、镁离子、和 聚合酶;和
[0061] (2)通过电化学方法,调整扩增体系的pH值,从而实现核酸分子的变性和复性,并 进行核酸扩增。
[0062] 在另一优选例中,所述方法包括:
[0063] 在步骤(1)中,提供如本发明第三方面所述的扩增核酸的设备,并将待扩增DNA模 板、引物、dNTP、镁离子、聚合酶加入所述设备中的扩增装置中,构成扩增体系;和
[0064] 在步骤(2)中,所述的电化学方法是使用电化学工作站。
[0065] 在另一优选例中,所述方法还包括:在步骤(1)之前,将如本发明第三方面所述 的用于放置进行核酸扩增反应的容器的扩增装置与电化学工作站用导线连接,测定标准电 位-pH曲线;并依据测定的标准电位-pH曲线,设定电化学工作站的电极电位。
[0066] 在另一优选例中,在单次扩增前,对标准曲线进行测定。
[0067] 在另一优选例中,在反应体系连续使用过程中,不另行对标准曲线进行测定。
[0068] 在另一优选例中,所述电化学工作站对扩增体系施加预设电压,从而控制系统的 pH值。
[0069] 在另一优选例中,所述的聚合酶为DNA聚合酶I或Taq酶。
[0070] 本发明的第五方面,提供了一种应用电化学的方法扩增核酸的方法,所述方法包 括选白下组的一个或多个步骤:
[0071] 在扩增溶液体系中测定电学参数和溶液pH的关系;
[0072] 设定电学参数,通过溶液电化学反应将pH控制在10-14的碱性条件,使得扩增体 系中的双链核酸分子解链;
[0073] 设定电学参数,通过溶液电化学反应将pH控制在5-8的中性和近中性条件,使得 扩增体系中的单链核酸分子与引物进行复性,并在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核 酸分子的引物进行延伸,形成扩增的双链核酸分子。
[0074] 在另一优选例中,所述电学参数包括电位、电流、电阻、电容、电导、电量。
[0075] 在另一优选例中,所述方法包括重复上述步骤(1)、(2)和(3)至少15?60次,较 佳地20?45次。
[0076] 本发明的第六方面,提供了一种核酸的检测方法,所述方法包括:
[0077] 用如本发明第一方面、第四方面或第五方面所述的方法,对待测核酸进行扩增;和
[0078] 对扩增后的核酸进行检测。
[0079] 在另一优选例中,用电泳法对扩增后的核酸进行检测。
[0080] 在另一优选例中,在检测前,用限制性内切酶对产物进行酶切和测序,然后用于后 续检测。
[0081] 本发明的第七方面,提供了一种对核酸分子进行变性-复性的方法,所述方法包 括:
[0082] (10a)提供一含核酸分子的反应体系;
[0083] (10b)调控反应体系pH至pH = 10?14,从而使DNA进行变性;以及调控反应体 系的pH至pH = 5?8,从而使DNA进行复性;
[0084] 其中,所述上述变性-复性过程可循环进行。
[0085] 在另一优选例中,所述变性-复性过程可重复至少2个循环,较佳地至少10个循 环,更佳地至少20个循环,最佳地至少30个循环。
[0086] 在另一优选例中,所述反应体系的pH调控通过电化学方法实现。
[0087] 应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0088] 图1为实施例1中DNA经过强酸和强碱作用后与正常DNA对比的电泳图。
[0089] 图2为实施例2中大豆Lectin DNA序列在不同pH值条件下进行变性、复性和扩 增30个循环后的电泳图对比。
[0090] 图3为实施例3中不同复性pH值下酸碱法扩增DNA的电泳图对比。
[0091] 图4为实施例4中大豆Lectin基因在BR缓冲液中的变性、复性最佳时间测试电 泳检测结果。
[0092] 图5为实施例5中电化学-微流控芯片示意图。
[0093] 图6为实施例6中电化学工作站-DNA反应芯片控制电压与溶液pH值之间的关系。
[0094] 图7为实施例6中电化学工作站-DNA反应控制芯片中,一次扩增的显示示意图。
[0095] 图8为实施例7中大豆Lectin基因电化学工作站-DNA反应控制芯片扩增产物的 酶切检测电泳图。
[0096] 图9为实施例6中经过电化学工作站-DNA反应控制芯片扩增的大豆LectinDNA 序列与常规PCR产物对比的电泳图示。
[0097] 图10为实施例8中人类基因组6号染色体基因片段的电化学工作站-DNA反应控 制芯片法扩增的琼脂糖电泳检测图。
【具体实施方式】
[0098] 本发明人经过长期而深入的研究,意外地发现,通过调整扩增体系的pH值,不仅 能够有效地使双链核酸分子进行变性和复性,并且上述变性-复性过程是基本可逆的,因 而可循环多次进行。该特性特别适用开发基于酸碱调节法进行核酸扩增的技术,即通过扩 增体系的酸碱度改变来调控核酸的变性-复性,从而有效地进行核酸扩增。基于上述发现, 本发明人完成了本发明。
[0099] 术语
[0100] 如本文所用,术语"PCR反应"指聚合酶链式反应。
[0101] 如本文所用,术语"引物"指在一定条件下可作为DNA合成(启动)起始点的核苷 酸,其中在该条件下,与核酸链互补的引物延伸产物的合成在核酸模板上得到诱导,即在四 种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下、在适当的缓冲 液和适合的温度下。引物优选为单链DNA分子。引物的适当长度一般为15-40个核苷酸。 引物不需要反映模板的确切序列,因此,通过改变结合(反应)温度,类似的靶分子组可作 为合成(一致扩增子)的模板。为使它可与固相结合以及为了其它目的,具有化学特征的 基团可连接至引物寡核苷酸。引物序列可使用引物序列设计软件,如使用Primet5. 0进行 设计。特别地,在本发明中,需控制引物片段中CG含量不要太高,因为CG碱基较难被打断。 [0102] 术语"BR缓冲液"指伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液,所述缓冲液是 由磷酸、硼酸、醋酸的混合液添加不同量的氢氧化钠组成。可以向混合液中加入不同量的氢 氧化钠,以组成pH值由1到14的缓冲液调节对。一种优选的Britton-Robinson缓冲溶液 (H3P0 4-HAc-H3B03)用0. 04mol/L磷酸、硼酸和醋酸配制,使用时用0. 2mol/LNa0H溶液在酸 度计上调至所需pH值。
[0103] 酸碱法扩增测试
[0104] 本发明提供了一种通过调整体系酸碱度使双链核酸变性-复性的方法,所述方法 包括如下步骤:
[0105] 一种对核酸分子进行变性-复性的方法,包括:
[0106] 调控反应体系pH = 10?14使DNA进行变性;
[0107] 调控反应体系pH = 5?8使DNA进行复性;
[0108] 且上述变性-复性过程可循环进行。
[0109] 在另一优选例中,所述变性-复性过程可重复至少2个循环,较佳地至少10个循 环,更佳地至少20个循环,最佳地至少30个循环。
[0110] 本发明的实验表明,一定pH值的酸碱溶液不仅导致DNA发生解链和复性,而且该 过程是可逆的。
[0111] 酸碱法扩增核酸
[0112] 本发明提供了一种通过调整反应体系的酸碱度来进行核酸扩增的方法,具体地包 括以下步骤:
[0113] (la)变性步骤:在ρΗΙΟ-14的碱性条件下,使得扩增体系中的双链核酸分子解 链;
[0114] (lb)复性和延伸步骤:在pH5_8的中性和近中性条件下,使得扩增体系中的单链 核酸分子与引物进行复性,和在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核酸分子的引物进行 延伸,形成扩增的双链核酸分子。
[0115] 在另一优选例中,所述方法包括重复上述步骤(a)、(b)至少15?60次,较佳地 20?45次。
[0116] 在另一优选例中,在步骤(a)、和/或(b)中,反应温度为10?70°C;较佳地,反应 温度为15?45°C。
[0117] 在另一优选例中,在整个扩增过程中,扩增体系的温度维持在10?70°C ;较佳地, 15 ?45°C。
[0118] 在另一优选例中,步骤(a)中所述pH较佳为11. 5-12. 5。
[0119] 在另一优选例中,步骤(b)中所述pH较佳为6. 5-7. 5。
[0120] 各步骤中,时间的优选范围如下:步骤(a) > 20秒,步骤(b) > 60秒。
[0121] 步骤(a)较佳的20-120S,更佳25-80s,最佳35-60s ;步骤(b)较佳的60-300S,更 佳60-150S,最佳100-150S。优选地,在首次变性时反应较长的时间,以确保解链完全。
[0122] 所述的核酸分子可以是任何双链的核酸分子,包括DNA、RNA、或DNA-RNA杂合分 子。
[0123] 所述的扩增体系还可以包括其他扩增所需的原料,如dNTP、引物、聚合酶等。较佳 地,所述扩增体系含有待扩增DNA、dNTP、引物、聚合酶和镁离子。
[0124] 在扩增过程中,可以对所述的扩增体系的pH值进行跟踪,以检测扩增的进行程 度。可以通过常规方法测定体系pH值,如添加指示剂、使用电化学法等。在另一优选例中, 所述的步骤(a)和/或(b)中,还包括通过电化学法测定扩增体系的电位,从而测得扩增体 系的pH值。
[0125] 在另一优选例中,在步骤(a)和/或(b)中,通过添加碱性溶液或酸性溶液来调节 扩增体系的pH值。在另一优选例中,所述的步骤(a)和/或(b)中,还包括通过电化学法 调节扩增体系的电位,从而调节扩增体系的pH值。
[0126] 在另一优选例中,所述的扩增核酸的方法为聚合酶链反应方法(PCR)。
[0127] PCR 反应
[0128] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技 术,用于放大特定的DNA片段。
[0129] PCR技术由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成,常规的PCR是利用DNA在体 外95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对结合,再调温度至72度左右DNA聚合 酶沿着磷酸到五碳糖(5' -3')的方向合成互补链。模板DNA经加热至93°C左右一定时 间后,使模板DNA)双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结 合;模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55°C左右,引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合;DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模 板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链, 重复循环变性-退火-延伸循环过程就可获得更多的"半保留复制链"。
[0130] 用于核酸扩增的变性与复性过程要求模板核酸在每次变性、复性和扩增中具有相 当的准确性和稳定性,因而要求核酸的变性和复性过程是可逆的或基本可逆的。
[0131] 本发明提供的PCR技术利用一定pH值的酸碱溶液代替加热升温等过程,使DNA的 构象产生影响,达到使DNA分子变性与复性的效果。
[0132] 由于体系pH值的改变较之温度变化更为迅速和方便,因此,使用本发明的PCR技 术可以大大提高PCR反应的效率。在本发明的优选例中,单个PCR循环仅需1?2分钟,t匕 传统技术中的单个PCR循环所需时间减少了将近3/4。
[0133] 电化学工作站的使用,可以在十秒时间内使反应溶液的酸碱度准确达到所需要的 区间,从而进一步缩短了反应周期所需的时间,且重复性高,反应效果好。
[0134] 在另一优选例中,本发明的PCR反应包括步骤:
[0135] (la)变性步骤:在ρΗΙΟ-14的碱性条件下,使得扩增体系中的双链核酸分子解 链;
[0136] (lb)复性和延伸步骤:在pH5_8的中性和近中性条件下,使得扩增体系中的单链 核酸分子与引物进行复性,和在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核酸分子的引物进行 延伸,形成扩增的双链核酸分子。
[0137] 本发明依据电化学工作站的这一特性,对不同片段大小的DNA进行了扩增测试, 其结果与常规PCR扩增结果完全一致。但是本发明提供的电化学PCR的反应时间仅有40 分钟,比常规PCR减少了将近四分之三的时间。
[0138] 在本发明中,适用的聚合酶具有特别限制,可以是各种市售的或用常规方法制备 的核酸聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于):大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段 (DNA聚合酶I大片段)、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶、DNA聚合酶a、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ、Taq DNA聚合 酶、Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Bca Best DNA聚合酶、Sac DNA聚 合酶、IproofDNA 聚合酶、KOD DNA 聚合酶、Phusion DNA 聚合酶、UlltraPF? DNA 聚合酶、LA Tag DNA 聚合酶、Super Tag DNA 聚合酶。
[0139] 在本发明中,特别优选的聚合酶是能够耐受或基本耐受变性和复性的pH波动的 聚合酶。当然,如果聚合酶的pH耐受性较差,那么可以采用较为温和的pH条件,或者在扩 增过程中补加聚合酶。
[0140] 优选地,每个PCR反应循环加入1-10U酶(国际标准单位)即可。
[0141] 一般而言,酶加入量会大大过量,并取决于反应体积。较佳地,酶液的体积不能超 过反应体积的10%。
[0142] 在另一优选例中,在循环过程中,加入体积小的、高浓度的酶以保证反应体系的规 模维持基本恒定。
[0143] 电化学工作站(通过电位调节pH的方法)
[0144] 本发明基于电化学工作站和微流控芯片的联用,通过改变芯片上工作电极与参比 电极之间电位差的方法产生相应的电流,引起DNA反应液的电解质产生相应程度分解,弓丨 起pH值变化。具体而言,由于DNA溶液中存在大量电解质,可以在外加电场的作用下产生水 解效应,释放出酸碱离子。微流控芯片包含有Ag/AgCl电极(工作电极)和Ir0 2电极(参 比电极),以及含有DNA反应液的响应区(R区)和含有电解质溶液的控制区(C区)。工作 电极和C区相连,而参比电极和R区相连。C区和R区之间用1 %琼脂糖进行半封闭式连接, 即电流可以通过琼脂糖,而两个区中的溶液互不相通。
[0145] 当电化学工作站和微流控芯片通过导线连通之后,首先使用开路电位法测定工作 电极和参比电极在条件要求pH值环境下的电位差。之后在电化学工作站中设定该电位差, 产生相应的反馈电流。一旦微流控芯片的工作电极和参比电极之间形成电位差,则相应的 电流产生,引起电化学工作站产生较大的反馈电流,引起工作电极的电解水反应,C区产生 电解离子。相应的,基于电荷平衡原理,R区DNA所处的溶液中的pH值发生相反的变化,导 致DNA的构象发生改变。
[0146] 电化学-微流控芯片装置的示意图如附图5所示。
[0147] 核酸扩增设备
[0148] 本发明的核酸扩增设备包括:
[0149] (3i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置,所述容器用于容纳进行核酸扩增 反应的扩增体系;
[0150] (3ii)碱性溶液添加装置,所述碱性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加碱性 溶液,从而调节扩增体系的PH至碱性条件;
[0151] (3iii)酸性溶液添加装置,所述酸性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加酸性 溶液,从而调节扩增体系的PH至酸性条件;
[0152] (3 i v) pH测量装置,所述的pH测量装置用于精确控制体系pH值。
[0153] 在另一优选例中,所述的(i)?(iv)中的一个或多个包括在电化学工作站内。
[0154] 所述的用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置可以是任何合适的装置,如培养 瓶、离心管等,较佳地,所述的装置为DNA反应芯片。
[0155] 所述的pH测量装置可以是任何现有技术中能够提供的装置,包括:指示剂、酸度 计、pH电位计等。较佳地,所述的装置是通过电化学方法测量体系pH值。
[0156] 所述的设备还可以包括其他必需的装置,如聚合酶添加装置,以便于在扩增过程 中对体系添加聚合酶。
[0157] 更佳地,所述设备是电化学工作站-DNA反应控制芯片系统,包括:
[0158] (4i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的扩增装置,其中所述容器用于容纳进行 核酸扩增反应的扩增体系;
[0159] (4ii)电化学工作站,所述电化学工作站用于调控及检测反应体系的pH值。
[0160] 在另一优选例中,所述的扩增装置包括微流控芯片、DNA反应芯片、enpidoff管、 培养瓶。
[0161] 在另一优选例中,所述电化学工作站与装置之间通过导线相互连接。
[0162] 在另一优选例中,所述电化学工作站通过对体系施加预设的电压使扩增体系达到 所需pH值。
[0163] 在本发明的一个优选例中,使用上述的电化学工作站-DNA反应控制芯片系统对 DNA片段的扩增包括下列工作步骤:
[0164] (1)将DNA反应芯片的Ag/AgCl导线与电化学工作站的工作电极连接,其中,Ir02 导线与参比电极连接,Ir导线与对电极连接。
[0165] (2)配置一系列pH值从1到13的Britton-Robinson(BR)缓冲溶液,依次滴加到 芯片反应区,逐渐改变反应区的pH值。
[0166] (3)用开路电位的电化学方法测定Ir02电极与Ag/AgCl电极之间的电位差,测定 电位差和溶液pH值的相关曲线。
[0167] (4)将待扩增DNA模板加 NDNA芯片反应区,再依次加入引物、各种碱基、镁离子、 DNA聚合酶I。选用DNA聚合酶I作为扩增酶的原则基于整个电化学扩增反应在常温下进 行,而常温条件下的DNA聚合酶I使用成本低于Taq酶。
[0168] (5)依据Ir02电极pH相关曲线的数据,给工作电极施加相应的特定电位,实现对 特定pH值的快速调控以及稳定,使pH值在7和12两个位点间不断变换,从而控制pH敏感 的DNA进行扩增。
[0169] (6)控制电化学工作站向反应区调控pH值为12,保持45秒,之后恢复到pH= 7 的状态保持45秒,同时加入新的DNA聚合酶I。如此为一个循环,一共进行30个循环。
[0170] (7)循环终产物与常规PCR产物一起进行电泳检测。
[0171] (8)除了电泳检测,电化学工作站-DNA反应控制芯片扩增产物进行测序,且用限 制性内切酶对产物特定位点进行酶切检测。
[0172] 经电泳检测可知:电化学工作站-DNA反应控制芯片对DNA具有快速、高效、准确的 扩增。
[0173] 核酸检测方法
[0174] 本发明还提供了一种核酸的检测方法,所述方法包括:
[0175] 用本发明所述的方法,对待测核酸进行扩增,并对扩增后的核酸进行检测。
[0176] 所述的扩增后的核酸可以用任何现有技术的常用方法进行检测,如用电泳法对扩 增后的核酸进行检测。在另一优选例中,在检测前,用限制性内切酶对产物进行酶切,然后 用于后续检测。
[0177] 本发明的主要优点包括:
[0178] (a)本发明方法可以在常温下进行核酸扩增,无需进行加热-冷却的循环过程,电 能消耗量少,节能环保。
[0179] (b)由于温度变化是一个缓慢的过程,所以传统PCR技术的整个PCR的反应时间至 少需要2小时。使用电化学工作站可以在十秒时间内使反应溶液的酸碱度准确达到所需要 的区间,大大提高了效率,电化学PCR的反应时间仅有40分钟,比常规PCR减少了将近四分 之三的时间。因此,基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA技术是PCR反应技术 的又一次突破性创新。
[0180] (c)本发明对不同片段大小的DNA进行了扩增测试,其结果与常规PCR扩增结果完 全一致,方法重复性高,反应效果好。
[0181] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条 件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
[0182] 实施例1DNA变性-复性循环实验
[0183] 1.1设计方案
[0184] 本实施例用于测试酸碱法扩增实验下核酸变复性的可逆性。具体而言,本实施例 将DNA随机序列在pH = 14的碱性溶液中经过不同时间的变性处理,以使DNA双链解离;随 后在pH = 7的中性溶液中经过不同时间的复性处理,以使双链重新形成。
[0185] 对该过程中不同阶段的DNA样本进行电泳并分析。
[0186] 作为对照,如仅使用pH = 14的碱性溶液进行变性处理,未经过pH = 0的酸性溶 液中和进行复性处理的DNA片段电泳后无任何条带产生,则说明经过强碱处理的DNA样品 由于双键处于解离状态,不能在凝胶中形成可见条带。
[0187] 如经过变性和复性的DNA片段与未进行任何处理的相同DNA片段在电泳中处于同 一位置,则说明经过强碱处理后复性的DNA未遭到破坏,酸碱处理能够使DNA产生可逆的变 性与复性。
[0188] 若经过变性和复性的DNA(包括经过二次变性的DNA)与作为正对照的未变性DNA 在电泳中处于同一位置,条带清晰度基本一致;与此同时,没有经过复性的DNA则无任何条 带产生,就说明经过强酸和强碱变化后DNA未遭到破坏;而只经过强碱处理的DNA样品由于 双键处于断开状态,不能再凝胶中形成可见条带。进而能够说明酸碱能够使DNA产生可逆 的变性与复性。
[0189] 1.2实验步骤
[0190] 将5 μ g大豆LectinDNA使用pH值为14的NaOH溶液35 μ 1溶解,将溶液平均分 为7份,每份5 μ 1。将7份溶液分别做如下处理:
[0191] (1)3分钟后,加入pH值为0的HC1溶液5μ 1处理90秒,之后加入100%冰乙醇 沉淀DNA ;
[0192] (2)3分钟后,加入100 %冰乙醇沉淀DNA ;
[0193] (3)2分钟后,加入pH值为0的HC1溶液5μ 1处理90秒,之后加入100%冰乙醇 沉淀DNA ;
[0194] (4) 2分钟后,加入pH值为0的HC1溶液5 μ 1处理90秒,之后再加入pH值为14 的NaOH溶液5 μ 1,之后加入100%冰乙醇沉淀DNA ;
[0195] (5) 1分钟后,加入pH值为0的HC1溶液5μ 1处理90秒,之后加入100%冰乙醇 沉淀DNA ;
[0196] (6) 1分钟后,加入100 %冰乙醇沉淀DNA ;
[0197] (7) 30秒后加入pH值为0的HC1溶液5 μ 1处理90秒,之后加入100%冰乙醇沉 淀 DNA,,
[0198] 处理完毕后,用1 %琼脂糖电泳检测各个处理样品。检测结果如图1所示,图1中, 条带1?7依次为上述样品1-7号,8号条带为正对照,即未经任何处理的该DNA片段。
[0199] 表1实施例1的变性-复性时间表
[0200]
【权利要求】
1. 一种扩增核酸的方法,其特征在于,所述方法包括: (la) 变性步骤:在ρΗΙΟ-14的碱性条件下,使得扩增体系中的双链核酸分子解链; (lb) 复性和延伸步骤:在pH5-8的中性和近中性条件下,使得扩增体系中的单链核酸 分子与引物进行复性,和在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸, 形成扩增的双链核酸分子。
2. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的核酸聚合酶为具有DNA聚合酶活性的 酶类,较佳地,所述的核酸聚合酶包括:大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段(DNA聚合酶I 大片段)、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、 DNA聚合酶a、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚 合酶、pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Bca Best DNA聚合酶、Sac DNA聚合酶、Iproof DNA 聚合酶、KOD DNA 聚合酶、Phusion DNA 聚合酶、UlltraPF?DNA 聚合酶、LATag DNA 聚合 酶、Super Tag DNA 聚合酶。
3. -种扩增核酸的设备,其特征在于,所述设备包括: (3i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置,所述容器用于容纳进行核酸扩增反应 的扩增体系; (3ii)碱性溶液添加装置,所述碱性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加碱性溶液, 从而调节扩增体系的PH至碱性条件; (3iii)酸性溶液添加装置,所述酸性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加酸性溶 液,从而调节扩增体系的PH至酸性或中性条件; (3iv) pH测量装置,所述的pH测量装置用于精确控制体系pH值。
4. 一种扩增核酸的设备,其特征在于,所述设备包括: (4i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的扩增装置,其中,所述容器用于容纳进行核 酸扩增反应的扩增体系; (4ii)电化学工作站,所述电化学工作站用于调控及检测反应体系的pH值。
5. 如权利要求4所述的设备,其特征在于,所述的扩增装置为微流控芯片。
6. -种扩增核酸的方法,其特征在于,所述方法包括: (1) 提供一扩增体系,所述扩增体系包括待扩增DNA模板、引物、dNTP、镁离子、和聚合 酶;和 (2) 通过电化学方法,调整扩增体系的pH值,从而实现核酸分子的变性和复性,并进行 核酸扩增。
7. 如权利要求6所述的扩增核酸的方法,其特征在于,所述方法包括: 在步骤⑴中,提供如权利要求4所述的扩增核酸的设备,并将待扩增DNA模板、引物、 dNTP、镁离子、聚合酶加入所述设备中的扩增装置中,构成扩增体系;和 在步骤(2)中,所述的电化学方法是使用电化学工作站。
8. -种应用电化学的方法扩增核酸的方法,其特征在于,所述方法包括选自下组的一 个或多个步骤: 在扩增溶液体系中测定电学参数和溶液pH的关系; 设定电学参数,通过溶液电化学反应将pH控制在10-14的碱性条件,使得扩增体系中 的双链核酸分子解链; 设定电学参数,通过溶液电化学反应将pH控制在5-8的中性和近中性条件,使得扩增 体系中的单链核酸分子与引物进行复性,并在核酸聚合酶存在下,使结合于的单链核酸分 子的引物进行延伸,形成扩增的双链核酸分子。
9. 一种核酸的检测方法,其特征在于,包括: 用如权利要求1、6或8所述的方法,对待测核酸进行扩增;和 对扩增后的核酸进行检测。
10. -种对核酸分子进行变性-复性的方法,其特征在于,包括: (l〇a)提供一含核酸分子的反应体系; (l〇b)调控反应体系pH至pH=10?14,从而使DNA进行变性;以及调控反应体系的pH 至pH=5?8,从而使DNA进行复性; 其中,所述上述变性-复性过程可循环进行。
【文档编号】C12N15/10GK104232615SQ201310231925
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】张一 , 刘刚, 黄庆, 樊春海 申请人:中国科学院上海应用物理研究所