一种高效发酵生产l-色氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效发酵生产L-色氨酸的方法。通过对发酵设备进行改造、发酵培养基配方与发酵工艺进行优化，解决了现行生产工艺中发酵单位不高、发酵周期较短的问题。本发明包括：对现有设备的补糖系统进行改造，由单一管道变为使糖在发酵液中快速均匀分布的糖分布组件；对发酵培养基中各组分的比例进行了优化调整；发酵过程中，通过调节搅拌转速和空气流量将溶解氧控制在一定水平，通过流加高浓度氨水控制pH值，并通过流加糖(包括葡萄糖和液糖)将残糖含量控制在0.1％以下，培养至40～60h结束。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，延长了发酵周期，降低了劳动强度，大幅度的提高了发酵单位，降低了生产成本。
【专利说明】一种高效发酵生产L-色氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种L-色氨酸的生产方法，具体说，是涉及一种以高产率制备高效发酵的L-氨基酸生产方法。
【背景技术】
[0002]L-色氨酸的生产方法先后经历了蛋白质水解法、化学合成法和微生物法三种方法，其中微生物法又包括直接发酵法、微生物转化法和酶法。随着基因组学和代谢组学研究的不断深入，人们将重组DNA技术应用在微生物育种和酶工业上，从而极大地推动了直接发酵法和酶法生产L-色氨酸的工业化进程。直接发酵法原材料简单、成本低、质量好、环保处理费用低，具有较大的优势。目前国内外的众多科研院所和企业纷纷利用这类技术提高L-色氨酸的发酵水平，完成了一系列基因工程菌的构建，大大提高了发酵单位。例如，日本协和发酵的Ikeda等人利用申请专利的基因工程重组菌生产L-色氨酸，专利号:US5447857。其菌种产能达到35.2g/L发酵液(2升罐小试)，放大后发酵单位达到66g/L。
[0003]目前，L-色氨酸发酵企业大多采用分批补料发酵方式。这种方式对发酵液中残留葡萄糖浓度控制和补入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求较高。残留葡萄糖浓度若要控制的不当，就会影响到菌体的正常代谢，使菌体的代谢途径发生变化，严重影响L-色氨酸的发酵水平和产量，甚至会导致无L-色氨酸产生。补入糖的分散程度也会影响到L-色氨酸发酵水平，现有设备由于只使用单一的管道进料，就使得糖在发酵液中不能迅速均匀分布，造成局部浓度过高，引起此处菌体代谢异常，产生对菌体生成色氨酸不利的代谢产物，同时发酵液中得不到糖的菌体产生L-色氨酸能力受限。所以，残糖的控制水平和糖能否在发酵液中快速均匀分布对L-色氨酸的发酵水平起着至关重要的作用。
[0004]培养基中营养物质对菌体的生长和代谢产物的产生起着决定作用。现行L-色氨酸发酵培养基中各组分限制了 L-色氨酸产生菌株的生长和L-色氨酸发酵水平的进一步提闻。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有生产工艺中发酵单位偏低、发酵周期较短、成本较高的问题，通过对发酵设备进行改造、发酵培养基配方与发酵工艺进行优化，从而发明了一种高效发酵生产L-色氨酸的方法。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，延长了发酵周期，降低了劳动强度，大幅度的提高了发酵单位，降低了生产成本。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案来实现:
[0007]一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，包括种子培养和采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养的生产过程。
[0008]补入糖可以为口服葡萄糖，也可以为液糖，本发明中涉及的葡萄糖均可以用相同葡萄糖含量的液糖代替。
[0009]作为一种优选方案，所述的种子培养过程包括如下步骤:[0010]配制种子培养基，将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1~5% v/v，在罐温20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于500~2000L种子罐中培养至对数生长期的末期，600nm吸光度值10~30，制得种子液。
[0011]作为进一步优选方案，所述种子培养基配方为:葡萄糖2.0~5.0 %，磷酸氢二钠0.2~L 5%，蛋白胨0.1~L 0%，氯化镁0.1~L 0%，柠檬酸三钠0.10~0.50%，硫酸亚铁0.0001~0.001%，硫酸锰0.0001~0.001%,以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。
[0012]作为一种优选方案，所述的采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布以进行高效发酵培养生产过程包括如下步骤:
[0013]a)配制发酵培养基；
[0014]b)制得的种子液以1.0~20% v/v的接种量接种发酵罐进行发酵；
[0015]c)发酵过程中通过调节发酵罐的搅拌转速和空气流量将溶解氧控制在一定的水平上；
[0016]d)用氨水将pH自动控制在6.5~7.5 ;
[0017]e)流加葡萄糖含量60~70% w/v (重量体积百分比)的糖并采用糖分布组件,使补入的糖快速在发酵罐中分布均匀，并将残留葡萄糖控制在0.1% w/v(重量体积百分比)以下；
[0018]f)全部发酵进行到40~60h结束。
[0019]作为进一步优选方案，所述发酵过程中发酵罐培养温度为20~40°C，罐压0.02~0.06MPa,空气流量1: 0.5~1: L 5vvm，搅拌转速70~lOOrpm。
[0020]作为进一步优选方案，所述发酵过程中溶解氧控制方法为:在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速和空气流量将溶氧控制在40%以上，溶解氧回升后按照固定的时间间隔提高搅拌转速(以10~12rpm的速率提高)或空气流量(最高提高到1: 1.5vvm)，同时提高补糖速率，发酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之间，13h~结束培养溶解氧控制在30%~50%之间。
[0021]作为进一步优选方案，所述发酵过程中残留葡萄糖控制方法为:从发酵接种开始，每隔4h取样，采用葡萄糖测定仪对发酵罐发酵过程中发酵液中的残留葡萄糖进行测定，该测定仪使用具有高度专一性的葡萄糖氧化酶膜，根据测定结果确定合适的补糖速率，高于0.1%则降低补糖速率，低于0.1%则增加补糖速率，从而将发酵液中残留葡萄糖控制在0.1 % w/v 以下。
[0022]作为进一步优选方案，为实施本方法专门设计了一种L-色氨酸发酵补糖装置，主要包括发酵罐本体、糖输送主管道和至少一个糖分布组件，其中所述糖输送主管道位于发酵罐本体上方，从外向内穿入发酵罐本体内，其中所述糖分布组件活动连接在糖输送主管道的末端，贯穿所述发酵罐本体内部。
[0023]作为更进一步优选方案，所述糖分布组件主要由糖输送分管道和其末端做成环形的多孔分布管构成，所述糖输送分管道上端活动连接糖输送主管道的末端；所述多孔分布管管体上和末端设有出料孔，管体上出料孔呈不均匀分布，工作时糖会依次通过糖输送主管道，输送分管道，多孔分布管的出料孔进入发酵罐中，使糖在发酵罐中均匀分布。
[0024]作为进一步优选方案，所述多孔分布管上出料孔呈不均匀分布的方式为距离糖输送分管道越远，设置越密。
[0025]作为进一步优选方案，所述糖输送主管道与糖输送分管道的活动连接为卡环连接。
[0026]作为进一步优选方案，所述糖输送主管道上活动连接有蒸汽灭菌管道，蒸汽可以通过该管道直接进至糖输送主管道和分布组件。
[0027]作为进一步优选方案，发酵罐培养基配方为:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氢二钠0.5 %~2.5 %，蛋白胨0.15 %~0.5 %，柠檬酸0.2 %~0.5 %，硫酸锰0.00045 %~0.0009%，硫酸亚铁0.002%~0.02%，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。
[0028]作为进一步优选方案，所述发酵过程中补入糖包括葡萄糖和液糖。
[0029]与现有工艺相比，本发明具有如下优点:
[0030]1.本发明通过设计添加糖分布组件，使补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过大和产生“葡萄糖效应”的问题，使整个过程不至于产生葡萄糖抑制和过多的副产物乙酸；同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题。
[0031]2.本发明采用葡萄糖测定仪对发酵液中的残糖进行测定。该测定仪使用的是葡萄糖氧化酶膜，具有高度的专一性，提高了发酵液中残糖含量的准确性，更有利于发酵工艺的调整和控制。
[0032]3.在溶氧回升前，通过调整搅拌转速或者空气流量，将溶氧维持在较高的水平，溶解氧回升后按固定时间间隔调整搅拌转速或者空气流量，同时增加补糖速率，在发酵前期(O~12h)和发酵后期(13h~培养结束)将溶解氧控制在不同的水平，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控。
[0033]4.本发明与现有生产工艺相比不增加任何额外设备和人力投入的情况下，稳定了种子罐的生长周期，延长了发酵罐的发酵周期，延长20h左右，降低了劳动强度，大幅度的提高了发酵单位(4m3发酵罐:47g/L左右，36m3发酵罐36g/L左右)，降低了生产成本，整个工艺过程得到简化，十分适合于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】:
[0034]图1为本发明设计的L-色氨酸发酵补糖装置示意图，
[0035]图中数字和字母所表示的相应部件名称:
[0036]1.发酵罐，2.糖输送主管道，3.糖输送分管道，4.糖输送管道的蒸汽灭菌管道，
5.多孔分布管,6.出料孔,7.阀门,8.卡环(3.糖输送分管道和5.多孔分布管构成糖分布组件)
【具体实施方式】:
[0037]本发明实施例使用的工程菌为大肠杆菌菌株W3110trpEFBK，为利用市售菌株构建的L-色氨酸生产菌，构建方法详见CN201110400855专利。
[0038]本发明实施例中使用的化学及生物试剂均为分析纯或分析纯级别以上。
[0039]实施例1[0040]种子培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化镁0.1 %，柠檬酸三钠0.10%，硫酸亚铁0.001%，硫酸锰0.0001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.5。[0041 ] 发酵培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠0.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.2%，硫酸锰0.0009 %，硫酸亚铁0.02%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至6.5，灭菌后用高浓度氨水将PH调至6.5。[0042]将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1% v/v，在罐温33°C、pH6.5、罐压0.06MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按1.0% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温33°C，罐压0.06MPa，空气流量1: 0.5vvm,搅拌转速70rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速，每次提高12rpm，并且提高空气流量，每次提高1: 0.25丽1，将溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提闻12rpm的揽祥转速，最闻转速不超过180rpm,并且提闻空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，将溶解氧控制在40%~60%之间。自动流加高浓度氨水将PH控制在6.5，通过流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至42h结束。[0043]本实施例L-色氨酸的产量为29g/L。[0044]实施例2[0045]种子培养基:葡萄糖2.0%，磷酸氢二钠0.2 %，蛋白胨1.0 %，氯化镁0.1 %，柠檬酸三钠0.10%，硫酸亚铁0.001%，硫酸锰0.0001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为7.5。[0046]发酵培养基:葡萄糖0.5 %，磷酸氢二钠0.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.5%，硫酸锰0.0009 %，硫酸亚铁0.02%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至7.5，灭菌后用高浓度氨水将PH调至7.5。[0047]将菌种接入种子培养基中，接种量为5.0% v/v，在罐温38°C、pH6.5、罐压0.05MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按15% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温28°C，罐压0.05MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速70rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速，每次提高12rpm，并且提高空气流量，每次提高1: 0.25vvm，将溶氧控制在40%以上。溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高12rpm的搅拌转速,最高转速不超过220rpm,并且提高空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，将溶解氧控制在40%~60%之间。自动流加高浓度氨水将PH控制在7.5，通过流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至42h结束。[0048]本实施例L-色氨酸的产量为30g/L。[0049]实施例3[0050]种子培养基:葡萄糖2.5 %，磷酸氢二钠1.5 %，蛋白胨0.5 %，氯化镁0.5%，柠檬酸三钠0.50%，硫酸亚铁0.0001%，硫酸锰0.001%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为6.8。[0051]发酵培养基:葡萄糖5.0%，磷酸氢二钠1.5%，蛋白胨0.15%，柠檬酸0.2%，硫酸锰0.00045 %，硫酸亚铁0.002 %，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至6.8，灭菌后用高浓度氨水将pH调至6.8。
[0052]将菌种接入种子培养基中，接种量为3.0% v/v，在罐温30°C、pH6.8、罐压0.04MPa和溶解氧60%以上的条件下于1000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按15% v/v的接种量接入4m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温30°C，罐压
0.04MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速80rpm，在溶解氧回升前，调整搅拌转速溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高12rpm的搅拌转速,最高转速不超过220rpm,并且提高空气流量，最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，在O~12h时将溶解氧控制在40%~60%之间，在13h~培养结束将溶解氧控制在30%~50%之间，在发酵进行到40h时降低动力条件。自动流加高浓度氨水将PH控制在6.8，通过糖分布组件流加葡萄糖含量为60~70 %的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至60h结束发酵。
[0053]本实施例L-色氨酸的产量为47g/L。
[0054]实施例4
[0055]种子培养基:葡萄糖3.0%，磷酸氢二钠0.85%，蛋白胨0.1 %，氯化镁1.0%，柠檬酸三钠0.20%，硫酸亚铁0.0005%，硫酸锰0.0007%，以上均为重量百分比，灭菌前NaOH调节pH值为7.0。
[0056]发酵培养基:葡萄糖2.0%，磷酸氢二钠2.5 %，蛋白胨0.5 %，柠檬酸0.3%，硫酸锰0.0006 %，硫酸亚铁0.01%，以上均为重量百分比，灭菌前用NaOH将pH调至7.0，灭菌后用高浓度氨水将PH调至7.0。
[0057]将菌种接入种子培养基中，接种量为5.0% v/v，在罐温33°C、pH6.5、罐压0.03MPa和溶解氧60%以上的条件下于2000L的种子罐中培养16~17h，600nm吸光度值10~30时，按20% v/v的接种量接入36m3的发酵罐中，采用如下工艺进行控制:罐温37°C，罐压
`0.03MPa，空气流量1: lvvm，搅拌转速lOOrpm，在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速(每次提高IOrpm)和空气流量(每次提高1: 0.15vvm)将溶氧控制在40~60%之间，溶解氧回升后按照固定时间间隔每次提高IOrpm的搅拌转速(最高150rpm)或空气流量(最高提高到1: 1.25vvm)，同时提高补糖速率，在O~12h时将溶解氧控制在40%~60%之间，在13h~培养结束将溶解氧控制在30%~50%之间，在发酵进行到40h时降低动力条件。自动流加高浓度氨水将PH控制在7.0，通过糖分布组件流加葡萄糖含量为60~70%的糖，将残糖控制在0.1 %以下，发酵至60h结束。
[0058]本实施例L-色氨酸的产量为36g/L。
[0059]上面对本发明实施方式进行了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
【权利要求】
1.一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，包括种子培养和采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养的生产过程。
2.根据权利要求1所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述的种子培养过程包括如下步骤:配制种子培养基，将菌种接入种子培养基中，接种量为0.1~5.0%，在罐温20~40°C，pH6.5~7.5，溶解氧60%以上于种子罐中培养至对数生长期的末期，600nm吸光度值10~30，制得种子液。
3.根据权利要求2所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于所述种子培养基配方为:葡萄糖2.0~5.0%，磷酸氢二钠0.2~1.5%，蛋白胨0.1~1.0%，氯化镁0.1~1.0%，柠檬酸三钠0.10~0.50%，硫酸亚铁0.0001~0.001%，硫酸锰0.0001~0.001%，灭菌前NaOH调节pH值为6.5~7.5。
4.根据权利要求1所述生产L-色氨酸的方法，其特征在于，所述的采用L-色氨酸发酵补糖装置将补入糖均匀分布并进行高效发酵培养过程包括如下步骤: a)配制发酵培养基； b)将种子液以1.0~20% v/v的接种量接种发酵罐进行发酵； c)发酵过程中通过调节发酵罐的搅拌转速和空气流量将溶解氧控制在一定的水平范围； d)用氨水将pH自动控制在6.5~7.5 ; e)流加葡萄糖含量为60~70%w/v的糖并采用糖分布组件，使补入的糖快速在发酵液中分布均匀，并将残糖控制在0.1%以下； f)全部发酵进行到40~60h结束。
5.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述发酵过程中发酵罐培养温度为20~40°C，罐压0.02~0.06MPa,空气流量1: 0.5~1: 1.5vvm,搅拌转速70 ~lOOrpm。
6.根据根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述发酵过程中溶解氧控制方法为:在溶解氧回升前，通过调整搅拌转速和空气流量将溶氧控制在40%以上；溶解氧回升后按照固定的时间间隔以10~12rpm的速率提高搅拌转速，或者提高空气流量，但最高不超过1: 1.5vvm，同时提高补糖速率，从而使发酵罐O~12h溶解氧控制在40%~60%之间，13h~结束培养溶解氧控制在30%~50%之间。
7.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于所述残糖控制方法为:从发酵接种开始，每隔4h取样，采用葡萄糖测定仪对发酵罐发酵过程中发酵液中的残留葡萄糖进行测定，根据测定结果确定合适的补糖速率，高于0.1 %则降低补糖速率，低于0.1%则增加补糖速率从而将发酵液中残留葡萄糖控制在0.1% w/v以下。
8.为实施权利要求4所述生产L-色氨酸的方法而专门设计的一种L-色氨酸发酵补糖装置，主要包括发酵罐本体、糖输送主管道和至少一个糖分布组件，其中所述糖输送主管道位于发酵罐本体上方，从外向内穿入发酵罐本体内；所述糖分布组件活动连接在糖输送主管道的末端，贯穿所述发酵罐本体内部；所述糖分布组件主要由输送分管道和其末端做成环形的多孔分布管构成；所述输送分管道上端活动连接糖输送主管道的末端；所述多孔分布管管体上和末端均设有出料孔，管体上出料孔呈不均匀分布，工作时糖会依次通过糖输送主管道，输送分管道，多孔分布管的出料孔进入发酵罐中，使糖在发酵罐中均匀分布。
9.根据权利要求8所述的L-色氨酸发酵补糖装置，其特征在于:所述多孔分布管上的出料孔的不均匀分布方式为距离糖输送分管道越远，设置越密。
10.根据权利要求4所述的生产L-色氨酸的方法，其特征在于发酵罐培养基配方为:葡萄糖0.5%~5.0%，磷酸氢二钠0.5%~2.5%，蛋白胨0.15%~0.5%，柠檬酸0.2%~0.5%,硫酸锰0.00045%~0.0009%，硫酸亚铁0.002%~0.02%，灭菌前NaOH调节pH值为 6.5 ~7.5。
11.根据权利要求1所述的一种高效发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述补入糖包括葡 萄 糖和液糖。
【文档编号】C12M1/00GK103614428SQ201310259573
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】徐洪利, 左良成, 王文笙, 张建军, 赵斐, 田晓梅, 宋爱刚, 慕东 申请人:山东鲁抗医药股份有限公司