一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一株高产葡萄糖-6-乙酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-乙酸酯的方法。一种芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GXU-011，保藏号为:CGMCC?No.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址：中国科学院北京微生物研究所。以碳源、氮源、无机盐等有机营养素加以培养，得到反应液葡萄糖-6-乙酸酯；再经分离纯化后得到葡萄糖-6-乙酸酯。本发明所取得的技术进步在于：本发明与现有菌株ATCC10778相比，具有发酵时间短，工艺步骤简单，产量高，传代稳定性高的优点。
【专利说明】—株高产葡萄糖-6-こ酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-こ酸酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化工程领域，具体是ー株高产葡萄糖-6-こ酸酯的菌种及合成葡萄糖-6-こ酸酯的方法。
【背景技术】
[0002]本发明涉及利用生物发酵制备用于生产三氯蔗糖的关键中间体葡萄糖-6-こ酸酷。匍萄糖_6_こ酸酯是生广4，I’，6’ - ニ氯-4，I’ ,6，- ニ脱氧半乳鹿糖即ニ氯鹿糖的关键中间体。三氯蔗糖是蔗糖的氯衍生物，其甜度是蔗糖的600-800倍，其ロ感醇和、浓郁、稳定性能好、热量低，它可以和传统的甜味剂配合使用，也可以单独使用，其甜味ロ感不受影响，有利于消费者健康。葡萄糖-6-こ酸酯是合成三氯蔗糖的关键中间体。目前常用的葡萄糖-6-こ酸酯的生产方法是使用微生物发酵方法所得，所用菌种为ATCC10778，但该菌种产量不高、发酵时间长且传代稳定性差，不适于大規模エ业化生产。
【发明内容】
[0003]发明人为克服现有技术存在的发酵时间长达120h，最大产量仅为15g/L，且传代6代后产量降为4.8g/L等缺点，进行了广泛的研究。提供一株芽孢杆菌(Bacillussp.GXU-011)新菌种，该菌具有发酵时间短，产量高，传代稳定性高的优点。使用该菌作为发酵菌种发酵葡萄糖-6-こ酸酷，发酵时间仅为72h，最大产量达到31.71g/L，且传代稳定性高，分离纯化后纯度达92%以上，更适合于エ业生产。
[0004]本发明解决上述技术问题的技术方案是:
[0005]1.一株芽孢杆菌(Bac`illus sp.)GXU_011，保藏号为:CGMCC N0.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址:中国科学院北京微生物研究所。
[0006]2.芽孢杆菌GXU-Oll菌落特征和生理生化特征为:细胞形态为直杆状，无孢子形成，革兰氏染色为阳性；平板培养基中30°C培养36h，菌落直径为2-3mm，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，淡黄色，表面光滑。通过电镜扫描如图1所示，可以看出菌株Bacillussp.GXU-011无鞭毛，染色后未显示有荚膜存在。有接触酶反应；V-P实验阴性；能够利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸；明胶液化:缓慢；能够水解淀粉；能够利用柠檬酸盐；能够还原硝酸盐；不能利用丙ニ酸；最适生长温度为20-30°C。
[0007]3.芽孢杆菌GXU-Oll序列測定与系统发育树分析:
[0008]根据已知的16S rDNA上保守序列设计寡核苷酸引物:
[0009]Fff:5 ; -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 ; , RV:5 ; -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ;以GXU-Oll细菌基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增16S rDNA序列基因，16S rDNA的扩增反应程序:PCR反应程序设定为:先95°C预变性5min ;然后94°C变性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循环30个周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持lOmin。[0010]扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，結果正确则使用PCR产物纯化试剂盒纯化基因片段，再将其连入PMD18-T载体上，PCR验证后送出测序，所得到的测序結果与Genbank数据库中的序列进行比对，从而初歩鉴定菌株种属。利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[ClustelxQ.81)]，釆用邻位连接(Neighbour Joining, NJ)法进行系统学分析(MEGA)，确定了菌株GXU-Oll与其它几株Bacillus sp.菌株的系统发育树，如图2所不，结果显不菌种GXU-011的16S rDNA基因序列与GenBank中许多芽抱杆菌(Bacillussp.)的16S rDNA基因序列的同源性在99%以上，所以将菌种GXU-Oll命名为芽孢杆菌GXU-011(Bacillus sp.) ?
[0011]4.芽孢杆菌GXU-011，其特征在于所述的芽孢杆菌GXU-Oll的16Sri)NA序列为:
【权利要求】
1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)GXU-OlI，保藏号为:CGMCC N0.7031，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年12月24日，保藏地址:中国科学院北京微生物研究所。
2.如权利要求1的芽孢杆菌GXU-011，其特征在于，所述的芽胞杆菌GXU-Oll菌落特征和生理生化特征为:细胞形态为直杆状，无孢子形成，革兰氏染色为阳性；平板培养基中30°C培养36h，菌落直径为2-3mm，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，淡黄色，表面光滑。有接触酶反应；V_P实验阴性；能够利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸；明胶液化:缓慢；能够水解淀粉；能够利用柠檬酸盐；能够还原硝酸盐；不能利用丙ニ酸；最适生长温度为20-30°C。
3.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.) GXU-011,其特征在于，所述的芽孢杆菌GXU-Oll序列測定与系统发育树分析: 根据已知的16S rDNA上保守序列设计寡核苷酸引物:FW:5 ; -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 ; ,RV:5 ; -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ;以 GXU-011 细菌基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增16S rDNA序列基因，16S rDNA的扩增反应程序:PCR反应程序设定为:先95°C预变性5min ;然后94°C变性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循环30个周期；然后72 °C延伸IOmin ;最后4°C保持IOmin ； 扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果正确则使用PCR产物纯化试剂盒纯化基因片段，再将其连入PMD18-T载体上，PCR验证后送出测序，所得到的测序结果与Genbank数据库中的序列进行比对，从而初歩鉴定菌株种属。利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[ClustelxQ.81)],采用邻位连接(Neighbour Joining, NJ)法进行系统学分析(MEGA)，确定了菌株GXU-Oll与其它几株Bacillus sp.菌株的系统发育树，结果显示菌种GXU-Oll的16S rDNA基因序列与GenBank中许多芽孢杆菌(BaciIIus sp.)的16SrDNA基因序列的同源性在99 %以上，所以将菌种GXU-011命名为芽孢杆菌GXU-011 (Baci I Ius sp.)。
4.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.) GXU-011,其特征在于所述的芽胞杆菌GXU-Oll的16SrDNA序列为:
5.如权利要求1的芽孢杆菌GXU-011的培养方法，其特征在于:用权利要求1所述的芽孢杆菌GXU-Oll生产葡萄糖-6-こ酸酷，生产步骤如下: 1)将芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株GXU-011菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；エ艺条件为PH6.5~7.5、温度25~35°C、培养时间24~36小时； 2)将斜面菌株扩大培养作为种子液，所述种子液由以下重量份组分组成:葡萄糖20~60份、酵母粉I~4份、氯化钾0.5~2份、碳酸钙0.5~2份、磷酸氢二钾2~6份、磷酸二氢钾2~6份、硫酸镁2~6份和水1000份； 3)将种子液接入发酵罐中进行发酵: 所述发酵液由以下重量份组分组成:葡萄糖20~60份、酵母粉I~4份、氯化钾0.5~2份、碳酸钙0.5~2份、磷酸氢二钾2~6份、磷酸二氢钾2~6份、硫酸镁2~6份和水1000 份； 发酵的エ艺条件为发酵液接种量为5%~10%，pH值为6.5~7.5，培养温度25~35°C，搅拌速率为150~200转/分钟，发酵时间为48~72小时，得到葡萄糖_6_こ酸酯反应液； 4)将葡萄糖-6-こ酸酯的分离纯化，包括以下2个步骤: (I)将步骤3)葡萄糖-6-こ酸酯反应液经过硅胶柱进行分离纯化，所述硅胶柱为硅胶G柱；(2)把经过步骤(I)的发酵液真空干燥，真空干燥度为0.1Mpa，温度为65°C，即得淡黄色粉末纯度为92%的葡萄 糖-6-こ酸酷。
【文档编号】C12P19/02GK103451125SQ201310274299
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】李群良, 张欣, 邓子明 申请人:广西大学