河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明是一种用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其组成为：反应液A，1支，其组成为：10×Lampbuffer，dNTP，硫酸镁水溶液，甜菜碱水溶液，引物Vaes-F3、Vaes-B3、Vaes-FIP、Vaes-BIP，BstDNA酶，10×荧光染料SYBRGreenⅠ，阳性对照试样，阴性对照试样和超纯水。本发明还涉及应用该试剂盒进行检测的方法。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于水产养殖场现场快速检测。本发明方法解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂、需要复杂仪器等缺陷，为水产动物疾病检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对河口弧菌引起的疾病的现场检测的迫切需要。
【专利说明】河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水生动物病原河口弧菌的检测试剂盒，特别是一种用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒；本发明还涉及一种应用前述试剂盒进行检测的方法。
【背景技术】
[0002]河口弧菌(yibrio是由Tison等于1983年从海水、牡贩、蛤及蟹中首次分离并命名，该菌一直被认为是环境菌株，直到2006年Labreuche等将该菌活细胞和胞外产物注射牡蛎，揭示了其病原性。有记述该菌存在于波罗的海、西班牙及香港等多地海岸。2008年Garnier等报道该菌可引起太平洋牡贩Crassostrea gigas感染发病并造成大量死亡。2010年张晓君等对连云港市某半滑舌鳎养殖场所发生的细菌性疾病进行检验，病鱼主要症状为体表及鳍基出血，胃肠道出血，尾鳍腐烂，有腹水，个别病鱼肠道有白浊物，个别病鱼肠管脱出肛门外，发病池累积死亡率达到50%，经病原细菌学检验表明为河口弧菌感染。可见河口弧菌能够引起半滑舌鳎等海水养殖鱼类及牡蛎等贝类感染发病，制约了水产养殖业的发展。该菌传统的检验方法包括形态学检测、生理生化特征检测等，这些检测手段不仅工作量大，而且耗时长，不能满足水产养殖生产上的诊断要求。[0003]溶血素(hemolysin)是多数病原菌的重要致病因子之一，其分解破坏宿主组织成分，以利于病原菌进一步侵袭，破坏血细胞，导致溶血。目前已在杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌及河口弧菌等多种病原菌的胞外产物中检测到。编码溶血素的基因序列具有保守性和变异性，具设计PCR引物的保守区域，是种间鉴定及检测的良好分子祀标。环介导恒温扩增技术(LAMP, loop-mediated isothermalamplification)是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法,它具有很高的特异性和灵敏度，且反应在恒温下进行，快速简便，扩增产物量大，肉眼、电泳、浊度仪均可进行检测，不需昂贵的仪器。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其灵敏度高、特异性强、操作简便，在水产养殖动物处于带菌状态或大规模爆发河口弧菌引起的细菌性疾病之前能进行准确的检测。
[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种应用前述试剂盒进行检测的方法。
[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其特点是，其组成为:
(I)反应液A，I支，其体积百分比组成为:
①10XLampbuffer，14.9% ;其中 Lampbuffer 的组成为:200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，质量浓度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 为 8.8 ；
②dNTP, 13.5%，浓度为 IOmM ；
③硫酸镁水溶液，22%，浓度为25mM；④甜菜碱水溶液，22%，浓度为8mol/L；
⑤Vaes-F3，2.8%,浓度为 IOuM,
上游外部引物 Vaes-F3 为:GACC CAGC AACA GATT GG ；
⑥Vaes-B3，2.8%,浓度为 10uM，
下游外部引物 Vaes-B3 为:TCGT TAGT CCAG ATCG AATG ；
⑦Vaes-FIP，11%，浓度为 10uM，
上游内部引物 Vaes-FIP 为:ACAG ACGA CCAC CAGT AACC-GTGG GCAT TGGA TGAA CA;
⑧Vaes-BIP，11%，浓度为 IOuM,
下游内部引物 vh-BIP 为:ACAG CGTT GTGA AGAG ACAC T-CCTA TTGT CTGC TGCG AA;
(2)反应液B:8000U 的 Bst DNA 酶，I 支；
(3)反应液C:10X荧光染料SYBR Green I，1支；
(4)河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样，I支；
(5)健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，I支；
(6)超纯水，I支。
[0007]本发明还提供了一种河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法，其特点是，该方法应用了以上技术方案所述的试剂盒；其步骤如下:
(1)DNA抽提:取ImL待检样品增菌液12000 r/min离心Imin,弃上清,将菌体悬浮于100 V- L的灭菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷却后12000 r/min离心IOmin,取上清作为PCR模板DNA ；
(2)LAMP扩增:向反应管中加入反应液A18iiL，超纯水5 yL，模板DNA lyL，95°C水浴5min，冷却；再加入反应液B I yL;63°C孵育60 min，80°C灭活10 min;同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样；
(3)显色检测:再向反应管中加入反应液CIuL;观察显色结果，显绿色的为河口弧菌阳性，显粉色的为河口弧菌阴性。
[0008]本发明所涉及的病原河口弧菌(K/Ario aestuarianus ) TSl已经在公开文献((Molecular and phenotypic characterization of Vibrio aestuarianus, a pathogenof the cultured tongue sole, Cynoglossus semilaevis Gunther〉〉中所公开(菌株TSl),上述公开文献发表于《Journal of Fish Diseases》，2011, 34:57_64。菌株TSl的DNA序列长度及Genebank登录号见下表:
【权利要求】
1.一种用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的组成为: (1)反应液A，I支，其体积百分比组成为: ①10XLampbuffer，14.9% ;其中 Lampbuffer 的组成为:200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，质量浓度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 为 8.8 ；
②dNTP, 13.5%，浓度为 IOmM ； ③硫酸镁水溶液，22%，浓度为25mM； ④甜菜碱水溶液，22%，浓度为8mol/L； ⑤Vaes-F3，2.8%,浓度为 10uM， 上游外部引物 Vaes-F3 为:GACC CAGC AACA GATT GG ；
⑥Vaes-B3，2.8%,浓度为 10uM， 下游外部引物 Vaes-B3 为:TCGT TAGT CCAG ATCG AATG ； ⑦Vaes-FIP，11%，浓度为 10uM， 上游内部引物 Vaes-FIP 为:ACAG ACGA CCAC CAGT AACC-GTGG GCAT TGGA TGAA CA; ⑧Vaes-BIP，11%，浓度为 IOuM, 下游内部引物Vaes-BIP为:ACAG CGTT GTGA AGAG ACAC T-CCTA TTGT CTGC TGCG AA; (2)反应液B:8000U 的 Bst DNA 酶，I 支； (3)反应液C:10X荧光染料SYBR Green I，I支； (4)河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样，I支； (5)健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，I支； (6)超纯水，I支。
2.一种河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法，其特征在于，应用权利要求1所述的试剂盒；其步骤如下: (1)DNA抽提:取ImL待检样品增菌液12000 r/min离心Imin,弃上清,将菌体悬浮于.100 V- L的灭菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷却后12000 r/min离心IOmin,取上清作为PCR模板DNA ； (2)LAMP扩增:向反应管中加入反应液A18iiL，超纯水5 yL，模板DNA lyL，95°C水浴5min，冷却；再加入反应液B I u L ;63°C孵育60 min，80°C灭活10 min ;同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样； (3)显色检测:再向反应管中加入反应液CI y L ;观察显色结果，显绿色的为河口弧菌阳性，显粉色的为河口弧菌阴性。
【文档编号】C12Q1/68GK103614455SQ201310276906
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2013年7月3日
【发明者】张晓君, 徐加涛, 阎斌伦, 秦国民 申请人:淮海工学院