可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的弯曲乳杆菌r5及其新用途
【专利摘要】可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的弯曲乳杆菌R5及其新用途，属于食品科学／肉品科学【技术领域】。本发明所述弯曲乳杆菌R5保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其菌种保藏编号为：CGMCC?No.7739，保藏日期为2013年6月17日，菌种的分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus?curvatus)。它可以在MRS培养基中将棕色的高铁肌红蛋白转化生成红色的氧合肌红蛋白，从而为发酵法替代肉制品中亚硝酸盐的呈色作用提供一条可能的解决途径。
【专利说明】可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的弯曲乳杆菌R5及其新用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于食品科学/肉品科学【技术领域】，涉及一种弯曲乳杆菌R5及其可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白新用途。
【背景技术】
[0002]颜色是衡量肉和肉制品质量的重要标准之一。肉的颜色主要取决于其中肌红蛋白的含量以及其所处的状态。基态肌红蛋白(Myoglobin，Mb)(卟啉环中为Fe2+)并不结合任何亚基，而会与水分子结合。在氧气存在的条件下，肌红蛋白可以与I分子的氧分子结合，形成氧合肌红蛋白(Oxymyoglobin, MbO2),从而变成亮红色。此时,铁仍以二价铁离子(Fe2+)存在。但氧气和其他氧化剂，会将二价铁氧化为三价铁，最终形成高铁肌红蛋白(Metmyoglobin, Met-Mb),为棕色。基态肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白在肉中一般同时存在。长时间放置的肉中高铁肌红蛋白含量较高，呈现为棕黄色。
[0003]肉类腌制中添加亚硝酸盐可有助于其形成稳定的红色泽。亚硝酸盐之所以能在腌肉中起呈色作用，是因为它们能在酸性条件下形成亚硝酸。亚硝酸不稳定，在还原性物质存在时，发生歧化反应，转化生成一氧化氮(NO)。一氧化氮和肌红蛋白反应，最终生成亚硝基肌红蛋白(Nitrosylmyoglobin, NO-Mb)。
[0004]亚硝酸盐是目前肉品腌制的关键组分，其在肉制品中的作用主要有:抑制腐败微生物生长，延缓食品腐败，抗氧化，产生腌肉的特征风味，以及与肉中色素成分——肌红蛋白作用，产生亚硝基肌红蛋白，形成稳定的腌肉红色泽。其中，亚硝酸盐的呈色作用是其在肉制品中使用的重要原因。但由于其自身毒性和潜在致癌性，其应用受到限制。因此，人们迫切需要一种新的方法来替代肉制品中的亚硝酸盐的使用。
【发明内容】
`[0005]微生物发酵法替代肉制品中的亚硝酸盐是一个全新的研究领域，本发明的目的是提供一株可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的弯曲乳杆菌R5 (Lactobaci I Iuscurvatus R5)，它可以在MRS培养基中将棕色的高铁肌红蛋白转化生成红色的氧合肌红蛋白，从而为发酵法替代肉制品中亚硝酸盐的呈色作用提供一条可能的解决途径。
[0006]本发明的弯曲乳杆菌R5 (Lactobacillus curvatus R5)为从发酵风干肠中提取并分离鉴定的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.7739，保藏日期为2013年6月17日，菌种的分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)。
[0007]本发明中的弯曲乳杆菌R5具有以下生物学特性:
[0008](I)形态特征:弯曲乳杆菌R5革兰氏染色结果为阳性，弯曲杆状，成短链状排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。
[0009](2)菌落特征:弯曲乳杆菌R5在MRS固体培养基上生长良好，菌落形态为白色、凸起、圆形，边缘光滑细密，直径约2~3_。在液体培养基中均匀混浊生长。
[0010]本发明的弯曲乳杆菌R5具备转化棕色高铁肌红蛋白生成亮红色氧合肌红蛋白的能力，该菌株具备在肉 中呈色的潜力，可以替代其中亚硝酸盐的使用。从而，利用该弯曲乳杆菌发酵，可以替代肉制品中亚硝酸盐的呈色作用，减少其使用量，降低产品可能的致癌性。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为接种弯曲乳杆菌R5对高铁肌红蛋白-MRS体系颜色变化的影响；
[0012]图2为接种弯曲乳杆菌R5对高铁肌红蛋白-MRS体系350~700nm处光谱图的影响；
[0013]图3为接种弯曲乳杆菌R5对高铁肌红蛋白-MRS体系450~700nm处光谱图的影响；
[0014]图4为接种弯曲乳杆菌R5对高铁肌红蛋白-MRS体系ESR光谱图的影响。【具体实施方式】
[0015]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0016]一、弯曲乳杆菌R5的分离及培养
[0017](一)、风干肠制作
[0018]⑴配料
[0019]猪瘦肉4.5kg，肥肉(猪背脂)0.5kg，麯酒(玉泉大麯)0.15kg，葡萄糖0.25kg，味素0.075kg，盐0.125kg，混合调料0.025kg(混合调料包括:丁香，肉桂，白芷，草果等)。
[0020](2)工艺流程
[0021]原料肉(剔除淋巴，筋腱，血管等结缔组织)一腌制一绞肉(瘦肉绞碎，肥肉切丁)一加调味料一拌馅一灌制一发酵风干(25°C，湿度75% )—成品。
[0022]( 二)、风干肠中弯曲乳杆菌R5的分离及培养
[0023]取发酵6d后的发酵风干肠,经无菌剥去肠衣后,剪碎研磨,称取5.0g放入45.0mL生理盐水中，充分摇匀，在4°C下平衡20min。取上述液体1.0mL注入装有9.0mL灭菌生理盐水的试管中，涂布于MRS固体培养基上。重复上述步骤直至可在MRS固体培养基上形成单独的菌落。用肉眼观察菌落形态，选取菌落形态相同的优势菌进行分离。对挑选出来的菌落在MRS固体培养基上反复平板划线培养，直到得到纯菌落进行鉴定。将分离得到的弯曲乳杆菌R5纯菌落转移到MRS液体培养中进行培养，连续传代三次，使其活菌数达到IO9CFU/
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[0024]二、弯曲乳杆菌R5的应用
[0025](一)、试验设计
[0026]将肌红蛋白溶解在pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液中，配置成20mg/mL的溶液。加热30min以除去残留可能降解高铁肌红的酶类，4°C条件下，10，OOOg离心lmin，除去变性的蛋白质。4°C放置7d后得到高铁肌红蛋白溶液。将高铁肌红蛋白溶液使用0.45 μ m滤膜过滤灭菌后，加入到MRS (Man Rogosa and Sharp)液体培养基中，使最终高铁肌红蛋白浓度为2mg/mL。将弯曲乳杆菌R5接种到该培养基中，使其终浓度为107CFU/mL。37°C厌氧培养12h后，通过离心除去菌细胞。通过色差计对其颜色变化进行测定，并测定培养基体系紫外/可见(UV-Vis)吸收光谱和电子自选共振光谱(ESR)，鉴定其中肌红蛋白存在状态。
[0027](二)、MRS(Man Rogosa and Sharp)培养基配方
[0028]蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母提取物5.0g，葡萄糖2.0g,乙酸钠5.0g,柠檬酸铵2.0g,吐温801.0mL,磷酸氢二钾2.0g,七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,蒸馏水1000mL, pH6.5 ~6.8。
[0029](三)、色差测定
[0030]液体模拟体系颜色测定选用色差计透射模式(transmittance mode),仪器经自检及零点、标准(L* = 95.26, a* = -0.89,b* = 1.18)校正后,试样装满2mm比色杯后置于液体载样台上进行测定。
[0031](四)、紫外-可见(UV-Vis)光谱扫描
[0032]不同肌红蛋白衍生物的UV-Vis吸收光谱不同。通过光谱扫描可对肌红蛋白的转化情况进行鉴定和转化过程跟踪。利用紫外-可见分光光度计对所制得的样品进行光谱扫描，以培养基调整系统基线，扫描范围为350~700nm，扫描间隔为lnm。
[0033](五)、电子自旋共振(ESR)测定
[0034]电子自旋共振技术(ESR)可用以孤对电子分析，而NO分子中含有孤对电子，因此，利用ESR技术，可以区分氧合肌红蛋白(MbO2)和亚硝基肌红蛋白(NO-Mb)两种红色肌红蛋白衍生物。ESR测定方法如下:取大约0.3mL样品，直接吸入到ESR毛细管中，浸入液氮中迅速冷却。使用装配有低温样品池的Bruker ECS106电子自旋共振仪进行测定，测定参数如下:调制频率IOOkHz ;调制幅度1.0mT ;微波功率2.0mff ;微波频率9.44GHz ;温度150K ;响应时间30s。需要注意的是，进行ESR测定时，MRS培养基中不可添加顺磁性物质硫酸锰。
[0035](六)、结果与分析
[0036]将弯曲乳杆菌R5接种到MRS液体培养基中，同时做空白对照，厌氧条件下37°C培养12h，测定其色差值和光谱变化情况。
[0037]通过视觉，可以很清晰的观察到，经过12h培养，接种弯曲乳杆菌R5的高铁肌红蛋白-MRS体系呈现亮红色，而对照组则呈现棕色泽。采用透射色差对模拟体系颜色进行定量分析，如图1所示，弯曲乳杆菌R5组的a*_值(红度值)显著高于对照组(P <0.05)，这表明该组样品要“更红”一些；而其L*-值(亮度值)较另两组较低，但差异并不显著(P>
0.05)。各组的b*_值(黄度值)之间亦没有显著区别。由此说明，弯曲乳杆菌R5具有转化棕色高铁肌红蛋白生成红色肌红蛋白衍生物的能力。
[0038]同时，对各处理组进行UV-Vis光谱扫描，结果如图2和图3所示。由图可知，空白对照组在410、505和635nm处有特征吸收峰，这是高铁肌红蛋白的特征；而接种弯曲乳杆菌R5组的吸收光谱曲线发生变化，在420、540和580nm处出现了特征吸收峰，这正是红色肌红蛋白衍生物的典型图谱。红色肌红蛋白衍生物分为氧合肌红蛋白(MbO2)和亚硝基肌红蛋白(NO-Mb)两种。由于二者的吸收曲线和特征峰值很接近，所以很难仅仅通过这一种指标对其进行区分。
[0039]由图4可知，接种弯曲乳杆菌R5体系和对照组体系ESR信号显示为不存在顺磁性物质，这表明二者体系中不存在一氧化氮分子。这表明该株弯曲乳杆菌可以将高铁肌红蛋白转化为氧合肌红蛋白，这为微生物发酵法替代亚硝酸盐提供了一条可能途径。
【权利要求】
1.可转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)R5, CGMCC N0.7739。
2.权利要求1所述弯曲乳杆菌R5转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的新用途。
3.根据权利要求2所述的弯曲乳杆菌R5转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的新用途，其特征在于所述弯曲乳杆菌R5在MRS培养基中将高铁肌红蛋白转化生成氧合肌红蛋白。
4.根据权利要求2所述的弯曲乳杆菌R5转化高铁肌红蛋白生成氧合肌红蛋白的新用途，其特征在于所述MRS培养基配方为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g,葡萄糖2.0g,乙酸钠5.0g,柠檬酸铵2.0g,吐温801.0mL,磷酸氢二钾2.0g,七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰 0.05g，蒸馏水 1000mL, ρΗ6.5 ~6.8。
【文档编号】C12N1/20GK103555605SQ201310282268
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年7月5日 优先权日:2013年7月5日
【发明者】孔保华, 李沛军, 陈倩, 夏秀芳 申请人:东北农业大学